설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

이 절차의 전반적인 목표는 설치류의 Q 해마 절편을 사용하여 CA one 초금속 뉴런에서 장기적인 가소성과 시냅스 태깅, 캡처 및 교차 태깅과 같은 연관 과정을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 뇌를 해부하고 해마를 차가운 산소가 공급된 인공 대뇌 척수액으로 신속하게 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 수동 조직 슬라이서를 사용하여 급성 해마 절편을 준비하고 계면 챔버에서 배양

다음으로, 두 개의 자극 전극과 두 개의 기록 전극을 CA 한 영역에 배치하여 두 개의 시냅스 입력에서 필드 EPSP 및 집단 스파이크 반응을 기록합니다. 마지막 단계는 특정 시간 창 내에서 한 번의 시냅스 입력에서 일시적인 형태의 가소성을 유도하고 다른 입력에서 지속적인 형태의 가소성을 유도하는 것입니다. 궁극적으로, 두 입력의 필드 EPSP 응답은 시냅스 태깅 캡처 및 교차 캡처 메커니즘을 조사하기 위해 연장된 기간 동안 기록됩니다.

시냅스 태깅 및 캡처는 특정 기간 내에 단기 기억이 장기 기억으로 어떻게 변환되는지에 대한 개념적 기초를 제공합니다. 이 방법의 시각적 시연은 실험 단계가 여러 시냅스 입력의 자극 및 기록을 포함하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 Mahesh Shira, 마체테 및 maima Sharma 대학원생입니다.

이 절차를 시작하려면 CSF를 준비하고 산소 95%와 이산화탄소 5%로 거품을 냅니다. 계면 챔버의 바닥을 용량의 약 70%까지 증류수로 채웁니다. 그런 다음 섭씨 32도로 사전 설정된 온도 컨트롤러를 켭니다.

다음으로, 분당 1밀리리터의 유속으로 A CSF로 전환하기 전에 높은 유속으로 유입 튜브를 통해 증류수를 통과시켜 상부 챔버를 10-15분 동안 세척합니다. 그런 다음 상부 챔버에 그물을 놓아 슬라이스를 위한 휴식 표면을 제공합니다. 하부 챔버에서 탄화를 시작하고, 지속적으로 발암제인 A CSF에 유입 튜브를 담그십시오.

A CSF가 탄수화물로 포화되고 상부 챔버를 채울 때까지 20분 동안 기다립니다. 이 단계에서는 티슈 다지기에 면도날을 장착하고 절단면이 균일하게 정렬되었는지 확인합니다. 작은 여과지를 잘라 블레이드가 단단히 고정되었는지 확인합니다.

그런 다음 슬라이딩 버니어 마이크로미터를 시작 위치로 설정합니다. 이제 안락사된 쥐의 머리를 얻고 홍채 가위를 사용하여 뒤쪽 두개골을 잘라 뇌간을 제거합니다. 그런 다음 두개골의 오른쪽을 따라 작게 절개하고 왼쪽을 길게 절개합니다.

뼈 UR로 두개골의 왼쪽에서 시작하여 두개골의 오른쪽으로 이동하여 두개골을 조심스럽게 제거합니다. 피질과 그것을 덮고 있는 얇은 경막층을 드러내려면 얇은 주걱으로 경막을 조심스럽게 제거한 다음 뼈가 있는 전두판을 제거합니다. 그 후, 주걱의 평평한 끝으로 피질과 소뇌 사이의 접합부에 남아있는 경막을 특별히 제거하고 압력을 위쪽으로 유지하여 뇌 손상을 방지합니다.

주걱을 사용하여 차갑고 탄산이 함유된 A CSF로 채워진 알루미늄 냉각 블록의 페트리 접시에 뇌를 부드럽게 떠서 11번 메스를 사용하여 해마를 분리하고, 소뇌를 제거하기 위해 직선 절단을 한 다음 뇌 앞쪽의 1/4을 제거하기 위해 또 다른 절단을 만듭니다. 그런 다음 정중선을 따라 얕은 시상 절단을 만듭니다. 정중선에서 시작합니다.

낫 스케일러로 피질을 조심스럽게 제거하여 등쪽 해마를 드러냅니다. 그런 다음 해마 위의 피질층을 제거한다. 해마 위원회를 작게 자릅니다.

낫 스케일러로 구르는 동작을 사용하여 등 끝에서 시작하여 해마를 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 겸상 스케일러의 구부러진 끝을 사용하여 분리된 해마 주변의 모든 피질과 결합 조직을 제거합니다. 해마 조직을 자르려면 CSF에 적신 30mm 와트만 여과지 조각을 슬라이싱 s에 놓습니다.tag수동 슬라이서의 es.

해마 조직을 여과지에 옮깁니다. 낫 스칼러의 평평한 끝을 사용하여 여과지를 움직여 슬라이서의 날과 관련하여 적절한 방향으로 해마를 정렬하여 해마가 fia에 대해 약 70도 각도로 절단되도록 합니다. 다음으로, 해마 조직을 둘러싼 과도한 용액을 닦아냅니다.

접힌 여과지로 해마를 가로로 자르고 절편 형태가 명확하지 않은 해마의 맨 끝에 있는 조직을 버립니다. 그런 다음 모든 슬라이싱 라운드 후에 버니어 마이크로미터를 조정하여 나머지 조직을 400미크론 두께의 조각으로 자릅니다. 각 절단 후 부드러운 강모가 있는 브러시를 사용하여 칼날에서 차가운 탄산 A CSF로 채워진 작은 비커로 슬라이스를 부드럽게 옮깁니다.

