Name: 단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 학습하세요 유동 세포 계측법을 이용하여 마우스 정자 세포를 4개의 순수 집단으로 분리하는 방법을. DNA 염색과 크기·입자성을 기준으로 정자형성의 분자 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 표면 형광 현미경에 관한 기술적 조언 박사 레오 니드 볼코프 에릭 보우 차드을 감사드립니다. 경제적 지원 GB의 건강 연구 (보조금 # 1 MOP-93781)의 캐나다 연구소에 의해 자금 지원

동물 보호는 셔 브룩 대학 동물 관리 및 사용위원회에 따라이었다. 1. 튜브 준비 <ol><li> 셀 소팅 전날, 5 ㎖ 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브에 열 활성화 된 우 태아 혈청 (FBS) 1-2 mL를 넣고 15 mL 및 50 mL의 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 관한 것이다. 중요한 단계 : 프로토콜에서 사용되는 모든 튜브가 코팅 된 것을 확인합니다. 참고 : FBS 코팅 튜브 벽에 달라 붙는 세균 세포를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 천천히 튜브를 균일하게 회전을 사용하여 코트 4 ° C에서 반전에 의해 O / N을 섞는다. </li><li> 다음 날, 경사에 의해 코팅 된 튜브에서 FBS를 제거합니다. <ol><li> * 중요한 단계 : 5 ML의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브 및 셀 제조에 사용 (15)과 50 ㎖ 튜브 (프로토콜이 2.11에 2.1 단계) 완전히 패닝 (측면 스트림 즉, 부정확 편차)을 방지하기 위해 FBS의 비워되어 있는지 확인합니다. FBS를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다. <br/&gt; 참고 : 이전에 셀 또는 셀 정렬하는 동안 사용되는 다른 튜브의 오염의 손실을 초래할 수 정렬에 튜브에 잔류 FBS, </li><li> 라운드 5 ML의 폴리 프로필렌 정제 된 세포를 수집하는 데 사용 하단 튜브 FBS (약 100 ~ 200 μL)의 작은 잔류 볼륨을 남겨주세요. </li></ol></li></ol> 2. 휴대 준비 <ol><li> O를 CO 2 질식 이어 2 / 이소 플루 란 (당시 2 %로 유지 5 %에서 유도)를 사용하여 마취 한 남성 마우스를 희생. </li><li> 소비세 및 디 캡슐 모두 고환과 1.5 ML 튜브로 버퍼를 정렬 500 μL에 작은 가위로 말하다. </li><li> 그대로 100-1,000 μL 팁과 후 정액을 운반하는 최초의 잘린 100-1,000 μL 팁과 1.5 ML 튜브에 부드러운 상하 피펫으로 세관,과에서 세척 생식 세포. </li><li> 40 μm의 셀 스트레이너를 사용하여 하나의 여과 공정에 의해 파편과 덩어리를 제거하고 50 ML 원뿔 튜브 이전에 여과 액을 수집iously 1 단계에서 FBS로 코팅. </li><li> 이전에 1 단계에서 코팅 된 15 ML 원뿔 튜브에 총 3 ㎖의 볼륨 및 전송 여과까지 버퍼를 정렬 한 번 필터를 씻으십시오. </li><li> 0.8 mM의 EDTA의 최종 농도를 얻도록 50 mM의 EDTA 세포 현탁액의 pH를 8 밀리 리터당 (3 ㎖, 48 μL)의 16 μL를 추가한다. </li><li> 생식 세포를 해결하려면, 천천히 우유 정지를 만들어 부드러운 교반 10ml를 피펫 (낮은 속도로 소용돌이)를 사용하여 얼음처럼 차가운 100 % 에탄올 3 볼륨을 추가합니다. 중요한 단계 : 에탄올을 천천히 첨가 세포 제제의 무결성을 유지하는 것이 중요하고 중요하다. 우리는 빠른 에탄올 첨가 효율 정렬 주요한 감소의 결과로 세포 용해를 유발한다는 지적. 3 ml의 세포 현탁액의 경우, 에탄올의 9 ㎖를 약 1 분으로 첨가되어야한다. </li><li> 반전에 의해 가끔 혼합 15 분 동안 얼음에 세포를 품어. </li><li> 원심 분리기 세포 5 분 800 XG에 서스펜션과 맑은 제거상층 액. </li><li> 부드럽게 정렬 버퍼 2 ㎖에 고정 생식 세포를 재현 탁. </li><li> SYTO16 DNA 염료 (DMSO 1 mM의 용액)의 4 μl를 추가하고 (빛으로부터 보호) 적어도 30 분 동안 품어. 주 : 최상의 정렬 결과는 쉽게 정자의 고도로 압축 된 핵에 도입되는 DNA 투과성 염료이므로 SYTO16를 사용하여 얻어진다. </li></ol> 3. 세포 분류기는 설정 참고 : 여기, 4 레이저 (405 nm의 - 보라색, 488 nm의 - 블루, 561 nm의 - 노란색 - 녹색, 633 nm의 - 빨강) 20 매개 변수 BDFACSAria III 세포 분류기 사용됩니다. BD FACSDiva 6.1.3 소프트웨어는 데이터를 시각화 및 분석하는 데 사용된다. 설정이 사용 분류기의 종류에 따라 달라질 수있다. <ol><li> 유체 역학 종료 절차 (소프트웨어의 &quot;사이토&quot;메뉴) 분류 이전시 칼집 유체로 70 % 에탄올을 실행하여 FACS 분류기를 소독. 소프트웨어의 도구 모음에서 &quot;사이토&quot;를 선택하고 &quot;유체 쉬를 선택. &quot;를 utdown 프로세스에 의해 언급 된 단계를 수행합니다. </li><li> 제조 및 수정 및 오염물을 제거하기 위하여 0.22 μm의 필터로 1X PBS 필터. 