Name: 아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 배우세요 아데노바이러스 감염된 인간 세포에서 바이러스 복제 구획을 분리하는 방법을. 속도 구배를 이용한 세포외 시스템으로 바이러스 게놈 복제와 숙주 상호작용의 분자 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 작업은 CONACyT-SEP의 보조금으로 지원되었습니다(SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) 및 R.A.G.의 경우 Promep-SEP; PH는 CONACyT (447442)에서 장학금을 받았습니다.

1. HFF 세포 배양 및 광고 감염 <ol><li> 앞서 설명 된 바와 같이 8 HFF 세포에 형광 형성 유닛 (FFU)로서 HEK-293 세포의 단층에서 역가의 Ad5 WT 바이러스를 전파. </li><li> 가습 인큐베이터에서 DMEM / 10 % 태아 소 37 ºC에서 멸균 문화 100mm 요리 혈청 (FBS) 5 % CO 2 10ml에 인간의 포피 섬유 아세포 (HFF)을 성장. 네 16 평방 세트에서 세포를 계산하여 노이 바 우어 챔버를 이용하여 세포 수를 결정합니다. 용액 당 세포 수는 4-16 개의 정사각형 세트 세포 수의 평균을 산출하고 (10) (4)에 의해이 값을 곱함으로써 얻어진다. 스텝 130에 포함 된 각 시간 후 감염, 1 × 10 7 HFF 셀을 사용한다. </li><li> 모의 감염시킬가 형성 부 (30) 포커스의 방어에 접시 당 DMEM에서의 Ad5 1 ㎖를 사용하여 100mm 조직 배양 접시에서 아데노 바이러스 5 형 (의 Ad5) 야생형 (WT) (H5pg4100 8)로 HFF 세포를 감염, 또는 FFU 또는 셀 당. 아에 2 시간 동안 품어신중 요리마다 15 분간 흔들 umidified 37 ºC에서 세포 배양 인큐베이터 및 5 % CO 2, 셀 위에 바이러스 접종원 균일 분포를 보장한다. 이 시간 후, 배지를 제거하고, 추가 10 % FBS가 보충 된 신선한 DMEM 및 CO 2에서 37 º C 가습 세포 배양 인큐베이터에서 16, 24 또는 36 시간 동안 배양하고, 5 %. 2.1 단계로 진행합니다. </li></ol> 아데노 바이러스 RC이 함유 하위 핵 분수 2. 준비 <ol><li> 수확의 Ad5는 감염 또는 셀 스크래퍼와 모의에 감염된 HFF 세포와 멸균 원심 분리기 튜브에 세포를 수집합니다. 단계 1.2에서와 같이 세포 수를 결정합니다. 단계 1.3에 지정된 각 시간 후 감염 1 × 10 7 세포를 사용합니다. </li><li> 220 XG, 5 분 동안 4 ºC에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 빙냉 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을을, 10 mM의 나트륨 2 HPO 4 및 1.8 mM의 KH 2 PO 4). 세척 세포 펠렛S 세척 당 빙냉 PBS 5 mL를 이용하여 3 회. 이를 위해, 원심 분리기 (220) XG, 5 분, 4 캔트 ºC에서 세포 상등액 (SN)을 폐기하고, 부드럽게 피펫 팅하여 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 세포막을 파괴하기 위해, 700에서 세포 펠렛을 얼음 - 냉각 된 저장성 완충액 (L) (10 mM의 HEPES pH가 7.9, 10 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 0.5 mM의 DTT, 20 μ g / ㎖의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF)를 μ 재현 탁 10 μ g / ㎖ 소 췌장 트립신 저해제 10 μ는 g / ㎖ 펩 스타틴, 10 μ g / ml의 N 아세틸 L 로이 실 - L 로이 실 - L 포함한 시스테인, 세린, 트레오닌 및 아스파 틸 프로테아제 억제제의 혼합물 -argininal)과 세포를 3 시간 동안 얼음에 팽윤. </li><li> 를 Lyse 헐렁한 A 형 테플론와 유 봉, 호모 게 나이저를 사용하여 세포. 스트로크와 밝은 필드 현미경으로 매 20 스트로크는 모든 세포가 용해되었는지 확인하는 모니터 샘플 다운스 (80) 수행하지만, 핵 N 가지고손상 또는 파손 된 오티. </li><li> 300 XG, 5 분 동안 4 ºC에서 세포 파쇄 액을 원심 분리기. 원심 분리기 튜브 -20 ºC에서 세포질 분수로 SN을 저장합니다. </li><li> 솔루션 1 (S1)의 750 μ L (에 재현 탁, 핵에서 펠렛을 세포 파편을 제거하려면 0.25 M 자당, 10 밀리미터의 MgCl (10)를 포함하여 2 ~ 20 μ g / ㎖ PMSF, 시스테인, 세린의 혼합물 쓰 레오 닌과 아스파 틸 프로테아제 억제제 μ g / ㎖ 소 췌장 트립신 저해제 10 μ g / ㎖ 펩 스타틴, 10 μ g / ml의 N 아세틸 L 로이 실 - L 로이 실 - L-argininal)과 용액 (2)의 동일 부피를 통해 층 (S2) (0.35 M 수 크로스, 0.5 밀리미터의 MgCl 2, 20 μ g / ㎖의 PMSF, 시스테인, 세린, 10 μ g / ㎖ 소 췌장 트립신 저해제 10 μ g / ㎖ 펩 스타틴, 10 μ 포함 트레오닌 및 아스파 틸 프로테아제 억제제의 혼합물 g / ㎖의 아세틸 N-L-L 로이 실 - 로이 실 - L-argininal). 