그런 다음 깨끗한 플라스틱 피펫을 사용하여 슬라이스 챔버의 그물로 슬라이스를 부드럽게 옮깁니다. 넓은 팁을 사용하여 전극 위치 및 기록 검사를 용이하게 하는 방식으로 슬라이스의 위치를 조심스럽게 조정하여 슬라이스가 A CSF 층으로 충분히 둘러싸여 있지만 완전히 잠기지 않았는지 확인합니다. 그 후, 챔버를 덮고 시냅스 태깅 및 캡처 실험에서 2-3시간 동안 슬라이스를 배양합니다.

현미경 아래에서 두 개의 자극 전극을 CA 한 영역의 방사선 층 원자에 배치하여 Schaffer 측부 섬유를 자극하고, 전극을 기록할 때 자극 전극 사이의 중간에 있는 ca 1의 정점 수지상 영역에 전극을 배치합니다. F-E-P-S-P 반응을 기록하려면 parid층에 다른 기록 전극을 배치합니다. 인구 급증을 기록하기 위한 DO 레이어.

모든 전극이 슬라이스에 닿을 때 테스트 자극을 전달하여 두 입력 모두에서 적절한 필드 EPSP 신호를 얻을 수 있는지 확인합니다. 적절한 F-E-P-S-P 신호가 얻어지면 매니퓰레이터의 미세한 이동 손잡이를 사용하여 전극을 약 200미크론 더 조심스럽게 내립니다. 그런 다음 슬라이스가 회복될 때까지 20분 동안 기다립니다.

그런 다음 20마이크로암페어에서 100마이크로암페어까지의 전류 강도 범위에서 자기장 EPSP의 기울기를 측정하여 입력 출력 관계를 결정합니다. 그런 다음 각 입력에 대해 최대 필드 EPSP 기울기의 40%를 실험 전반에 걸쳐 일정한 자극으로 유발하는 자극 강도를 설정합니다. 15분에서 20분 후, 하나의 입력에서 L-T-P-L-T-D 유도 전에 최소 30-60분의 안정적인 기준선 기록을 기준선 기록을 기록하기 시작하고, 단일 고주파 자극으로 구성된 약한 테틴 프로토콜을 사용하여 조기 LTP를 유도합니다.

다른 입력은 초기 LTP 유도 후 30분 후에도 기준선을 계속 기록하는 반면, 10분의 기차 간 간격으로 반복되는 고주파 자극을 포함하는 강력한 테틴 프로토콜을 사용하여 입력 S 2에서 후기 LTP를 유도합니다. 그런 다음 시냅스 태깅 및 캡처에 의해 입력 S 1에서 후기 LTP로의 초기 LTP의 변환을 나타내기 위해 확장된 기간에 대한 필드 EPSP 응답을 기록합니다. 마찬가지로, 교차 캡처 실험에서 15분 동안 900버스트로 구성된 강력한 저주파 자극 프로토콜을 사용하여 먼저 조기 LTP를 유도하고 한 입력을 유도한 다음 30분 후에 다른 입력에서 후기 LTD 유도

그런 다음 확장된 기간 동안 필드 EPSP 응답을 기록하여 입력 S 1의 초기 LTP에서 교차 캡처에 의한 후기 LTP로의 변환을 나타냅니다. 이 표현에서, 두 개의 자극 전극이 CA 한 영역의 방사선 층 원자에 위치하여 두 개의 독립적이지만 중복되는 시냅스 입력을 자극합니다. CA에 하나의 초금속 뉴런, 두 개의 세포 외 기록 전극.

하나는 정점 수지상 구획에서 F-E-P-S-P를 기록하는 것입니다. 그리고 다른 하나는 초금속 세포체에서 체세포 개체군 급증을 기록하기 위해 각각 방사선 원자층과 파라 층에 위치합니다. 이 그림은 시냅스 태깅 및 캡처를 연구하기 위한 강력한 패러다임이 있기 전 주를 보여줍니다.

S 1에 약한 테틴을 투여하여 조기 LTP를 유도하고, 30분에 S 2에 강한 테틴을 투여하여 후기 LTP를 유도하는데, 이 수치는 크로스 태깅을 연구하기 위한 강력한 패러다임 전 주를 보여줍니다. 초기 LTP는 S 1에서 약한 테틴에 의해 유도된 후 S 2에서 강력한 저주파 자극 프로토콜을 사용하여 후기 LTD에 의해 유도됩니다. S one에서 30분이 지나면 초기 LTP가 6시간 동안 지속되는 후기 LTP로 변환되어 교차 태깅 및 캡처를 보여줍니다.

일단 숙달되면 이 해부 및 슬라이스 준비 기술은 3분에서 5분 이내에 매우 빠르게 수행할 수 있습니다. 따라서 슬라이스의 생존 가능성은 장기 녹음을 위해 보존될 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 시냅스 태깅 및 캡처 과정에 대한 다양한 약리학적 제제의 효과를 테스트할 수도 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 장기적인 기능적 가소성 실험을 수행하는 방법과 시냅스 태깅 및 캡처 과정을 잘 이해하게 될 것입니다.