탱크 내부의 상부에 용접선에 칼집 탱크를 채우기. </li><li> 소프트웨어를 시작하고 로그인합니다. 이전에 정렬에 적어도 30 분 동안 레이저를 따뜻하게 외과 분류기를 시작합니다. 유체 역학에서 에탄올을 세척하는 두 유체 시작 프로세스를 실행합니다. 소프트웨어의 도구 모음에서 &quot;사이토&quot;를 선택하고 &quot;유체 시작&quot;을 선택합니다. 프로세스에 의해 언급 된 단계를 수행합니다. 참고 :이 정상 칼집 유체 (1X PBS)와 유체 공학을 복원합니다. </li><li> 정렬 블록과 증류수로 편향 판을 청소하고 철저하게 그들을 건조. 초음파 욕에서 2 분 동안 증류수 튜브에 넣고 100 ㎛ 노즐을 초음파 처리. 철저하게 노즐을 닦습니다. </li><li> 흐름 셀에 100 μm의 노즐을 삽입하고 12 노즐 잠금 레버를 시계 방향으로 돌립니다시간 위치. 20 PSI에 칼집 압력을 설정합니다. </li><li> 스트림의 전원을 켜고 (약 30) 주파수에 대한 목표 값을 얻기 위해 진폭을 조정, 1 (150의 주위에) 삭제하고 (12 정도) 갭과 안정적인 방울 breakoff 패턴을 (몇 위성 방울) 설정합니다. 감쇠를 끕니다. </li><li> 스트림이 직선이고 정렬 블록의 각도를 변경하여 폐기물 흡입기의 중심 안타 있는지 확인합니다. 참고 : 10 PSI에서 130 μm의 노즐도 테스트하고 명백한 차이는 발견되지 않았다. </li><li> 노란색 - 녹색 레이저에 대한 파란색, 보라색의 적색 -77.39, 37.33 및 -39.85 0으로 설정 레이저 지연. </li><li> 노란색 - 녹색 레이저에 대한 파란색, 보라색의 붉은 1.0, 0.75 및 0.96에 대한 1.14로 확장 설정 지역. </li><li> (소프트웨어의 &quot;사이드 스트림&quot;창에서) 테스트 정렬을 사용하여, 그 측면 스트림 패닝되지 않습니다 있는지 확인하십시오. 그들은 middl 충돌되도록 쪽 &quot;스트림&quot;윈도우에서, 각 사이드 스트림의 전압을 조정 슬라이더테스트 수집 튜브의 전자. 중앙 스트림 꽉 없으면 중앙 스트림을 제한하는 2 번째, 3 번째, 4 번째 드롭 설정을 조정. </li><li> 소프트웨어 ( &quot;사이토&quot;메뉴)에서 사이토 설치 및 추적 (CS &amp; T) 응용 프로그램을 시작합니다. </li><li> 제조업체의 지침을 사용하여 세포 계수기의 성능 특성 및 추적을 자동화하기 위해 350 μL 당 1 방울의 세포 계측기 설치 및 추적 구슬을 사용합니다. </li><li> CS &amp; T 응용 프로그램을 종료합니다. CS &amp; T 설정을 적용, 스트림 매개 변수는 여전히 안정적인 방울 breakoff 패턴을 할 수 있는지 확인하고 ( &quot;Breakoff 창&quot;에서) 제조 업체의 지침에 따라 스위트 스폿 (Sweet Spot) 버튼을 켭니다. </li><li> 형광 비드를 사용하는 드롭 지연 값을 최적화 (자재 표 참조). <ol><li> 홀더에 수집 튜브를 설치합니다. 정렬 블록 문을 엽니 다. &quot;사이드 스트림&quot;창에서 &quot;를 선택 한 후 전압을 켭니다시험 종류 &quot;및 서랍을 열고 수집 튜브에 액세스 할 수 있도록 흡인기 서랍 버튼을 클릭합니다. </li><li> 그들이 관의 중심으로 이동되도록 사이드 스트림을 최적화한다. 필요에 따라 값과 슬라이더를 조정합니다. </li><li> 정렬 블록 문을 닫고 중앙의 밝은 구슬 자리를 얻기 위해 마이크로 미터 다이얼을 조절해야합니다. 선택 취소 폐기물 서랍, 시험 종류 및 전압. 컬렉션 튜브를 제거합니다. </li><li> 제조자의 지시에 따라 드롭 지연을 최적화. <ol><li> 간략하게, 비드 바이알을 격렬히 흔들 PBS 0.5 ㎖에 구슬 1 방울을 희석. </li><li> 제조업체의 지침을 사용하여 소프트웨어에서 사용할 수있는 드롭 지연 실험 템플릿을 사용하여 드롭 지연을 설정합니다. 또한, 드롭 지연을 설정하는 자동 드롭 지연 기능을 사용합니다. </li><li> 형광 비드 튜브를로드하고 임계 속도가 될 때까지 3,000 ~ 4,000 이벤트 / 초를 유량을 조정한다. 정렬 정밀도를 설정하려면 &quot;초기&quot;최종LY &quot;정렬 레이아웃&quot;창에서 &quot;미세 조정&quot;에. 광학 필터를 선택하고 구슬을 정렬합니다. 100 %가 왼쪽으로 분류되어 있습니다 ~까지 드롭 지연을 조정합니다. 참고 :이 단계가 있는지 확인하는 것이 중요하다 측 스트림에 관심 종류의 세포. 구슬과 광학 필터는 100 % 액적 편차 부근 달성하는 데 사용된다. </li></ol></li></ol></li><li> 금융위원회 검출기 블록의 왼쪽 끝에 FSC 1.5 ND (중성 농도) 필터를 놓습니다. 2.00 μS에 창을 확장하고 ( &quot;사이토&quot;창에서 &quot;레이저&quot;탭에서) 1.00 FSC 영역 확장을 설정합니다. </li><li> 샘플 튜브를 넣기 전에, 응집을 피하기 위해 샘플 라인의 끝에 50 ㎛의 샘플 라인 필터를 배치했다. 