하기 Centr1400 XG, 5 분 4 ºC에서 ifuge. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여 SN을 폐기하십시오. 펠렛을 방해하지 마십시오. </li><li> S2 750 μ 리터에 고립 핵을 함유하는 펠렛을 재현 탁. </li><li> 아데노 RC (RCF) subnuclear 풍부 분획을 분리하기 위해, 5 분간 두 펄스를 이용하여, 초음파 욕 핵을 재현 탁하고, 초음파 처리, 또는 명 시야 현미경으로 관찰 된 바와 같이 모든 핵을 용해 될 때까지. C에서 4 ° 이하로 샘플을 유지하기 위해 필요에 따라 초음파 욕조에 얼음을 사용합니다. </li><li> 용액 3 (S3)에서 3,000 XG (0.88 M 수 크로스, 0.5 밀리미터의 MgCl 2) 원심 분리기, 10 분 동안 4 ºC 동량 위에 초음파 핵 층을 포함한다. -70 ºC에서 nucleoplasmic 비율 (NPL)과 1.5 ml의 상층 액을 저장합니다. -70 ºC에서 RCF와 S2의 700 μ L의 펠렛 및 저장을 재현 탁. </li></ol> RCF 3. 서양 얼룩의 분석 참고 : NPL과 RCF 분수 (S)의 웨스턴 블롯 분석을위한등은 제외 (640)는 고정 이하 여신에 대한 L 단계 2.11에서 얻은 총 볼륨에서 RCF 300 μ L를 μ. <ol><li> 5 분 95 ºC에서 15 μ 램 믈리 버퍼 2 배의 각 subnuclear 부분의 L (4 % SDS, 20 % 글리세롤, 10 % 2- 머 캅토 에탄올, 블루 0.004 % 브로 모 페놀, 0.125 M 트리스 염산의 pH 6.8)과 종기를 섞는다. 10 % 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 20 밀리 암페어 (mA)에서 1.5 시간 동안 겔 분리 단백질 변성에 샘플을 로딩. </li><li> 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 막에 400mA에서 1.5 시간 동안 electroblotting에 의해 단백질을 전송합니다. </li><li> RT는 PBS에 3 % 탈지 분유를 사용에서 2 시간 동안 막을 차단합니다. </li><li> PBS / 0.3 % 탈지 분유 500 희석 : 1에서 바이러스 E2A의 DNA 결합 단백질 (B6-8 9)에 대한 일차 항체와 4 ºC에서 O / N을 품어. </li><li> 3 회 PBS로 세척 막 / 0.1 %의 10 분 트윈 20. </li><li> 마우스 항 IgG의 차와 멤브레인을 품어실온에서 2 시간 동안 PBS에서 10,000 희석 : tibody은 1에서 말 무 퍼 옥시 다제 (HRP)에 연결된다. </li><li> PBS로 막 3 회 반복 / 0.1 % 트윈 20을 10 분 동안. </li><li> 강화 된 화학 발광 및 X 선 필름을 사용하여 멤브레인을 개발한다. </li></ol> RCF 4. 바이러스 DNA 검출 참고 : 두 NPL과 RCF 분수의 DNA 분리를 들어, 단계 2.11에서 얻은 총 부피의 RCF에 대한 NPL 210 μ L 100 μ L를 사용합니다. <ol><li> 단백질 분해 효소 K의 1 ㎎ / ㎖ 및 0.5 % 트윈 20과 55 ºC에서 1 시간 동안 하위 핵 분수를 품어. </li><li> 95 ° C에서 10 분 동안 샘플을 배양하여 단백질 분해 효소 K 불 활성화. </li><li> 2 분 동안 실온에서 20,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> (SN)를 수집합니다. 4 ℃에서 3M 아세트산 나트륨 1/10 부피의 이소프로판올을 하나의 볼륨, O / N로 DNA를 침전. </li><li> 실온에서 10 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리. </li><li> SN의 U 폐기마이크로 피펫을 노래. 20,000 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 70 % 에탄올과 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 10 mm의 10 μ 리터에서 DNA를 재현 탁 트리스 -HCl pH 7.4의 </li><li> 260 nm에서 광학 밀도 (OD)를 측정하여 분광 광도계를 사용하여 DNA를 정량. </li><li> 바이러스 성 DNA를 증폭 뉴클레오티드 7273에서, 주요 늦은 전사 부 내의 영역의 증폭을 허용 프라이머 반응 부피의 25 μ 리터에서의 Taq DNA 폴리머 라제를 사용하여 표준 PCR 반응에서 각 subnuclear 분획으로부터 DNA 100 ng의를 사용하여 염기 7353 (81 BP) FW (: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC;, 계 : GGATGCGACGACACTGACTTCA). 95 ºC에서 3 분의 초기 변성, 20 증폭 (95 ºC 72 ºC에서 30 초 62 ºC에서 1 분간 열처리 및 확장시 1 분)의 사이클에 대한 최종 확장 단계 다음에 다음주기 조건을 사용하여 72 ºC에서 3 분. </li><li> 티듐 90 V. 얼룩에, 2 % 아가 로스 젤에서 PCR 생성물을 실행할0.5 μ g / ml의 최종 농도 브롬화물과 RCF에서 바이러스 DNA 농축을 확증하기 위해 DNA를 시각화. 