나노 입자 독성 테스트를위한 쿠퍼 세포 격리

다음 실험의 전반적인 목표는 나노 입자 독성을 연구하기 위해 많은 수의 세포에 대해 마우스 컵을 분리하고 정제하는 것입니다. 이는 쥐의 간을 H-B-S-S-E-G-T-A 용액과 콜라겐(간 조직을 부드럽게 소화시키는 용액)으로 관류함으로써 달성됩니다. 다음으로 간 세포는 밀도, 원심분리 및 선택적 접착에 의해 정제되어 세포용 정제된 컵 배양을 얻습니다.

그런 다음 세포에 대한 cup의 순도 및 F 산성 특성을 확인하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 기능화된 탄소 나노 튜브 독성을 세포용 컵에서 측정할 수 있음을 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 수정된 L-D-H-S-A를 기반으로 이 모델을 나노 입자 독성 테스트에 적용할 수 있습니다.

우리가 오늘 당신에게 보여주는 것을 작정인 방법은 최근에 개발된 약 운반대의 독성 평가와 같은 nano 독성학 분야에 있는 중요한 질문에 응답하는 것을 도울 수 있습니다, 이용된 불멸화한 세포주의 대부분이, 유래된 조직과 현저하게 다른 재산을 보여주기 때문에 이것은 확실히 중요합니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 이 방법이 성공적으로 수행되면 높은 수율과 순도의 ke 세포를 얻을 수 있으며, 이는 다양한 나노 입자에서 해당 독성을 스크리닝하는 모델로 사용할 수 있습니다.

함께 제공되는 텍스트 프로토콜과 함께 있는 재료 및 시약표에 나열된 모든 시약을 새로 준비한 후 E-G-T-A-H-B-S-S 용액과 콜라겐분해효소 용액을 섭씨 40도에서 30분 동안 예열하고 70% 에탄올을 사용하여 펌프 플렉시블 튜브를 헹굽니다. 그런 다음 수조에 잠긴 원심분리기 튜브에 40ml의 E-G-T-A-H-B-S-S 용액을 붓고 예열 E-G-T-A-H-B-S-S를 사용하여 펌프 플렉시블 튜브를 헹굽니다. CD one 마우스를 안락사시킨 후 텍스트 프로토콜에 따라 복부 털을 면도하고 70% 에탄올을 사용하여 복부 표면을 소독합니다.

발가락 꼬집기로 마취를 확인합니다. 복강을 절단하고 장을 복부 왼쪽으로 측면으로 이동하여 문맥과 하대정맥을 노출시킵니다. E-G-T-A-H-B-S-S 용액과 23 게이지 버터플라이 바늘로 문맥 캐뉼레이트를 사용하여 분당 1-3밀리리터의 속도로 펌프를 시작하십시오.amp 문맥의 캐뉼레이션 부분을 고정한 다음 열린 마우스 복부 표면에서 사인 집게를 뒤집습니다.

관류 후 첫 30초 이내에 간이 창백해지고, 하대정맥의 하부를 빠르게 절개하여 간에 과도한 압력이 형성되는 것을 방지하고, 관류 첫 1분 동안 유속을 분당 7ml로 점차 증가시켜야 합니다. 원심분리기 튜브에 E-G-T-A-H-B-S-S 용액이 5ml 미만으로 남아 있는 경우. 용액에 40-50밀리리터의 콜라겐을 첨가한 다음 30초에 걸쳐 분당 10밀리리터로 유속을 점차적으로 높입니다.

핀셋을 사용하여 10-32번째 간격으로 주기적으로 하대정맥에 압력을 가하여 간을 부풀게 합니다. 이렇게 하면 세포 해리가 개선되고 콜라겐분해효소로 관류 시간이 단축됩니다. 원심분리기 튜브 내에 10ml 미만의 콜라겐분해효소 용액이 남아 있는 경우, 40-50ml의 예열 콜라겐분해효소 용액을 튜브에 추가로 첨가합니다.

그런 다음 70-80밀리리터가 관류되면 집게를 사용하여 표면에 가벼운 압력을 가합니다. 함몰 표시는 간 세포가 해리되었음을 나타냅니다. 복강에서 간을 한 조각으로 제거하고 세포 분리를 위해 20-30ml의 컵이 들어 있는 원심분리 튜브에 넣습니다. 보통.

간 세포를 최대 3시간 동안 얼음 위에 두고, 세포를 정화하기 위해 최대 3개의 간을 고입니다. 세포 분리를 위해 15ml의 컵과 함께 페트리 접시에 관류된 간 하나를 넣고 가위나 핀셋으로 중간에 놓습니다. 반짝이는 캡슐을 파열시키고 모든 간 세포를 배지로 방출합니다.

100마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 용액을 원심분리기 튜브로 여과합니다. 그런 다음 50GS에서 섭씨 4도에서 2분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 실질 세포는 펠릿에 있고 비실질 세포는 상층액에 있습니다.

깨끗한 원심분리기 튜브에 상층액을 넣고 50gs에서 2분 동안 원심분리기합니다. 총 4번의 전송 및 스핀에 대해 반복합니다. 다음 원심분리기.