이렇게하려면, &quot;사이토&quot;메뉴에서 &quot;샘플 필터 변경&quot;을 선택합니다. </li><li> 사이드 스트림 사이에서 패닝이없이 양호한 분리를 달성하고 polypropyle 달라 붙는 것을 방지하기 위해 세포를 샘플 유체의 조성물을 시험NE 튜브. <ol><li> 샘플 튜브를로드 편향 판을 켜고 서랍이 닫힌 &quot;테스트 정렬&quot;을 선택합니다. 분리가 너무 많이 패닝없이 발생하는 경우 측면 스트림 봐. 주 : 패닝 인해 샘플 버퍼에 높은 단백질 농도 쉽다. </li></ol></li><li> 외과 악기로 샘플 튜브를 넣습니다. 300 rpm의 교반과 샘플 4 ° C의 온도 샘플을 선택한다. &quot;취득 대시 보드&quot;에서 &quot;데이터를 획득&quot;을 선택합니다. </li><li> 필요한 경우 (3.0의 최대 유량) / 초 5000 이벤트 최대 적절한 이벤트 레이트를 달성하기 위해 시료를 희석. 분류 세포의 순도를 유지하도록 엄격하게 이러한 한계를 존중한다. </li><li> 분석 및 세포를 정렬 관심 인구 간섭없이 이물질을 제거하기 FSC 임계 값을 최적화한다. 대수 눈금에서 만들기 위해 30분의 530 필터와 광 승산기 튜브 (PMT)의 검출 전압을 조정반드시 전체 인구의 형광 신호는 스케일에 들어가고, 그 양의 모집단의 게이트 (도 1, 게이트 1). </li><li> 앞으로 캐터 영역 (FSC-A) / 사이드 캐터 지역 SYTO16 긍정적 인 인구 (SSC-A) 플롯을 생산하고 약 110 V 선형 규모에 FSC-을 조정하고, 약 150 V로 SSC- 매우 큰 세포와 세포 집합체를 제외하는 동안 로그 스케일의 모든 이벤트를 시각화합니다. </li><li> &quot;정렬 레이아웃&quot;창에서 &quot;정렬 정밀 모드&quot;설정 &quot;4 방향 순도&quot;에 (수율 마스크 : 0, 순도 마스크 : 32, 위상 마스크 : 0). 연속 정렬에 대해 &quot;대상 이벤트&quot;메뉴에서 &quot;연속&quot;을 선택합니다. </li><li> ( &quot;정렬 레이아웃&quot;창에서) 튜브에 해당하는 필드에 정렬하는 인구를 추가합니다. 높은 중간 주파수와 끝에서 낮은 주파수를 가진 사람들과 장소의 인구. 정렬하는 동안 2500 (V)의 전압 판을 설정 샘플 모음 (T)를 유지얼음에 ubes. </li></ol> 4. 셀 정렬 <ol><li> 즉시 정렬 전에, 둥근​​ 바닥 튜브를 이전에 코팅을 5 ml 폴리 프로필렌 50 μm의 필터를 사용하여 필터 세포. </li><li> 버퍼를 정렬 1-2 ㎖로 광범위하게 필터를 씻으십시오. </li><li> 그림 1에 설명 된 게이트 방식 다음 488 nm의 레이저를 갖추고 세포 분류기를 사용하여 정렬 고정 생식 세포는. 이전에 얼음 섹션 1에 코팅을 5 ml 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브의 정제 분수를 수집합니다. <ol><li> FBS의 100 ~ 200 μL가 튜브 벽에 정렬 된 세포의 부착을 방지하기 위해 수집 관에 보관되어 있는지 확인합니다. </li><li> SYTO16의 농도가 정렬 기간 동안 형광 변동을 방지하기 위해 포화되어 있는지 확인합니다. 정렬 그래픽 알렉사 488 형석 파라미터 (DNA 염색) 세포에서 염색 강도의 더 이상의 변화가 없을 때 SYTO16은 포화된다. 필요한 경우, 1 μl를 추가정렬 튜브 SYTO16은 포화에 도달한다. </li><li> 알렉사 플 루어 488 대 사건 번호 : 다음 매개 변수를 표시하는 그래픽의 총 이벤트를 표시합니다. </li><li> 도 1에 도시 된 바와 같이, 게이트 1 DNA 양성 염색 세포를 선택한다. <ol><li> 매개 변수로 FSC-대 SSC-를 사용하여 그래픽에 게이트 1 표시 셀 <ol><li> 그림 1에 켰을 때, 게이트 2 셀을 선택합니다. </li><li> 매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 FSC-A를 사용하여 그래픽에 게이트 2 표시 셀. </li><li> 그림 1에 켰을 때, 게이트 2 그래픽에 게이트 5 게이트 6 셀을 선택합니다. </li><li> 매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 488-W 알렉사 플 루어를 사용하여 그래픽에 별도로 게이트 5 게이트 6 표시합니다. </li><li> 선택 spermiogenesis는 게이트 (5) 그래픽에 1-9 정자 단계를 그림 1에 켰을 때, spermiogenesis는, 게이트 6 그래픽에 10-12 정자 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 디스플레이매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 FSC-A를 사용하여 그래픽에 게이트 1에서 세포 <ol><li> 그림 1에 켰을 때, 문 3 문 4 셀을 선택합니다. </li><li> 매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 488-W 알렉사 플 루어를 사용하여 그래픽에 별도로 문 3 문 4 표시합니다. </li><li> 선택 spermiogenesis는 게이트 3 그래픽에 13 ~ 14 정자 단계를 그림 1에 켰을 때, spermiogenesis는 게이트 4 그래픽에 15 ~ 16 정자 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