이 화합물은 강력한 돌연변이이기 때문에, 장갑을 착용해야합니다 항상 세심한주의와 에티 디움 브로마이드를 처리합니다. 제도적 지침에 따라 에티 디움 브로마이드를 폐기 할 것. </li></ol> RCF 5. 늦은 바이러스 mRNA를 검출 참고 : 두 NPL과 RCF 분수에서 RNA 분리를 들어, 단계 2.11에서 얻은 총 볼륨에서 RCF에 대한 고정 이하 여신에 대한 640 μ L 300 μ L를 사용합니다. <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 트리 졸 사용 subnuclear 분수에서 RNA를 분리합니다. DEPC (diethilpyrocarbonate) 처리 된 물 50 μ L의 RNA를 재현 탁. </li><li> 260 nm에서 OD를 측정하는 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량화 (약 3 μ g를 얻을 수있다). 50 NG에서 RNA를 저장 / -70 ºC에서 L 씩을 μ. </li><li> 정제 된 RNA를 확인전체 RNA의 5 NG 단계 4.9에 기재된 사이클 조건을 이용하여, 역전사 효소 (RT)의 부재하에 제어 PCR 반응을 수행하여 DNA 오염의 부재에 대한. <ol><li> DNA 오염이 존재하지 않는 경우에는 증폭 물이 생성 될 수 없습니다. DNA 오염이 존재하면, 10 U의 RNase 억제제 10 U의 DNase I, 0.1 M 트리스 -HCl pH를 8.3, 0.5 M KCl을 37 ºC에서 30 분 동안 15 밀리미터의 MgCl 2 샘플을 배양. 단계 5.1에서와 같이 RNA를 다시 분리로 이동합니다. </li></ol></li><li> RCF 연관 바이러스의 mRNA를 분석하기 위해, 다른 유전자 군 (표 1)에서 아데노 바이러스 후기의 mRNA를 검출하기위한 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 각각 subnuclear 분획으로부터 100 ng의 RNA를 증폭한다. <ol><li> 역전사 (RT)에 대해, 42 ºC에서 1 시간, 70 ºC에서 10 분 동안 반응 부피의 20 μ 리터에 M-MuLV RT 효소를 이용하여 표준 RT 반응시 각 subnuclear 분획으로부터, RNA 100 NG를 사용한다. </li><li> 증폭, 1을 사용단계 4.9에서와 같이 PCR 반응에서 cDNA를 μ 리터. 증폭의 25주기 다음 95 ºC에서 3 분의 초기 변성 (95 ºC에서 1 분, 어닐링 72 ºC에서 30 초 동안 표 1 및 확장에 지정된 온도에서 1 분)와 다음주기 조건을 사용하여 72 ºC에서 3 분 최종 확장 단계. </li></ol></li><li> μ는 0.5 g / ml의 최종 농도에 티듐 브로마이드 90 V. 얼룩 겔에서 2 % 아가 로스 젤에서 RT-PCR 산물을 실행하고 RCF로 바이러스 늦은 mRNA의 연관을 확증하기 위해 시각화. 단계 4.10에 표시된대로 에티 디움 브로마이드를 처리합니다. </li></ol> RCF 6. 면역 형광 시각화 주 : 반출 절차를 층류 캐비닛 아래의 먼지 입자와 함께 샘플의 오염을 방지하고, 사용 전에 모든 솔루션을 필터링. <ol><li> 스팟 5 단계에서 얻어진 디레 2.10 RCF 분획을 L μctly 실란 코팅 슬라이드. </li><li> 실온에서 약 5 분 동안 자리를 건조 보자. </li><li> 다시 수화물 천천히 간접적으로 RCF 지점 옆에 드롭 PBS의 500 μ 리터를 피펫 팅하고 슬라이드를 기울여 흐름 시켜서. 측면에서 초과 PBS를 배출합니다. </li><li> RT에서 2 시간 동안 PBS / 5 % 소 혈청 알부민의 500 μ 리터 (BSA) 시료를 피복하여 블록. </li><li> 부드럽게 간접적 샘플에 PBS 500 μ L을 피펫 팅하여 슬라이드 3 회 반복한다. 초과 PBS를 배출 슬라이드를 기울. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 PBS에 희석 500 : 1에서 바이러스 E2A의 DNA 결합 단백질 (B6-8 9)에 대한 일차 항체와 샘플을 품어. 항체 용액의 20 μ 리터와 발견 샘플을 커버하고 건조를 방지하기 위해 습한 챔버에서 배양한다. </li><li> 부드럽게 간접적 샘플에 PBS 500 μ L을 피펫 팅에 의해 PBS / 0.02 % 트윈 20 샘플을 3 회 반복한다. 전 오프 드레인 슬라이드를 기울운 세척 솔루션입니다. </li><li> 4 ºC에서 1 시간 동안, PBS에서 2,000 희석 : 1에서 488 nm에서 여기되는 형광체에 결합 된 마우스 항 IgG를 이차 항체로 샘플을 품어. 항체 용액의 20 μ 리터와 발견 샘플을 커버하고 건조를 방지하기 위해 습한 챔버에서 배양한다. </li><li> 부드럽게 간접적 샘플에 PBS 500 μ L을 피펫 팅에 의해 PBS / 0.02 % 트윈 20 샘플을 3 회 반복한다. 초과 세척 용액을 배출 슬라이드를 기울. </li><li> 중간 장착 2- μ L PBS / 10 % 글리세롤을 사용하여 커버 슬립으로 슬라이드 발견 샘플을 커버. 명확한 매니큐어 및 저장 등 -20 ºC와 인감. </li><li> 63X 대물 렌즈 및 488 nm의 파장에서 1.4 NA를 (NA)와, 형광 현미경을 이용하여 샘​​플을 분석한다. </li></ol>

