아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 아데노바이러스에 감염된 세포에서 형성된 복제 구획(replication compartments)이 풍부한 비핵 분획을 얻어, 그 조성, 미세 구조 및 관련 활성을 상세히 연구하는 것입니다. 이 방법은 바이러스 게놈 복제 및 발현을 조절하는 분자적 기작에 대한 연구와 같이, 바이러스와 숙주 세포 간의 상호작용 조절을 위해 복제 구획에 의존하는 DNA 바이러스학 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점는 속도 구배(velocity gradient)를 기반으로 한 간단한 절차를 통해, 핵 내에서 복제되는 DNA 바이러스가 감염된 세포를 제어하는 기작을 연구하는 데 적합한 세포 없는 시스템(cell-free system)을 구축할 수 있다는 점입니다.

본 분석을 수행하기 위해, 먼저 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 아데노바이러스 5형 또는 Ad5 및 인간 포피 섬유아세포 또는 HFF를 준비합니다. 100mm 조직 배양 접시당 1mL의 DMEM을 사용하여 접시당 10⁷개의 HFF를 30 FFU/cell의 MOI로 감염시키기 시작합니다. 세포를 37°C, 5% CO₂의 습윤 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다. 이때 바이러스 접종물이 세포에 균일하게 분포되도록 15분마다 접시를 조심스럽게 흔들어 줍니다. 배양 후, 배지를 제거하고 신선한 DMEM을 추가합니다.

10% FBS를 첨가한 후, 셀 스크레이퍼(cell scraper)를 사용하여 세포를 16, 24 또는 36시간 동안 배양합니다. 감염된 세포와 대조군 세포를 감염 후 조심스럽게 수확하여 멸균 원심분리 튜브에 세포 현탁액을 담아 얼음 위에 보관합니다. 뉴바우어 챔버(neubauer chamber)를 사용하여 세포 수를 측정한 후, 4°C에서 220 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 세포 펠렛을 5 mL의 ice-cold PBS에 재현탁하고, 세포를 5 mL의 ice-cold PBS로 3회 원심분리 및 세척하며 세척 상층액을 제거하여 세포를 용해합니다. 세포 펠렛을 프로테아제 억제제가 포함된 700 µL의 ice-cold 저장성 완충액(hypotonic buffer)에 재현탁하고, 얼음 위에서 3시간 동안 세포를 팽창시킵니다. A 타입 테플론 페스틀(Teflon pestle)을 사용하여 세포를 10~20회 정도 아래로 누르며 균질화합니다.

세포 용해 상태를 모니터링하기 위해 20회 스트로크마다 주기적으로 현미경으로 용해물을 확인하십시오. 모든 세포가 성공적으로 파쇄될 때까지 이 과정을 약 80회 스트로크 동안 반복합니다. 다음으로 균질액을 4°C에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리하십시오.

핵 잔류물로부터 세포 파편을 제거하기 위해, 상층액을 튜브에 담아 -20 °C에서 세포질 분획으로 보관하십시오. 펠릿을 750 µL의 0.25 M sucrose 용액 1에 현탁하십시오. 원심분리 튜브에 750 µL의 0.35 M sucrose 용액 2를 넣고, 재현탁된 균질액을 용액 2 위에 조심스럽게 층을 이루도록 가하십시오. sucrose 쿠션을 4 °C에서 1400 ×g로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하십시오.

펠렛을 750 µL의 용액 2에 재현탁하여 핵을 용해합니다. 핵 현탁액을 4 °C 이하로 유지되는 초음파 세척기(ultrasonic bath)에서 5분씩 두 번 펄스로 처리합니다. 펄스 사이에 명시야 현미경으로 핵 용해 상태를 확인하고, 핵이 완전히 용해될 때까지 추가로 초음파 처리를 수행합니다.

다음으로, 원심분리 튜브에 0.88 M sucrose 용액 3을 750 µL 분주하고, 그 위에 핵 용해액을 층으로 쌓습니다. 용해액을 4 °C에서 3000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 1.5 mL 상층액은 핵질 분획(nucleoplasmic fraction)이며, 이를 -70 °C에 보관합니다.