정자 세포는 항상 정액을 운반하는 상피 세포의 복잡성뿐만 아니라 체외 문화의 제한된 성공을 주어 연구에 도전하고있다. 수년에 걸쳐, 많은 접근법은 다양한 종에서 생식 세포가 개발되었다 정제한다. 퍼콜 또는 소 혈청 알부민 구배로 중력을 이용하여 침전 정화 기법은 일반적으로 그대로 생식 세포의 우수한 수율을 제공하지만, 이러한 감수 배체 세포 및 정자 10 일부 세포 유형 사이의 적절한 정의가 부족하다. 또한, 이러한 기술이 필요 성가신 시행 착오없이 재현하기가 어려운 렌더링 많은 실험실에 쉽게 사용하지 못할 수 있습니다 (종종 집에서 만든) 특수 장치.을 장치는 일반적으로 세포의 생존을 유지하기 위해 4 ℃에서 보관 될 때 이들 방법은 또한 시간 소모, 진동에 매우 민감하고 불편하다. 성공하면, 침전 방법 그러나 수백만 정제 라이브 C를 제공인구 당 ELL 학생. 그러나, 달성 될 수있는 셀 농축 로우 레벨은 거의 이상 80~90% 순도에 도달하지 않기 때문에이 기술의 주요 단점이다. 분자량...