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바이러스 감염에 의한 세포 활동의 조절을 지배하는 분자 메커니즘을 밝히기 위해서는 RC와 관련된 구성 및 활동을 이해하는 것이 도움이 될 것입니다. 따라서 RC에 대한 자세한 분석을 위해 우리는 이러한 바이러스 유도 구조의 크기와 생화학적 조성을 이용하는 무세포 시스템을 구축하여 자당 쿠션을 사용한 속도 구배에 의존하는 간단한 절차를 사용하여 RC가 풍부한 핵 이하 분획을 분리했습니다. 사용된 세포 유형에 따라 표준화가 필요한 절차의 중요한 단계는 다음과 같습니다: i) 핵의 파괴를 피하기 위해 세포 팽종에 사용되는 시간의 표준화; ii) 분획이 적절하게 분리될 수 있도록 자당 구배의 형성; iii) 명시야 현미경에 의한 절차 전반에 걸쳐 샘플의 지속적인 모니터링; iv) 모든 핵이 용해되지만 RC가 중단되지 않도록 초음파 처리 시간 및 강도; v) 모든 분획 단계는 핵 구조의 파괴를 피하기 위해 얼음 위에서 수행되어야 합니다. 
접할 수 있거나 예상할 수 있는 기술의 한계는 다...

