설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

이 실험 절차의 전반적인 목표는 설치류의 해마 슬라이스를 사용하여 CA1 피라미드 뉴런에서의 장기 가소성과 시냅스 태깅, 캡처 및 교차 태깅과 같은 연합 과정들을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 뇌를 해부하고 차가운 산소 공급 인공 뇌척수액으로 해마를 빠르게 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 수동 조직 절단기를 사용하여 급성 해마 슬라이스를 준비하고 이를 인터페이스 챔버에서 배양하는 것입니다.

다음으로 두 개의 자극 전극과 두 개의 기록 전극을 CA1 영역에 배치하여 두 개의 시냅스 입력으로부터 필드 EPSP 및 모집 스파이크(population spike) 반응을 기록합니다. 마지막 단계는 특정 시간 창 내에서 하나의 시냅스 입력에는 일시적인 형태의 가소성을, 다른 입력에는 지속적인 형태의 가소성을 유도하는 것입니다. 최종적으로, 두 입력 모두에서 필드 EPSP 반응을 장시간 기록하여 시냅스 태깅 캡처(synaptic tagging capture) 및 교차 캡처(cross capture) 메커니즘을 조사합니다.

시냅스 태깅 및 캡처(Synaptic tagging and capture)는 특정 시간 범위 내에서 단기 기억이 어떻게 장기 기억으로 전환되는지에 대한 개념적 기초를 제공합니다. 이 방법은 여러 시냅스 입력으로부터의 자극과 기록을 포함하므로 실험 단계를 학습하기 어렵기 때문에, 이에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 실험 절차의 시연은 본 연구실의 대학원생인 Mahesh Shira, machete 및 maima Sharma가 진행할 예정입니다.

이 절차를 시작하려면, A CSF를 준비하고 95% oxygen과 5% carbon dioxide로 버블링합니다. 인터페이스 챔버 바닥에 증류수를 용량의 약 70%까지 채웁니다. 그런 다음 32 °C로 사전 설정된 온도 조절기를 켭니다.

다음으로, 유입 튜브를 통해 증류수를 높은 유속으로 흘려보내 상단 챔버를 10~15분 동안 세척한 후, 유속을 1 mL/min으로 설정하여 A CSF로 전환합니다. 그다음, 슬라이스가 놓일 수 있는 표면을 제공하기 위해 상단 챔버에 네트를 배치합니다. 하단 챔버에 카보젠(carbogen) 공급을 시작하고, 유입 튜브를 지속적으로 카보젠 처리되고 있는 A CSF에 담급니다.

A CSF가 carbogen으로 포화되고 상단 챔버를 가득 채울 때까지 20분 동안 기다립니다. 이 단계에서 조직 절단기(tissue chopper)에 면도날을 장착하고 절단면이 고르게 정렬되었는지 확인합니다. 작은 거름종이를 절단하여 날이 단단히 고정되었는지 테스트합니다.

그런 다음 슬라이딩 버니어 마이크로미터를 시작 위치로 설정합니다. 이제 안락사시킨 쥐의 머리를 준비하고, 홍채 가위를 사용하여 후두부를 절개해 뇌줄기를 제거합니다. 이어서 두개골 오른쪽을 따라 작게 절개하고, 왼쪽은 더 길게 절개합니다.

골 절삭기를 사용하여 두개골의 왼쪽에서 오른쪽 방향으로 조심스럽게 제거합니다. 피질과 이를 덮고 있는 얇은 경막층을 드러내기 위해 얇은 스패튤라로 경막을 조심스럽게 제거한 다음, 골 절삭기로 전두판을 제거합니다. 이어서 스패튤라의 평평한 끝부분을 사용하여 피질과 소뇌 사이의 접합부에 남아 있는 경막을 제거하며, 이때 압력을 위쪽으로 유지하여 뇌가 손상되지 않도록 주의합니다.

스패튤라를 사용하여 뇌를 차갑게 냉각된 탄산화 A CSF가 채워진 알루미늄 냉각 블록 위의 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 11번 메스를 사용하여 해마를 분리하기 위해, 소뇌를 제거하기 위한 직선 절개와 뇌 전면부의 1/4을 제거하기 위한 절개를 각각 수행합니다. 그 다음 중앙선을 따라 얕은 시상면 절개를 수행합니다. 중앙선에서부터 시작합니다.

시클 스케일러(sickle scaler)를 사용하여 피질을 조심스럽게 제거하여 배측 해마를 노출시킵니다. 그 후, 해마 위의 피질 층을 제거합니다. 해마교차(hippocampal commissure) 부위를 작게 절개합니다.

식클 스케일러(sickle scaler)를 사용하여 등쪽 끝부터 굴리는 동작으로 해마를 조심스럽게 제거합니다. 이어서, 식클 스케일러의 곡선형 끝부분을 이용해 분리된 해마 주변의 피질과 결합 조직을 제거합니다. 해마 조직을 절편화하기 위해, CSF에 적신 30 millimeter watman 여과지 조각을 수동 절편기(manual slicer)의 절단 스테이지 위에 놓습니다.

해마 조직을 거름종이 위로 옮깁니다. 낫 모양 메스(sickle scalpel)의 평평한 끝부분을 사용하여, 해마가 슬라이서 칼날에 대해 적절한 방향으로 정렬되도록 거름종이를 이동시켜 해마가 fia에 대해 약 70도 각도로 절단되도록 합니다. 다음으로, 해마 조직 주변의 과잉 용액을 흡수시켜 제거합니다.

