단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 정자를 4개의 별개의 개체군으로 분리하여 정자 형성에 대한 분자 연구를 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 유전체 무결성에 대한 색채 모델링의 영향과 같은 거울 복제 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 교차 오염 없이 정자를 순수 세포 집단으로 분리한다는 것입니다.

세포 분류 전날 haplo 매개변수에서 염색질 리모델링(chromatin remodeling) 중 DN 염색 강도의 중요한 변화를 관찰했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 5 밀리리터 폴리 프로필렌 둥근 바닥과 15 및 50 밀리리터 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 1-2 밀리리터의 열 비활성화 FBS를 추가합니다. 다음으로, 다음날 회전기에서 섭씨 4도의 하룻밤 반전으로 튜브를 천천히 코팅합니다.

P 200 피펫을 사용하여 FBS를 조심스럽게 디캔팅하여 15 및 50 밀리리터 튜브에서 잔류 FBS를 제거하고 5 밀리리터 튜브에 100-200 마이크로리터의 소량의 FBS를 남겨 세포가 생성된 날에 정제된 세포를 수집합니다. 분류, 캡슐화된 테스트 조각을 500마이크로리터의 분류 버퍼에 다집니다. 그런 다음 잘린 마이크로 피펫 팁을 사용하여 조직 조각을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

정액세관의 생식 세포를 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 씻어낸 다음 손상되지 않은 팁으로 씻어냅니다. 다음으로, 40미크론 셀 스트레이너를 사용하여 FBS로 코팅된 50밀리리터 원추형 튜브에서 여과액을 수집하는 파편과 덩어리를 제거합니다. 총 부피가 최대 3ml인 분류 버퍼로 필터를 한 번 세척하고 여과액을 FBS로 코팅된 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 세포 현탁액 1 밀리리터 당 16 마이크로 리터의 EDTA를 세포에 추가하고 10 밀리리터 피펫을 사용하여 저속 와류를 수행하는 동안 3 가지 부피의 얼음처럼 차가운 100 % 에탄올로 1 분에 걸쳐 세포를 천천히 고정하면 고정 후 현탁액이 유백색으로 변합니다. 얼음 위에서 세포를 15분 동안 배양하고 가끔 반전시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 원심분리하고, 2ml의 분류 버퍼에 팔레트를 재현탁탁하고, 분류 직전에 4마이크로리터의 cyto 16 DNAD로 생식 세포를 염색합니다.

50미크론 필터를 통해 FBS 코팅된 팩스 튜브로 셀을 필터링하고 1-2밀리리터의 분류 버퍼로 필터를 광범위하게 세척합니다. 고정된 생식 세포를 488나노미터 레이저가 장착된 세포 분류기에 로드합니다. 다음으로, Alexa floor 4 88 영역에 대한 이벤트 수를 나타내는 히스토그램과 함께 총 이벤트를 표시하고 양성 DNA 염색 세포를 게이트합니다.

그런 다음 이 게이트의 셀을 전방 산란 영역 플롯 및 게이트에 대한 측면 산란 영역에 표시합니다. 표시된 바와 같이 셀은 Alexa floor 4 88 영역, 플롯 및 게이트에 대한 전방 산란 영역에 이러한 게이트 셀을 표시합니다. 그런 다음 셀은 다시 이러한 게이트를 Alexa 층 4 88 면적 플롯에 대해 별도의 Alexa 층 4 88 너비로 표시합니다.

정자 형성은 1단계에서 9단계, 10단계에서 12단계입니다. 그런 다음 정자를 분류하여 13-14 단계와 15-16 단계를 수집 할 수 있습니다. 정자는 첫 번째 게이트에서 EXOR 4 88 영역 플롯 및 게이트에 대해 전방 산란 영역으로 세포를 표시합니다.

표시된 세포 집단. 그런 다음 이 게이트를 개별 Alexa에 표시합니다. 층 4 88 알렉사에 대한 너비 층 4 88 면적 플롯 및 게이트.

분류를 위한 13-14단계 및 15-16개의 정자. 마지막으로, 100-200 마이크로 리터의 FBS에서 정제 된 분획을 얼음 위에 코팅 된 5 밀리리터의 둥근 바닥 튜브에 개별 FBS로 수집합니다. 이 이미지에서는 흐름이 분류된 스미트된 개체군의 dappy staining을 보여줍니다.

정자 형성 단계 1에서 9까지의 정자는 일반적으로 정자 형성에서 타원형으로 보이는 둥근 모양의 핵을 표시합니다. 9 단계 정자, 그리고 10 단계에서 12 단계에서 길쭉한 고리로 관찰됩니다. Spermatids 정자 형성 단계 13-14 및 15-16 spermatid는 유사한 모양의 핵을 나타내지만 DNA 염색 강도가 약간 다르기 때문에 유세포 분석으로 분류하는 동안 이러한 뚜렷한 sper 집단을 식별할 수 있습니다.

입증된 프로토콜에 따라 개별 S 실험 집단의 순도는 95 - 100%로 예상할 수 있습니다.이 기술은 6-8시간 내에 완료할 수 있습니다. 각 단계를 올바르게 따르는 경우. 이 절차를 따르면 정자의 뚜렷한 집단을 얻을 수 있으므로 극적인 리모델링 과정을 특성화하거나 이 전이의 유전적 영향을 연구하는 것과 같은 분자 분석을 위한 충분한 양의 자료를 제공할 수 있으므로 이 절차를 통해 항상 세포를 얼음 위에 유지하는 것을 기억