아데노 바이러스는 감염된 세포의 핵에서 복제하는 이중 가닥 DNA 게놈을 포함합니다. 바이러스의 DNA는 핵 진입하면 PML 핵 몸체 (1)에 인접하여 국소화. 바이러스 초기 유전자 발현 다음, 핵 구조는 과장 되나, 바이러스 성 미세 환경의 형성을 유도하는, 재구성 바이러스 복제 격실 (RC) 2. 아데노 바이러스 (AD) RC는 바이러스 게놈의 복제 및 바이러스 유전자의 발현 늦은이 일어나는 부위이기 때문에, 이들은 이러한 프로세스에 참여하는 모든 필요한 바이러스 및 세포 인자의 채용을위한 환경을 제공한다. 흥미롭게도, 이러한 DNA 손상 반응으로서 세포의 항 바이러스 반응을 담당 세포 단백질의 다양성은 선천성 면역 반응 및 종양 억제는 공동하기로 이들 바이러스 2 위치한다. 병용을 조절하면서 효율적인 바이러스 복제를 촉진 따라서, 광고 RC가 고려 될 수 규제 허브이러한 구조는 바이러스 숙주 세포 상호 작용의 이해에 중요한 것을 나타내는 응답 세포 바이러스. 그럼에도 불구하고, RC 형성의 분자 메커니즘은 그들의 조성과 연관된 활동을 제대로 이해된다. 핵에서 복제 다른 DNA 바이러스에서 아데노 바이러스 RC뿐만 아니라 RC는 세포질 RC 3 대조적으로, 막에 관련되지 않습니다. 또한, 이러한 바이러스 - 유도 구조 단백질 및 핵산의 전체 구성 될 가능성이 높다. RNA 바이러스에 감염된 세포에서 형성 RC는 상세한 형태 적, 기능적, 생화학 적 특성 (4)를 촉진했다 그들의 세포질 현지화 및 막 - 결합 상태, 활용, 고립 된 (일반적으로 바이러스 성 공장을 지칭). 우리의 지식에, 핵 바이러스 성 RC는 아마도 인해 핵내 M의 핵 구조와 부재의 복잡성, 격리되지 않은자신의 분리를 용이하게 할 embranes. 이들의 연구는 대신에 면역 형광 현미경, 생선, 투과 전자 현미경에 의존하고있다. 그러나 subnuclear 구조를 분리 고유의 합병증에도 불구하고, 이러한 핵소체와 Cajal 기관과 같은 다른 핵 도메인은 5,6 전에 격리되었다. 핵소체 및 RC는 모두 단백질 및 핵산으로 구성하고, 직경이 0.5이되기 때문에 - 5 ㎛, 우리는 RC 역시 의무가 분리되어야한다는 가설을 세웠다. 따라서,보다 정확하게 RC 연관된 분자 조성 및 기능을 특성화하기 위해, 우리는 RC subnuclear 풍부 분획을 분리하는 새로운 방법을 확립. 이를 위해 핵소체 7 또는 다른 핵 영역 (6)을 분리하기 위해 사용 된 절차와 유사한 속도 구배 및 수 크로스 쿠션을 사용하는 하위 핵 분획을 제조하고, 분자 조성물의 연구 및 연관된 활동을 가능하게하는 무 세포계를 설립RC. 이 기술은 따라서 바이러스 숙주 세포 상호 작용의 이해를 발전하고 또한 핵 복제 다른 바이러스로부터 RC의 상세한 분석을 용이하게하고 adenovirus- 형성과 동일한 치수의 복제 구획 형성을 유도한다 강력한 도구를 대표한다 예, 헤르페스 바이러스, 유두종 바이러스 또는 폴리오 마 감염된 세포.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>37 &ordm에서 따뜻한; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>12484-028</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, Ultra Pure</td><td>Research Organics</td><td>0928S</td><td>2.55M 재고 용액을 준비하고 4 &ordm에 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>Dounce 균질화기</td><td>Kontess Glass Company</td><td>884900-0000</td><td></td></tr><tr><td>Branson 1800 초음파 욕조</td><td>Branson</td><td>Z769533&nbsp; SIGMA</td><td>사용 15분 전에 전원을 켜십시오.</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG1 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-21121</td> PBS 실란 준비 슬라이드<td>에서 1:2,000 희석으로 사용</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>층류 캐비닛에서 열기</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 화학발광 기판</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>34080</td><td></td></tr></tbody></table>