접은 거름종이를 사용하여 해마를 가로 방향으로 절단하고, 절편의 형태가 명확하지 않은 해마의 양 끝단 조직은 제거합니다. 그 후, 매 절단 단계마다 버니어 마이크로미터를 조정하여 남은 조직을 400 micron 두께의 절편으로 자릅니다. 각 절단 후, 부드러운 솔이 달린 브러시를 사용하여 절편을 칼날에서 조심스럽게 옮겨 차가운 carbonated A CSF가 채워진 작은 비커에 넣습니다.

그런 다음 깨끗한 플라스틱 파스토레트(past pipette)를 사용하여 절편들을 슬라이스 챔버 내의 망 위로 조심스럽게 옮깁니다. 끝이 넓은 팁을 사용하여 전극 위치 선정과 기록 확인이 용이하도록 절편의 위치를 세심하게 조정하며, 절편들이 A CSF 층에 충분히 둘러싸여 있되 완전히 잠기지 않았는지 확인합니다. 그 후 챔버를 덮고, 시냅스 태깅 및 캡처(synaptic tagging and capture) 실험의 경우 절편을 2~3시간 동안 배양합니다.

현미경 하에서 CA1 영역의 stratum radiatum에 두 개의 자극 전극을 배치하여 Schaffer collateral 섬유를 자극하고, 자극 전극 사이의 중간 지점인 CA1의 apical dendritic 영역에 기록 전극을 배치합니다. fEPSP 반응을 기록하려면, population spike 기록을 위해 stratum pyramidale 층에 또 다른 기록 전극을 배치하십시오.

모든 전극이 슬라이스에 닿으면, 두 입력단 모두에서 적절한 field EPSP 신호를 얻을 수 있는지 확인하기 위해 테스트 자극을 줍니다. 적절한 fEPSP 신호가 확인되면, 조작기의 미세 조절 노브를 사용하여 전극을 약 200 microns 더 조심스럽게 내립니다. 그 후 슬라이스가 회복될 수 있도록 20분 동안 대기합니다.

그 후, 20 microamps에서 100 microamps 범위의 전류 강도로 field EPSP의 기울기를 측정하여 입력-출력 관계를 결정합니다. 그런 다음 각 입력에 대해, 최대 field EPSP 기울기의 40%를 유발하는 자극 강도를 실험 전체 기간 동안의 일정 자극으로 설정합니다. 15분에서 20분 후에 baseline 기록을 시작하며, 하나의 입력에서 L-T-P-L-T-D 유도 전 최소 30분에서 60분 동안 안정적인 baseline을 기록하고, 단일 고주파 자극으로 구성된 약한 tetin 프로토콜을 사용하여 초기 LTP를 유도합니다.

다른 입력 경로에서 초기 LTP 유도 30분 후까지 기저선을 계속 기록하는 동안, 10분의 인터트레인 간격을 둔 반복적인 고주파 자극을 포함하는 강력한 tetin 프로토콜을 사용하여 입력 경로 S2에서 후기 LTP를 유도합니다. 그런 다음, 시냅스 태깅 및 캡처(synaptic tagging and capture)에 의해 입력 경로 S1의 초기 LTP가 후기 LTP로 전환되는 것을 확인하기 위해 장시간 동안 field EPSP 반응을 기록합니다. 마찬가지로, 교차 캡처(cross capture) 실험에서는 먼저 한 입력 경로에서 초기 LTP를 유도하고, 30분 후에 15분 동안 900회의 버스트로 구성된 강력한 저주파 자극 프로토콜을 사용하여 다른 입력 경로에서 후기 LTD를 유도합니다.

그 다음, 교차 포착(cross capture)에 의한 입력 S1의 초기 LTP가 후기 LTP로 전환되는 것을 확인하기 위해 장시간 동안 전기생리학적 EPSP 반응을 기록합니다. 이 구성에서는 두 개의 자극 전극이 CA1 영역의 stratum radiatum에 배치되어, 서로 독립적이면서도 중첩되는 두 개의 시냅스 입력을 자극합니다. CA1 피라미드 뉴런에는 두 개의 세포외 기록 전극을 배치합니다.

하나는 apical dendritic compartment로부터 F-E-P-S-P를 기록하기 위한 것이고, 다른 하나는 stratum radiatum과 stratum pyramidale에 각각 위치한 pyramid cell bodies로부터 somatic population spike를 기록하기 위한 것입니다. 이 그림은 시냅스 태깅 및 캡처(synaptic tagging and capture)를 연구하기 위한 weak-before-strong 패러다임을 보여줍니다.

초기 LTP를 유도하기 위해 S one에 약한 테타 자극(tetin)을 가한 후, 30분 뒤에 후기 LTP를 유도하기 위해 S two에 강한 테타 자극을 가하며, 이 그림은 교차 태깅(cross tagging)을 연구하기 위한 강한 패러다임 이전의 약한 패러다임을 보여줍니다. S one에서의 약한 테타 자극으로 초기 LTP가 유도되고, 이어 강한 저주파 자극 프로토콜을 사용하여 S two에서 후기 LTD가 유도됩니다. S one에서 30분이 지나면 초기 LTP가 6시간 동안 지속되는 후기 LTP로 전환되며, 이는 교차 태깅 및 캡처(capture)를 보여줍니다.

이 해부 및 절편 준비 기술을 숙달하면 3~5분 이내에 매우 빠르게 수행할 수 있습니다. 따라서 장시간 기록을 위해 절편의 생존력을 유지할 수 있습니다. 또한 이 방법을 사용하여 다양한 약리학적 제제가 시냅스 태깅 및 캡처 과정에 미치는 영향을 테스트할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 장기 기능적 가소성 실험을 수행하는 방법과 시냅스 태깅 및 캡처 과정에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.