El Enfoque del ratón Ronda-ventana para ototóxicos Agente de entrega: Una rápida y técnica fiable para la inducción de degeneración de las células cocleares

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo de lesión del oído interno mediante la administración estratégica de agentes ototóxicos directamente en el nicho de ventana redonda de la cóclea del ratón. Esto se logra diseccionando primero la capa de grasa subcutánea y retirando suavemente el cuerpo muscular para revelar el periostio de la bulla timpánica. El segundo paso es destapar la bullá eliminando gradualmente los fragmentos de hueso hasta que el nicho redondo de la ventana quede expuesto.

A continuación, el líquido visible del oído medio y el nicho de la ventana redonda se seca por completo, lo que permite una visualización óptima del nicho de la ventana redonda. El paso final es llenar el nicho de la ventana redonda con el agente ototóxico seleccionado sin interrumpir la arteria pedial STA, seguido de las repeticiones apropiadas de acuerdo con las especificaciones del agente. En última instancia, los procedimientos funcionales, incluida la respuesta auditiva del tronco encefálico y la evaluación morfológica, se utilizan para mostrar la preservación selectiva o la degeneración de la microarquitectura coclear.

La principal ventaja de esta técnica, nuestra medida existente, es que este procedimiento permite una excelente exposición del nicho de ventana equivocado y la memoria para llegar a un envejecimiento autotóxico selectivo se puede aplicar directamente. Las ventajas de esta técnica incluyen la preservación del oído interno, la microarquitectura, la evitación de la toxicidad sistémica, el inicio rápido del efecto, la degeneración selectiva de ciertos tipos de células cocleares y los resultados reproducibles. Esta técnica se puede aplicar con pocas alteraciones entre otras especies de roedores, como ratas, cobayas y jerbos.

Ahora voy a demostrar el procedimiento en mi laboratorio. Todos los aspectos de la investigación con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del comité institucional de cuidado y uso de animales correspondiente. Todos los procedimientos experimentales de vértebras descritos aquí fueron aprobados bajo las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur.

Después de anestesiar al animal de acuerdo con los procedimientos aprobados, administrar analgésico preoperatorio 0,1 miligramos por kilogramo. En este caso se utiliza buprenorfina. Comprobar que el animal ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia.

No debería haber respuesta a un pellizco en el dedo del pie, y el reflejo de escritura debería estar ausente en los ratones, como se ve aquí. Prera 0,2 mililitros de una solución acuosa que contiene el agente ototóxico seleccionado en una jeringa de tuberculina de un mililitro equipada con una aguja roma de media pulgada de calibre 28, expulsa el aire dentro de la jeringa, ya que las burbujas pueden impedir la aplicación adecuada del agente. Use cortaúñas eléctricas para eliminar el pelo en el área, que se extiende desde el pliegue acéfalo, hasta la cintura escapular.

Extienda la depilación desde la línea media sagital dorsal hasta el ángulo mandibular lateralmente. Use una maquinilla de afeitar desechable para asegurar una preparación bien afeitada. Esterilizar la piel de la zona preparada de acuerdo a los protocolos institucionales.

Aquí, Betadine alternado con etanol se aplica tópicamente de manera circular durante dos minutos. Coloque una pequeña almohadilla térmica debajo del cuerpo para mantener la temperatura corporal del animal. A una temperatura de 36 a 38 grados centígrados, asegure la cabeza del animal a través de un aparato de soporte de cabeza.

Apriete suavemente una pequeña pinza sobre el dorso del hocico del animal para mantenerlo en su lugar. Confirme que el soporte de la cabeza esté conectado rígidamente al centro de un brazo articulado en forma de U. Asegure una varilla de un centímetro de ancho en el brazo izquierdo de la U que se utilizará como reposacabezas del lado izquierdo para permitir el acceso al lado derecho.

Una vez firmemente asegurado en el soporte de la cabeza, gire el ratón a una posición de decúbito lateral izquierdo. Coloque el cuerpo con cuidado sobre la superficie de operación plana para asegurarse de que esté estable durante todo el procedimiento y evitar deshacer el esfuerzo torsional en las vértebras cervicales. Coloque un microscopio quirúrgico capaz de aumentar 10x y 20x sobre el campo quirúrgico.

Confirme que el microscopio puede mantener su posición de manos libres para que ambas manos puedan usarse para la cirugía mientras se trabaja con aumento microscópico. Use tijeras afiladas o una hoja de bisturí para crear una incisión postauricular de uno a 1,5 centímetros de aproximadamente seis a ocho milímetros hasta el pliegue cefálico auricular. Evite hacer cortes profundos para preservar las estructuras vasculares subyacentes.

Disección roma a través de la capa de grasa subcutánea. Si se disecciona en dirección ventral a medial, tenga cuidado de evitar la vena yugular externa. Si se produce sangrado, use gelatina absorbible, esponjas o gránulos de algodón para detener el flujo.