아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

아데노바이러스(Ad)에 의한 인간 세포의 감염 동안, 숙주 세포핵은 극적으로 재조직되어 바이러스 게놈이 차지하는 부위에 바이러스 및 세포 단백질의 동원을 통해 핵 미세환경을 형성합니다. 복제 구획(replication compartment, RC)이라고 하는 이러한 부위는 바이러스 게놈이 국소화되고 복제, 전사 및 전사 후 처리에 참여하는 바이러스 및 세포 단백질이 모집되는 바이러스 유도 핵 도메인으로 간주될 수 있습니다. 또한, 종양 억제 단백질, DNA 손상 반응(DDR) 구성 요소 및 선천성 면역 반응 인자와 같은 항바이러스 반응에 관여하는 세포 단백질도 RC에 선택됩니다. RC가 효율적이고 생산적인 복제 주기를 촉진하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 보이지만 구성 및 관련 활동에 대한 자세한 분석은 이루어지지 않았습니다. 아데노바이러스 RC 및 세포핵에서 복제되는 다른 DNA 바이러스의 잠재적 연구에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 속도 구배를 기반으로 하는 간단한 절차를 조정하여 Ad RC를 분리하고 이러한 바이러스 유도 핵 구조에 대한 형태학적, 기능적 및 구성 연구를 수행하고 숙주-세포 상호 작용에 미치는 영향을 연구할 수 있는 무세포 시스템을 구축했습니다.

바이러스 복제 용 구획 (RC)는 단백질과 다른 핵 도메인 유사한 핵산 이루어지는 subnuclear 바이러스 - 유도 된 구조이기 때문에, 그들은 생화학 적 특징에 기초하여 속도 구배에 의해 분리 의무가 것을 알았다. 분별 프로토콜의 중요한 단계는 샘플이 다른 서브 세포 분획의 무결성을 보장하기 위해 명 시야 현미경으로 관찰 할 필요가 각 단계에서,도 1에 도시되어있다. 세포를 팽창 할 때 예를 들어, 저장성 완충액 배양 시간은 핵의 손상을 방지 세포질을 팽창하기 위해 표준화 될 필요가있다. 소포체 막 포함 세포질 구성 요소를 무료로 휴대 균질화 그대로 핵, 후, 획득해야합니다. 또한, 초음파 처리 시간은 RC 중단없이 모든 세포의 핵막을 파열시키기 위해 표준화 될 필요가있다. 하위 핵 분획을 얻은 후, 키컨트롤은 RCF에서 협회와 선의의 RC 마커의 농축을 결정하기 위해 포함 할 필요가있다. 아데노 바이러스는 통상적으로 RC ...

우리는 아데노바이러스(Ad)에 감염된 인간 세포에서 바이러스 복제 구획(RC)을 분리하는 새로운 전략을 제공합니다. 이 접근법은 바이러스 게놈 복제 및 발현을 조절하는 분자 메커니즘과 RC에서 확립된 바이러스-숙주 상호 작용의 조절을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 무세포 시스템을 나타냅니다.