그런 다음 펠렛을 700 µL의 용액 2에 재현탁합니다. 이는 호스트 핵의 85 복제 구획 분획(replication compartment fraction, RCF)이며, 마찬가지로 -70 °C에서 보관합니다. 면역형광 분석을 시작하려면 RCF 5 µL 한 방울을 식염 처리된 유리 슬라이드에 떨어뜨립니다.

방울을 상온에서 자연 건조시킵니다. 그 다음, 스팟 옆에 500 µL의 PBS를 한 방울 떨어뜨리고 슬라이드를 기울여 PBS가 스팟 위로 흐르게 합니다. 슬라이드에서 PBS를 제거합니다.

다음으로, 5% bovine serum albumin이 포함된 PBS 500 µL를 사용하여 상온에서 2시간 동안 샘플 스팟을 블로킹합니다. 과량의 블로킹 용액을 제거하기 위해, 샘플에 직접 피펫팅하지 않도록 주의하며 슬라이드에 스팟된 샘플에 PBS 500 µL를 조심스럽게 추가합니다. 세척 과정을 3회 반복합니다.

다음으로, 희석된 viral E two A DNA 결합 단백질 항체 20 µL를 샘플 지점에 첨가합니다. 증발을 방지하기 위해 슬라이드를 덮고 습윤 챔버 내 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 이제 0.02% tween 20이 포함된 PBS로 샘플을 세 번 부드럽게 세척합니다.

이 세척 단계 이후에는 샘플에 직접 피펫팅하지 마십시오. fluoro 4가 결합된 mouse secondary antibody 20 µL를 샘플에 직접 가하고, 4 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 습윤 챔버 내의 슬라이드에 0.02% Tween 20이 포함된 PBS 500 µL를 추가하며, 이때 역시 샘플에 직접 피펫팅하는 것을 피하십시오.

그 다음 2 µL의 봉입액(mounting solution)을 추가하고 샘플 위에 커버슬립을 덮습니다. 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다. 사용한 fluoro 4에 특정한 원하는 파장에서 63 x 대물렌즈가 장착된 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다. 아데노바이러스 E2A DNA 결합 단백질(DBP)의 면역형광법 결과가 여기에 제시되어 있습니다.

DBP를 포함하는 구조는 핵 내 바이러스 복제 구획(rc)이며, E2A DBP가 RC 내에 국소화되어 녹색으로 나타남에 유의하십시오. 또한, 감염 후 24시간 및 36시간에서 RCF와 핵질 분획(NPL)을 PCR로 비교하여 RCF 내 바이러스 DNA의 농축을 확인하였습니다. 바이러스 genomic DNA는 NPL이 아닌 RCF에서 선택적으로 발견되었습니다.

RCF 내 아데노바이러스 MNA의 추가 증거에 관한 동반 텍스트입니다. 이 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 감염된 세포를 수확하는 시점부터 RCF를 분리하기까지 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 샘플을 항상 얼음 위에 유지하고 균질화 핵 분리, 초음파 처리 및 핵하 분획 분리 단계를 명시야 현미경으로 모니터링하는 것이 중요합니다. 다음은 본 절차입니다.

바이러스 복제 구획과 관련된 바이러스 유전자 발현의 조절 및 이러한 입자의 초미세 구조를 연구하기 위해 R-T-P-C-R 및 투과 전자 현미경과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 DNA 종양 바이러스학 분야의 연구자들이 세포 주기 조절을 변화시키고 인간 세포 내에서 바이러스 복제를 촉진하는 분자 기전을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 잠재력이 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 바이러스에 의해 유도된 이러한 구조물의 형태학적, 기능적 및 구성적 연구를 수행하기 위해 감염된 세포 핵에서 바이러스 복제 구획을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

SAN 지시약을 사용하는 것은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 귀마개 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.