아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 아데노바이러스에 감염된 세포에 형성된 복제 구획이 풍부한 비핵 분획을 얻어 세포의 구성, 초미세 구조 및 관련 활성에 대한 자세한 연구를 수행하는 것입니다. 이 방법은 바이러스 게놈 복제 및 발현을 제어하는 분자 메커니즘에 대한 연구와 같은 DNA 바이러스학 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 바이러스 숙주 세포 상호 작용의 조절을 위해 복제 구획에 의존합니다. 이 기술의 주요 장점은 핵 복제 DNA 바이러스가 감염된 세포를 제어할 수 있도록 하는 메커니즘에 대한 연구에 적합한 무세포 시스템을 구축하기 위해 속도 구배를 기반으로 하는 간단한 절차라는 것입니다.

이 분석을 수행하기 위해, 먼저 아데노바이러스 5형 또는 D 5형 및 인간 포피 섬유아세포 또는 HFF를 준비하여 100mm 조직 배양 접시에서 100mm 조직 배양 접시에서 100 밀리리터의 85 및 DMM을 사용하여 30 초점 형성 단위의 MOI 또는 세포당 FFU를 사용하여 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 세포를 배양합니다. 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서. 15분마다 접시를 조심스럽게 흔들어 세포 전체에 바이러스 접종물이 균일하게 분포되도록 합니다. 배양 후 배지를 제거하고 새로운 dmem을 첨가하십시오.

10%FBS를 보충한 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 16, 24 또는 36시간 동안 세포를 배양합니다. 감염 후 감염된 세포와 대조 세포를 부드럽게 채취하고 얼음 위의 멸균 원심분리기 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다. 뉴바우어 챔버를 사용하여 세포를 계수한 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 220배 G로 세포를 원심분리합니다.

다음으로, 세포 펠릿을 5ml의 얼음처럼 차가운 PBS 원심분리기에 재현탁시키고 세포를 5ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척하여 세포를 이가 되도록 세척 상등액을 버립니다. Resus, 프로테아제 억제제가 포함된 700마이크로리터의 얼음처럼 차가운 저장성 완충액에 세포 펠릿을 현탁시키고 세포가 얼음 위에서 3시간 동안 팽창하도록 합니다. A형 테프론 유봉을 사용하여 10-20번의 다운 스트로크로 세포를 균질화합니다.

세포 용해를 모니터링하기 위해 20회마다 주기적으로 현미경으로 용해물을 확인합니다. 모든 세포가 성공적으로 파열될 때까지 약 80회 동안 이 과정을 반복합니다. 다음으로 균질화를 섭씨 4도에서 300배 G로 5분 동안 원심분리합니다.

섭씨 영하 20도의 상등액을 세포질 분획으로 튜브에 저장하여 핵 reus에서 세포 파편을 제거합니다. 펠릿을 750마이크로리터의 0.25몰 자당 용액, 1개의 피펫, 750마이크로리터의 0.35몰 자당 용액 2에 원심분리 튜브에 현탁시키고 용액 2에 재현탁 균질액을 조심스럽게 층을 이룹니다. 자당 쿠션을 섭씨 4도에서 1400배 G로 5분 동안 돌린 다음 상층액을 버립니다.

펠릿을 750 마이크로 리터의 용액 2에 현탁시켜 이가 생깁니다. 핵은 초음파 수조에서 핵 현탁액을 초음파 처리하며, 섭씨 4도 이하에서 두 번의 5분 펄스로 유지됩니다. 펄스 사이의 명시야 현미경으로 핵 용해를 확인하고 핵이 완전히 거짓말이 될 때까지 더 초음파 처리합니다.

다음으로, 750 마이크로 리터의 0.88 몰 자당 용액 3을 원심 분리 튜브에 넣고 용액 3 위에 핵 용해물 용액을 층을 이룹니다. 용해물을 섭씨 4도에서 3000배 G로 10분 동안 원심분리합니다. 1.5 밀리리터 S라는 이름의 핵 플라즈마 분획은 섭씨 영하 70도에서 저장됩니다.