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

이 절차의 전반적인 목표는 아데노바이러스에 감염된 세포에서 형성된 복제 구획(replication compartments)이 풍부한 비핵 분획을 얻어, 그 조성, 미세 구조 및 관련 활성을 상세히 연구하는 것입니다. 이 방법은 바이러스 게놈 복제 및 발현을 조절하는 분자적 기작에 대한 연구와 같이, 바이러스와 숙주 세포 간의 상호작용 조절을 위해 복제 구획에 의존하는 DNA 바이러스학 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점는 속도 구배(velocity gradient)를 기반으로 한 간단한 절차를 통해, 핵 내에서 복제되는 DNA 바이러스가 감염된 세포를 제어하는 기작을 연구하는 데 적합한 세포 없는 시스템(cell-free system)을 구축할 수 있다는 점입니다.본 분석을 수행하기 위해, 먼저 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 아데노바이러스 5형 또는 Ad5 및 인간 포피 섬유아세포 또는 HFF를 준비합니다. 100mm 조직 배양 접시당 1mL의 DMEM을 사용하여 접시당 10⁷개의 HFF를 30 FFU/cell의 MOI로 감염시키기 시작합니다. 세포를 37°C, 5% CO₂의 습윤 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다. 이때 바이러스 접종물이 세포에 균일하게 분포되도록 15분마다 접시를 조심스럽게 흔들어 줍니다. 배양 후, 배지를 제거하고 신선한 DMEM을 추가합니다.10% FBS를 첨가한 후, 셀 스크레이퍼(cell scraper)를 사용하여 세포를 16, 24 또는 36시간 동안 배양합니다. 감염된 세포와 대조군 세포를 감염 후 조심스럽게 수확하여 멸균 원심분리 튜브에 세포 현탁액을 담아 얼음 위에 보관합니다. 뉴바우어 챔버(neubauer chamber)를 사용하여 세포 수를 측정한 후, 4°C에서 220 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.다음으로, 세포 펠렛을 5 mL의 ice-cold PBS에 재현탁하고, 세포를 5 mL의 ice-cold PBS로 3회 원심분리 및 세척하며 세척 상층액을 제거하여 세포를 용해합니다. 세포 펠렛을 프로테아제 억제제가 포함된 700 µL의 ice-cold 저장성 완충액(hypotonic buffer)에 재현탁하고, 얼음 위에서 3시간 동안 세포를 팽창시킵니다. A 타입 테플론 페스틀(Teflon pestle)을 사용하여 세포를 10~20회 정도 아래로 누르며 균질화합니다.세포 용해 상태를 모니터링하기 위해 20회 스트로크마다 주기적으로 현미경으로 용해물을 확인하십시오. 모든 세포가 성공적으로 파쇄될 때까지 이 과정을 약 80회 스트로크 동안 반복합니다. 다음으로 균질액을 4°C에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리하십시오.핵 잔류물로부터 세포 파편을 제거하기 위해, 상층액을 튜브에 담아 -20 °C에서 세포질 분획으로 보관하십시오. 펠릿을 750 µL의 0.25 M sucrose 용액 1에 현탁하십시오. 원심분리 튜브에 750 µL의 0.35 M sucrose 용액 2를 넣고, 재현탁된 균질액을 용액 2 위에 조심스럽게 층을 이루도록 가하십시오. sucrose 쿠션을 4 °C에서 1400 ×g로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하십시오.펠렛을 750 µL의 용액 2에 재현탁하여 핵을 용해합니다. 핵 현탁액을 4 °C 이하로 유지되는 초음파 세척기(ultrasonic bath)에서 5분씩 두 번 펄스로 처리합니다. 펄스 사이에 명시야 현미경으로 핵 용해 상태를 확인하고, 핵이 완전히 용해될 때까지 추가로 초음파 처리를 수행합니다.다음으로, 원심분리 튜브에 0.88 M sucrose 용액 3을 750 µL 분주하고, 그 위에 핵 용해액을 층으로 쌓습니다. 용해액을 4 °C에서 3000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 1.5 mL 상층액은 핵질 분획(nucleoplasmic fraction)이며, 이를 -70 °C에 보관합니다.그런 다음 펠렛을 700 µL의 용액 2에 재현탁합니다. 이는 호스트 핵의 85 복제 구획 분획(replication compartment fraction, RCF)이며, 마찬가지로 -70 °C에서 보관합니다. 면역형광 분석을 시작하려면 RCF 5 µL 한 방울을 식염 처리된 유리 슬라이드에 떨어뜨립니다.방울을 상온에서 자연 건조시킵니다. 그 다음, 스팟 옆에 500 µL의 PBS를 한 방울 떨어뜨리고 슬라이드를 기울여 PBS가 스팟 위로 흐르게 합니다. 슬라이드에서 PBS를 제거합니다.다음으로, 5% bovine serum albumin이 포함된 PBS 500 µL를 사용하여 상온에서 2시간 동안 샘플 스팟을 블로킹합니다. 과량의 블로킹 용액을 제거하기 위해, 샘플에 직접 피펫팅하지 않도록 주의하며 슬라이드에 스팟된 샘플에 PBS 500 µL를 조심스럽게 추가합니다. 세척 과정을 3회 반복합니다.다음으로, 희석된 viral E two A DNA 결합 단백질 항체 20 µL를 샘플 지점에 첨가합니다. 증발을 방지하기 위해 슬라이드를 덮고 습윤 챔버 내 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 이제 0.02% tween 20이 포함된 PBS로 샘플을 세 번 부드럽게 세척합니다.이 세척 단계 이후에는 샘플에 직접 피펫팅하지 마십시오. fluoro 4가 결합된 mouse secondary antibody 20 µL를 샘플에 직접 가하고, 4 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 습윤 챔버 내의 슬라이드에 0.02% Tween 20이 포함된 PBS 500 µL를 추가하며, 이때 역시 샘플에 직접 피펫팅하는 것을 피하십시오.그 다음 2 µL의 봉입액(mounting solution)을 추가하고 샘플 위에 커버슬립을 덮습니다. 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다. 사용한 fluoro 4에 특정한 원하는 파장에서 63 x 대물렌즈가 장착된 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다. 아데노바이러스 E2A DNA 결합 단백질(DBP)의 면역형광법 결과가 여기에 제시되어 있습니다.DBP를 포함하는 구조는 핵 내 바이러스 복제 구획(rc)이며, E2A DBP가 RC 내에 국소화되어 녹색으로 나타남에 유의하십시오. 또한, 감염 후 24시간 및 36시간에서 RCF와 핵질 분획(NPL)을 PCR로 비교하여 RCF 내 바이러스 DNA의 농축을 확인하였습니다. 바이러스 genomic DNA는 NPL이 아닌 RCF에서 선택적으로 발견되었습니다.RCF 내 아데노바이러스 MNA의 추가 증거에 관한 동반 텍스트입니다. 이 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 감염된 세포를 수확하는 시점부터 RCF를 분리하기까지 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 샘플을 항상 얼음 위에 유지하고 균질화 핵 분리, 초음파 처리 및 핵하 분획 분리 단계를 명시야 현미경으로 모니터링하는 것이 중요합니다. 다음은 본 절차입니다.바이러스 복제 구획과 관련된 바이러스 유전자 발현의 조절 및 이러한 입자의 초미세 구조를 연구하기 위해 R-T-P-C-R 및 투과 전자 현미경과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 DNA 종양 바이러스학 분야의 연구자들이 세포 주기 조절을 변화시키고 인간 세포 내에서 바이러스 복제를 촉진하는 분자 기전을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 잠재력이 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 바이러스에 의해 유도된 이러한 구조물의 형태학적, 기능적 및 구성적 연구를 수행하기 위해 감염된 세포 핵에서 바이러스 복제 구획을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.SAN 지시약을 사용하는 것은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 귀마개 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인플루엔자 바이러스의 게놈은 RNA와 단백질 여덟 별도 단지, 칭했다 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNPs)로 구성되어 있습니다. 본 논문은 글리세롤 기울기 정화 및 독감 vRNPs의 전송 전자 현미경의 시각화에 대해 설명합니다.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