반수체 원형 정자는 정자 형성(spermiogenesis)이라는 과정에 의해 정자로 분화합니다. 여기에는 편모 획득, 염색질 및 세포골격 리모델링, 핵 응축 및 대부분의 세포질 손실을 포함한 다양한 단계가 포함됩니다. 이러한 독특한 세포 사건은 수정에 적합한 온전한 게놈을 가진 성숙한 기능적 배우자를 생성하기 위해 미세하게 조절되어야 합니다. 정자 형성은 지금까지 신뢰할 수 있는 세포 배양 시스템이 프로세스의 여러 단계를 통한 진행을 지원할 수 없었기 때문에 체외에서 거의 연구할 수 없습니다. 더욱이, 실제 시험관 내 기술은 수율이 좋지 않습니다1,2. 생체 내에서, 정자 형성의 여러 단계를 통한 적절한 전환은 남성 배우자의 자연스러운 기능적 무결성에 매우 중요합니다. 분화 단계에 따른 정자류의 성공적인 정제는 정자 형성의 분자 특성화를 허용하기에 충분한 수준의 농축으로 수행된 적이 없습니다. 예를 들어, 정자 분화의 주요 단계를 정제하는 것은 발달 중인 아크로솜, 중간조각의 형성3, 세포 접합역학4, RNA역학5, 염색질 리모델링 과정6,7 또는 게놈 안정성8을 연구하는 데 특히 유용할 것입니다. 정자류의 정제는 점진적인 형태학적 변형, 알려진 단계별 외부 바이오마커의 부족, 독특한 모양과 크기로 인해 방해를 받았습니다. 
대부분의 수컷 생식세포는 DNA 염색과 ploidy(DNA 함량) 사이에 직접적인 관계를 나타내지만, 우리는 그러한 양의 상관관계가 더 이상 정자에 적용되지 않는다는 것을 알게 되었습니다. 이것은 정세관 절편이 다양한 정자 형성 단계에 걸쳐 DNA 염색의 다양한 강도를 보여준다는 초기 관찰에서 비롯됩니다. DNA 염색은 정자 형성 단계 1에서 7(둥근 정자)의 반수체 염색체 세트와 일치하지만, 핵 재편성 및 염색질 리모델링(정자 형성 단계 8)이 시작될 무렵 DAPI 또는 SYTO 16에서 형광 강도가 급격히 증가하여 핵 응축이 시작될 때 최고점에 도달하는 것을 관찰했습니다(정자 형성 단계 11-12). 핵의 응축 후 DNA 염색 강도는 정자화(spermiogenesis step 16)까지 감소합니다. 우리는 이것이 히스톤이 프로타민으로 대체되는 독특한 염색질 구조 전이의 형성과 관련이 있을 가능성이 있다고 추측했습니다. 따라서 우리는 정자류의 DNA 강도 변화를 주요 선택 매개변수로 사용하여 정자를 분리할 수 있는 신뢰할 수 있는 유세포 분석 방법을 개발했습니다.
간단한 유세포 분석 접근법은 겉보기 DNA 함량(SYTO16 염색), 크기 및 입도에 따라 고순도(95-100%)로 마우스 정자를 분리하는 것으로 설명됩니다. 정자는 4개의 개체군으로 분리됩니다. 정자 형성 단계 1-9, 10-12, 13-14 및 15-16. 정제된 정자(spermatids)는 유전학/게놈 분석뿐만 아니라 그룹9의 최근 간행물에 설명된 바와 같이 단백질체학 응용 분야에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>안락사 전 마우스 마취용</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>튜브 코팅용</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>분류 완충액 준비용</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>분류 완충액 준비용</td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>세포 고정용</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>DNA 염색</td></tr><tr><td>5ml 폴리프로필렌 원형 바닥 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>분류 된 세포 수집</td></tr><tr><td>15ml 폴리 프로필렌 원추형 바닥 튜브</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50ml 폴리 프로필렌 원추형 바닥 튜브</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>TEC4 마취 기화기</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>마우스 안락</td></tr>사 <tr><td>용 CO2 가스 탱크</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>마우스 안락사</td></tr><tr><td>용 O2 가스 탱크</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>마우스 안락 용</td></tr><tr><td>수제 마우스 가스 챔버</td><td></td><td></td><td>마우스 안락사 40</td></tr><tr><td>&micro; m 팔콘 셀 스트레이너</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m 샘플 라인 필터</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>세포 정착 Dynac</td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 &micro; m 필터</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488nm 레이저 euipped 세포 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop 형광 구슬</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>분류 버퍼: 1x PBS, 1mM EDTA pH 8.0, 25mM HEPES pH 7.0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS는 불활성화입니다. 새로운 솔루션 만들기, 0.22 &mu; m은 필터링하고 4°C로 유지합니다.</td></tr></tbody></table>