1, 350 GS에서 15 분 동안. 비실질 세포를 펠렛화하려면 상층을 버리고 세포 분리 배지를 위해 10ml의 컵에 펠릿을 재현탁하고, 텍스트 프로토콜에 따라 이전에 준비한 불연속 25 50% 등장성 구배에 비실질 세포 용액을 추가하고 가속 또는 중단 없이 15분 동안 850GS에서 원심분리합니다. 10 ml의 혈청학적 피펫을 사용하여 25 50%SIP 인터페이스에 가까운 25%SIP 분획 내에서 혼탁하게 보이는 세포 분획에 대해 약 12 ml의 농축 컵을 흡입합니다.

세포 격리를 위한 컵의 35 40 밀리리터를 포함하는 분리기 관으로 세포를 옮기고, 매체를 만들고 부드럽게 그 후에 1, 350 GS 및 4 섭씨 온도에 분리기를 섞어 세포를 펠릿 지명된 폐기하고 hemo cytometer를 가진 세포를 재현탁시키기 위하여 prewarm 매체의 5개에서 10 밀리리터를 사용합니다. 세포를 세고 trian blue 염색을 사용하여 생존력 플레이트를 측정합니다. 24개의 웰 플레이트에 있는 정제된 비실질 세포는 웰당 5번째 세포에 10의 5배의 밀도로 플레이트를 생성합니다.

섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 매체를 부드럽게 제거합니다. 예열 HBSS를 사용하여 세포를 세척하고 세포 배양 배지를 위한 새로운 예열 컵당 500마이크로리터로 교체합니다.

나노 입자로 처리하기 전에 세포가 부착될 수 있도록 최소 4시간 동안 세포를 섭씨 37도로 되돌립니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 기능화된 탄소 나노튜브 또는 fcts로 세포와 배양에 대한 C의 순도 및 식세포 활성을 특성화한 후 상등액을 버리고 웰당 200마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. 섭씨 37도에서 30-60분 동안 배양하고, 격렬한 피펫팅을 수행하고, 마이크로 원심분리기 튜브에 세포를 담은 컵을 수집합니다.

다음 20, 세포 파편에 세포에 의해 채택된 fcn ts를 꺼내기 위하여 10 분 동안 000 GS에 분리기를 설치하십시오. 상층액을 마이크로 원심분리기 튜브에 모아 섭씨 영하 20도의 온도에서 보관합니다. 또는 50마이크로리터를 96웰 플레이트로 옮기고 젖산 탈수소효소 키트에서 동일한 부피의 기질 혼합 용액을 추가합니다.

50마이크로리터의 용해 완충액과 50마이크로리터의 기질 혼합 용액을 포함하는 3개의 블랭크 웰을 포함합니다. 그런 다음 플레이트를 덮고 실온에서 15분 동안 배양한 후 50마이크로리터의 정지 용액을 추가합니다. 마지막으로, 마이크로플레이트 리더에서 490나노미터에서 흡광도를 읽고 다음 공식을 사용하여 퍼센트 세포 생존율을 계산합니다.

이 그림은 정제된 비실질 세포의 수가 마우스와 트라이안당 6개의 세포에 8 및 14 곱하기 10 사이임을 보여줍니다. 블루 염색은 약 95%의 세포 생존율을 보여주었습니다. 세포용 접착 컵은 배양 30분 이내에 둥근 모양을 채택하고 4시간 후에는 여기에서 볼 수 있듯이 세포가 퍼지고 클러스터가 형성되기 시작했습니다.

세포를 F 4 80 항체로 염색하여 세포 순도에 대한 컵을 입증했으며, 이는 유세포 분석으로 95% 이상으로 측정되었습니다. 또한, 배양 12시간 후, 저세포 분석 결과, 세포의 85%가 1마이크로미터 형광 비드를 흡수할 수 있는 능력으로 PHA 산성 활성을 할 수 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 이 수치는 배양에서 72시간 만에 떨어졌으며 여기에 표시된 세포의 40%만이 식세포였습니다.

24시간 및 72시간 동안 기능화된 탄소 나노튜브로 배양된 세포용 컵은 미접촉 세포와 비교하여 유사한 형태를 가졌습니다. 대조적으로, 양성 대조군으로 사용된 10% DMSO로 배양한 세포에 대한 컵은 24시간 동안 10% DMSO로 처리된 세포에 대한 변형된 LDH 분석 컵을 분석한 후 괴사 형태를 보였고, 이에 비해 72시간 동안 10% DMSO로 처리된 세포에 대한 변형된 LDH 분석 컵은 높은 독성을 보였으며, fcts는 세포가 72시간 동안 밀리리터당 50마이크로그램에 노출되었을 때만 세포 생존율의 경미하지만 유의한 감소를 유도했습니다. 이 방법에 따라 다른 세포 기반 SC 및 모든 유형의 나노 입자를 분리된 ke 세포를 사용하여 테스트할 수 있습니다.

이를 통해 동물의 사용을 최소화하면서 신뢰할 수 있는 데이터를 수집할 수 있습니다. 우리는 이 기술이 나노 기술 심리학 분야의 연구자들이 점점 더 개발되고 있는 많은 유망한 나노 운반체의 안전성을 선별하는 방법을 찾는 데 도움이 되기를 바랍니다.