성인 심장 myocytes 동물 마음으로부터 격리하고 며칠 동안 교양 수있는 기본 세포입니다. 이 문화가 기간 내에 adenoviral 유전자 전송은 유전자 인코딩 bi​​osensors (GEBs) 또는 형광 융합 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. 두 접근 방법 공촛점 현미경에 의해 세포 조사를 허용합니다.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

우리는 감염된 세포로부터 고순도 herpesvirus nucleocapsid DNA를 분리하는 과정을 설명합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응, 새로운 바이러스 recombinants 생산 transfections에 적합하고, 높은 집중력과 순결입니다.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

여기에는 오직 사용중인 다른 프로토콜에 비해 100 개 이상의 배 이상에 의한 재조합 파르 보 바이러스 생산의 효율성을 향상시켜 세포 감염에 기반 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 파르 보 바이러스의 부사장의 전송 단위 (광고-VP)를 포함하는 5-기반 도우미 소설 아데노 바이러스의 사용에 의존하고 있습니다.

아데노 바이러스 파생 시스템의 도움으로 효율적인 재조합 파르 보 바이러스 생산

인플루엔자 바이러스는 호스트 세포 염색질과 협회들의 RNA 게놈을 복제. 여기서는 감염된 세포의 염색질에서 그대로 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스를 정화하는 방법을 제시한다. 바이러스 단지 투석을하는 것은 각각 서양 얼룩 및 단백질과 RNA 내용의 프라이머 확장명을 모두에 의해 분석할 수 있습니다.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을...

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

모든 바이러스 코딩 염기서열이 결여된 고용량 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 벡터 게놈에 포함된 전이유전자의 클로닝은 homing endonucleases를 기반으로 합니다. 부착 세포로 성장하고 현탁액에서 생산자 세포의 바이러스 증폭은 트랜스에 바이러스 유전자를 제공하는 보조 바이러스에 의존합니다.

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

여기서, 우리는 pAdEasy 시스템을 사용하여 아데노바이러스 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 pAdTrack 및 pAdEasy-1 플라스미드의 재조합, 아데노바이러스 포장 및 증폭, 세포 용해 및 배양 배지에서 아데노바이러스 입자의 정제, 바이러스 적정, 아데노바이러스의 기능적 테스트를 포함한다.

아데노바이러스 생산을 위한 효율적인 방법

아데노 관련 바이러스는 현탁 세포 배양에서 생성되며 이중 요오드화놀 밀도 구배 원심분리로 정제됩니다. 총 바이러스 수율을 높이고, 바이러스 침전의 위험을 줄이고, 최종 바이러스 산물을 더욱 농축하기 위한 단계가 포함되어 있습니다. 예상되는 최종 역가는10,12 바이러스 입자/mL에 도달하며 전임상 in vivo 사용에 적합합니다.

In Vivo 응용 분야를 위한 Iodixanol Density Gradient Centrifugation에 의한 아데노 관련 바이러스의 현탁 배양 생산 및 정제

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

배우세요 아데노바이러스 감염된 인간 세포에서 바이러스 복제 구획을 분리하는 방법을. 속도 구배를 이용한 세포외 시스템으로 바이러스 게놈 복제와 숙주 상호작용의 분자 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

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