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

마우스 정자의 분화는 그대로 게놈과 수컷 생식 기능의 제조를위한 하나의 중요한 과정이 다음 세대로 전달 될 것이다. 지금까지, 이러한 형태 학적 변화의 분자 연구는 후속 분석을위한 spermatid 분화 이러한 중요한 단계의 적절한 분리를 가능하게하는 방법의 결여에 의해 방해되어왔다. 유동 세포 계측법을 사용하여 이러한 세포의 적절한 게이트에서 이전 시도 때문에 염색질 리모델링을받은 정자의 DNA 형광의 독특한 증가로 어려웠을 수있다. 이러한 관찰에 기초하여, 우리는 에탄올로 고정 마우스 정자 네 개체군의 재현성 정화를 허용 방식 계측법 단순 흐름의 세부 사항을 제공하는, 각각의 핵 리모델링 과정에서 다른 상태를 나타내는. 인구 농축 단계 특정 마커와 형태 criterions에를 사용하여 확인할 수있다. 정자 정제 게놈과 proteom 위해 사용될 수있다IC는 분석한다.

게이팅 전략 유동 세포 계측법에 사용 그림 1은 네 개의 순수 spermatid 인구를 정렬 유동 세포 계측법에 사용되는 게이팅 전략을 나타냅니다. 간단히, 긍정적 인 DNA 염색과 세포 (알렉사 플 루어 488-A)를 처음 크기 대 granulosity (SSC-A)를 보여주는 도트 플롯에 spermiogenesis 1. 정자가 12이 선택 단계들 게이트 (문 2)와 선택 (FSC 게이트 (1)로부터 -A) 그런 다음, spermiogenesis에서 정자 1-9 단계 및 spermiogenesis 10-12은 DNA 염색 강도의 변화에​​ 따라 서로 분리 될 수있는 단계 (게이트 (5, 6)). spermiogenesis에서 정자는 단계 13-14 및 15-16는 직접 D​​NA 염색 (알렉사 형석 488-A) 대 도트 플롯 나...