그런 다음 펠릿을 700 마이크로 리터의 용액 2에 재현탁시킵니다. 이것은 숙주핵의 85 replication compartment fraction 또는 RCF이며, 이 역시 섭씨 영하 70도에서 저장됩니다. 면역형광 분석을 시작하려면 RCF를 5마이크로리터 방울 떨어뜨려 식염수로 코팅된 유리 슬라이드에 추가합니다.

실온에서 낙하 공기를 말리십시오. 그런 다음 스폿 옆에 드롭에 500마이크로리터의 PBS를 추가하고 슬라이드를 기울여 PBS가 스폿 위로 흐르도록 합니다. 슬라이드에서 PBS를 배출합니다.

다음으로, 실온에서 2시간 동안 5% 소 혈청 알부민이 함유된 500마이크로리터의 PBS로 샘플 스폿을 차단합니다. 과도한 차단 용액을 제거하려면 샘플에 직접 피펫팅하지 않고 슬라이드에 있는 샘플에 500마이크로리터의 PBS를 부드럽게 첨가합니다. 세탁을 세 번 수행합니다.

다음으로, 샘플 지점에 바이러스 E 2 A DNA 결합 단백질에 대해 20마이크로리터의 희석된 1차 항체를 추가합니다. 증발을 피하기 위해 슬라이드를 덮고 실온의 가습실에서 2시간 동안 배양합니다. 이제 0.02%tween 20이 포함된 PBS로 샘플을 세 번 부드럽게 세척합니다.

이러한 세척 후 샘플에 직접 피펫팅을 하지 마십시오. 20마이크로리터의 플루오로 4결합 마우스 2차 항체를 샘플에 직접 첨가하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 가습된 챔버에서 0.02%Tween 20이 포함된 PBS 500마이크로리터를 슬라이드에 추가하고, 다시 샘플에 직접 피펫팅하지 않도록 합니다.

그런 다음 2마이크로리터의 장착 용액을 추가하고 샘플 위에 커버 슬립을 뒤집습니다. 커버 슬립의 측면을 매니큐어로 밀봉하십시오. 아데노바이러스 E 2 A DNA 결합 단백질 또는 DBP의 면역형광 결과를 사용하여 사용된 fluoro four에 대해 원하는 파장에서 63 x 대물렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 슬라이드를 볼 수 있습니다.

DBP를 포함하는 구조는 아핵 바이러스 rc이며, E 두 A DBP는 RC 내에 국한되어 있으며 녹색으로 나타납니다. 또한, RCF에서 바이러스 DNA의 농축은 감염 후 24시간 및 36시간에 RCF와 핵 플라즈믹 분획 또는 NPL을 비교하는 PCR에 의해 확인되었습니다. 바이러스 GNA는 NPL 컨설팅이 아닌 RCF에서 선택적으로 발견되었습니다.

RCF에서 아데노바이러스 MNA의 추가 증거를 위한 첨부 텍스트: 이 기술을 마스터하면 감염된 세포를 수확하는 시점부터 RCF가 제대로 수행되면 RCF를 분리할 때까지 6년 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 샘플을 얼음 위에 보관하고 명시야 현미경으로 핵 균질화, 분리, 초음파 처리 및 핵 이하 분획 분리 단계를 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따릅니다.

R-T-P-C-R 및 투과 전자 현미경과 같은 다른 방법을 수행하여 바이러스 복제 구획과 관련된 바이러스 유전자 발현 조절 및 이러한 입자의 초미세 구조를 연구할 수 있습니다. 이 기술은 DNA 종양 바이러스학 분야의 연구자들이 세포 주기 조절을 변경하고 인간 세포에서 바이러스 복제를 촉진하는 분자 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 감염된 세포핵에서 바이러스 복제 구획을 분리하여 이러한 바이러스 유도 구조에 대한 형태학적, 기능적, 구성 연구를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

SAN 표시기로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 귀 입을 착용하는 것과 같은 타악기를 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.