Una vez que la capa de grasa esté correctamente dividida, exponer la musculatura cervical. Un punto de referencia importante es una pequeña rama nerviosa del nervio craneal 11 que envuelve el borde posterior de la mastoides C CTO. Para extender el roly hacia el pabellón auricular, use un retractor autorretenedor para retraer suavemente el cuerpo del músculo de la mastoiditis CTO en una dirección posterior.

Divida suavemente la fascia transparente, envolviendo el cuerpo muscular. También retraiga suavemente la parótida y la vena yugular externa en la dirección opuesta. Con una buena retracción del cuerpo muscular CTO Masto, la cúpula brillante del periostio de la bulla timpánica es visible en el aspecto mimoso de la bulla, la inserción de un músculo cervical más profundo.

La Mastoiditis Esterno aparecerá a la vista. Coloque un retractor autorretenedor para mantener la mastoides CTO separada usando la técnica de dos manos, diatermia bipolar suavemente utilizada para dividir el periostio del toro y exponer el hueso subyacente. A continuación, utilice fórceps o un curado otológico para elevar y empujar suavemente el periostio en una dirección periférica para exponer completamente la cúpula del toro.

Ahora use un taladro dental manual accionado por correa con una punta cónica de uno o dos milímetros para perforar cuidadosamente un orificio piloto de dos milímetros a través del hueso bullah. Taladre entre el margen de la cúpula y la línea visiblemente opaca que se extiende a través de la cara rostral de la bullá. A continuación, taladre con cuidado un segundo orificio piloto cercano Para facilitar el destechado del hueso de la bullá con un par de pinzas de punta de joyero, destape el hueso de la bullá en dirección dorsal y mimada.

Tenga cuidado de no perforar la arteria EDL que se encuentra directamente debajo de la tapa del buey. Minimice la cantidad de hueso extraído para evitar la entrada excesiva de líquido al oído medio antes de la aplicación del agente. Use mecha de papel para eliminar todo el líquido visible en el oído medio y el nicho redondo de la ventana hasta que el hueso seco sea visible.

Este paso es crucial para el éxito del protocolo. Mientras observa el área con el máximo aumento, use una aguja de calibre fino en una jeringa de tuberculina de un mililitro para aplicar una gota de agente ototóxico directamente en el nicho de la ventana redonda llenándolo por completo. Deje que el agente descanse en el nicho de la ventana redonda durante 10 minutos.

En las primeras etapas, observe de cerca el reemplazo de un pequeño reflejo de luz en la base del nicho seco con un menisco líquido opaco y nebuloso. Esto indica que el nicho se está llenando correctamente. Cuando hayan transcurrido 10 minutos, absorba completamente el agente y reemplácelo con una nueva aplicación del mismo agente.

El número de aplicaciones depende del agente utilizado. El tiempo de exposición suele oscilar entre 30 y 60 minutos. Después de la aplicación final, deje el toro destapado y use fórceps para cerrar el tejido blando sobre el sitio quirúrgico.

Utilice cuatro suturas de monofilamento no absorbible para cerrar la piel sobre el sitio quirúrgico. Permita que el animal se recupere de la anestesia en una jaula casera limpia, que debe estar equipada con ropa de cama y comida blanda. Monitorear diariamente a los animales hasta el sacrificio y la recolección de tejido coclear adulto C-B-A-C-A-J.

Los ratones de ambos sexos fueron expuestos al agente ototóxico etanol Hept. La difusión alrededor de la ventana. Se observaron aumentos significativos en los umbrales de BR en ratones tratados desde el primer día postoperatorio hasta el día 14, animales de control que recibieron cirugía simulada con administración de solución salina en lugar de hept.

El etanol no demostró cambios significativos en el umbral a ninguna frecuencia probada. La inmunotinción contra un canal de potasio rectificador hacia adentro que se muestra en verde sirvió como método indirecto para visualizar el daño y la recuperación de las estructuras cocleares. La intensidad de la tinción disminuyó marcadamente dentro de theria vais.

En el primer día postoperatorio, también se observó evidencia de integridad nuclear interrumpida y condensación cromosómica, típica de la apoptosis celular, en la contratinción nuclear que se muestra en rojo. Cuando se cuantificó la intensidad de la tinción de los canales de potasio en las áreas de estratos tratados, las orejas mostraron un valle inicial seguido de un cambio significativo hacia la intensidad de control siete días después de la exposición al hept, y la recuperación continuó a partir de entonces. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en un plazo de 30 a 60 minutos si se realiza correctamente.

Es importante recordar que la exposición o reposición adicional puede ayudar a evitar la dilución no deseada del agente autotóxico por condensación de sangre o líquido intersticial. Sin embargo, se debe tener precaución con este enfoque, ya que tiende a aumentar el riesgo de lesionar inadvertidamente la arteria cedal o introducir líquido intersticial en el nicho de la ventana redonda. Esta técnica mínimamente invasiva permite el estudio detallado de delicados procesos bioquímicos y ha contribuido a avanzar en nuestra investigación destinada a comprender el potencial regenerativo coclear in vivo.