유세포 분석을 사용하여 마우스 정자에 대한 정렬 전략을 설명합니다. 정자류는 둥글게(정자형성 단계 1-9), 초기신장(정자형성 단계 10-12), 후기신장(정자형성 단계 13-14) 및 길쭉한 정자류(정자형성 단계 15-16)를 포함하여 4개의 매우 순수한 개체군으로 분류됩니다. DNA 염색, 크기 및 입도는 선택 매개변수로 사용됩니다.

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 마우스 정세포를 네 개의 뚜렷한 집단으로 분리하여 정자 형성 과정에 대한 분자적 연구를 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 염색질 모델링이 유전체 무결성에 미치는 영향과 같이 생식 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 교차 오염 없이 정자를 순수한 세포 집단으로 분리할 수 있다는 점입니다.우리는 하플로 파라미터(haplo parameters)의 염색질 리모델링 과정 중 DNA 염색 강도에서 중요한 변화를 관찰했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 세포 분류 전날, 1~2 mL의 열불활성화 FBS를 5 mL 폴리프로필렌 라운드 바텀 튜브와 15 및 50 mL 폴리프로필렌 원추형 튜브에 추가합니다. 그 다음, 회전 장치를 사용하여 4°C에서 하룻밤 동안 도치시켜 튜브를 천천히 코팅합니다.P 200 피펫을 사용하여 15 및 50 mL 튜브에서 잔류 FBS를 조심스럽게 따르고, 5 mL 튜브에는 세포 분리 당일 정제된 세포를 수집하기 위해 100에서 200 µL의 소량의 FBS를 남겨둡니다. 캡슐화된 테스트 조각을 500 µL의 분리 버퍼에서 잘게 다집니다. 그런 다음 끝을 자른 마이크로 피펫 팁을 사용하여 조직 파편을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.부드럽게 위아래로 피펫팅하여 세정관에서 생식세포를 씻어낸 후, 팁을 끼운 상태로 다시 씻어냅니다. 다음으로 40 micron 셀 스트레이너를 사용하여 파편과 덩어리를 제거하고, 여과액을 FBS가 코팅된 50 milliliter 원심분리관에 수집합니다. 필터를 소팅 버퍼로 한 번 세척하여 총 부피가 3 milliliters가 되게 하고, 여과액을 FBS가 코팅된 15 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다.그 다음 세포 현탁액 1mL당 16 µL의 EDTA를 세포에 첨가하고, 10 mL 피펫을 사용하여 저속 보텍싱을 하며 3배 부피의 얼음처럼 차가운 100% ethanol로 1분 동안 천천히 세포를 고정합니다. 고정 후 현탁액은 우윳빛으로 변합니다. 세포를 얼음 위에서 15분 동안 배양하며 가끔씩 도치 혼합합니다. 그 후 세포 현탁액을 원심 분리하고, 펠렛을 2 mL의 sorting buffer에 재현탁시킨 후, 분리 직전에 4 µL의 cyto 16 DNAD로 생식 세포를 염색합니다.세포를 50 micron 필터로 걸러 FBS가 코팅된 fax tube에 넣고, 1~2 mL의 sorting buffer로 필터를 충분히 세척합니다. 고정된 생식 세포를 488 nanometer 레이저가 장착된 세포 분석기(cell sorter)에 로드합니다. 그다음, Alexa fluor 488 영역에 따른 이벤트 수를 나타내는 히스토그램으로 전체 이벤트를 표시하고 DNA 염색 양성 세포를 게이팅합니다.그 다음, 이 게이트에서 선택된 세포들을 side scatter area 대 forward scatter area 도표로 나타내고 게이트를 지정합니다. 표시된 세포들에 대해, 게이트 처리된 세포들을 forward scatter area 대 Alexa fluor 488 area 도표로 나타내고 게이트를 지정합니다. 다시 한번, 이 게이트들을 개별적인 Alexa fluor 488 width 대 Alexa fluor 488 area 도표로 나타냅니다.정자 형성 과정의 1단계부터 9단계 및 10단계부터 12단계입니다. 이후 정자세포를 게이팅하여 분류함으로써 13단계부터 14단계 및 15단계부터 16단계를 수집할 수 있습니다. 정자세포는 첫 번째 게이트의 세포들을 EXOR 4 88 영역 플롯에 대한 전방 산란(forward scatter) 영역으로 표시하고 게이팅합니다.표시된 세포 집단입니다. 그런 다음 이 게이트들을 개별 Alexa Fluor 488 너비 대비 Alexa Fluor 488 면적 플롯으로 표시하고 게이트를 설정하십시오.단계 13에서 14 및 15에서 16까지는 정자 분리를 위한 과정입니다. 마지막으로 정제된 분획을 개별 FBS 코팅된 5 mL 라운드 바텀 튜브에 100~200 µL의 FBS와 함께 담아 얼음 위에 수집합니다. 이 이미지들에서는 유세포 분석으로 분리된 정자 집단의 DAPI 염색 결과가 나타나 있습니다.정자 형성 과정의 1단계부터 9단계까지의 정세포는 일반적으로 둥근 핵을 가지며, 정자 형성 과정에서 타원형으로 나타납니다. 9단계 정세포와 10단계부터 12단계까지 관찰되는 정세포는 길쭉한 갈고리 모양을 띱니다. 정자 형성 과정의 13단계부터 14단계 정세포와 15단계부터 16단계 정세포는 유사한 형태의 핵을 보이지만, DNA 염색 강도가 약간 다르기 때문에 유세포 분석기를 이용한 분류 과정에서 이러한 서로 다른 정세포 집단들을 식별할 수 있습니다.시연된 프로토콜을 따르면, 실험된 개별 S 집단의 순도는 95에서 100% 사이일 것으로 예상됩니다. 각 단계를 적절히 수행한다면 이 기술은 6~8시간 이내에 완료될 수 있습니다. 절차 전반에 걸쳐 항상 세포를 얼음 위에 유지해야 함을 기억하십시오. 이 절차를 따르면 서로 다른 정자 집단을 얻을 수 있으며, 이는 극성 변형 과정의 특성 분석이나 이러한 전이의 유전적 영향을 연구하는 것과 같은 분자 분석에 충분한 양의 시료를 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

효소 세제를 피 설치류 자료에서 고환 세포 현탁액의 기계적 준비를위한 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 매우 간단하고 빠르고, 재현성 및 흐름 정렬 및 RNA 추출에 적합한 좋은 품질의 세포 현탁액을 렌더링합니다.

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

STA-PUT 방법은 크기와 밀도에 따라 정자 형성 세포의 다른 인구의 분리 할 수​​ 있습니다.

STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리

감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

이 연구는 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 정제 된 배아 세포 집단을 얻는 방법의 표준화를 기술한다. Hoechst-33342 및 propidium iodide로 염색하는 기계적 고환 해리와 남성 생식 생물학의 비교 연구에서 폭넓게 응용할 수있는 FACS 분류법을 결합한 간단한 프로토콜입니다.

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

이 관 스쿼시 기술의 목표는 빠르게 세포 무결성을 유지 하면서 마우스 spermatocytes를 개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해입니다. 이 메서드와 spermatogenesis의 모든 단계의 학문에 대 한 수 있습니다 마우스 감수 분열의 연구에 대 한 다른 생화학 및 분자 생물학적 접근 함께 쉽게 구현할 수 있다.

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

이 기사는 남성 감수 분열에 대한 귀중한 모델인 복부 수술과 GSK923295의 고환 주사를 통한 CENP-E의 생체 내 억제를 보고합니다. 면역형광, 유세포 분석 및 투과 전자 현미경 분석을 사용하여 CENP-E 억제가 마우스 정자세포에서 염색체 정렬 불량 및 게놈 불안정성을 초래한다는 것을 보여줍니다.

In Vivo Inhibition, Immunofluorescence 및 Flow Cytometry를 이용한 정자 세포 내 Kinesin-7 CENP-E의 기능 평가

여기에서는 마우스에서 ROSI(round spermatid injection)를 수행하는 방법, 유망한 임상 응용 기술을 가진 기술이며 배아 발달의 기전을 조사하기 위한 유용성을 소개합니다.

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