가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

이 실험 절차의 전반적인 목표는 가변각 에피 형광 현미경(variable angle epi fluorescence microscopy)을 사용하여 식물 세포 표면에서 형광 표지된 단백질의 이동을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 단백질이 식물 세포 표면에서 어떻게 작용하는지와 같은 식물 세포 생물학 분야의 발전에 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 표지 단백질의 실시간 역학을 시각화할 수 있다는 점입니다. 실험 절차를 시작하기에 앞서.

제조업체의 지침에 따라 현미경의 레이저 센터링 및 포커싱을 교정하십시오. 그런 다음 대물렌즈 프리 라이트 패스를 사용하여 현미경실 천장의 중심을 찾고 해당 위치를 유색 씰로 표시하십시오. 다음으로, 대물렌즈로 천장을 조사하고 조사된 영역을 중심 위치로 이동시키십시오.

그 다음 레이저의 초점을 맞추고 레이저의 위치를 천장 중앙에 정밀하게 조정하십시오. 레이저의 중심 맞춤과 초점 조정은 가변각 에피 형광 현미경(VAEM) 관찰의 성공을 위해 매우 중요합니다. 사용자는 실험을 시작하기 전 현미경 제조사의 전문 인력으로부터 교육을 받아야 합니다.

현미경 준비가 완료되면, 76 x 26 mm 유리 슬라이드 중앙에 basal buffer 30 µL를 분주합니다. 그다음 해부 가위를 사용하여 7일 된 묘목에서 co leadin을 제거하고, 관찰면이 위로 향하게 하여 basal buffer 방울 위에 띄웁니다. 이어서 18 x 18 mm 슬라이드 중앙에 basal buffer 30 µL를 추가합니다.

커버 글라스를 덮고 커버 글라스를 뒤집습니다. 핀셋으로 커버 글라스의 한쪽 가장자리를 잡으면 표면 장력으로 인해 액적(drop)이 떨어지지 않고 유지됩니다. 완충액이 리드인(lead-in) 위에 놓이도록 반대쪽 가장자리를 유리 슬라이드 위에 올립니다.

그다음 커버 글라스의 가장자리를 슬라이드 위에 둔 상태에서, 액적이 올레인 샘플 바로 위에 오도록 위치를 조정한 후 커버 글라스를 덮습니다. 기포가 없다면 보풀 없는 티슈로 과잉 버퍼를 닦아내고, 준비된 시료를 즉시 현미경으로 옮깁니다.

명시야 조명을 사용하여 관찰할 세포를 선택합니다. 다음으로, 형광 단백질이 관찰되는지 확인하고 에피 형광 조명을 사용하여 세포 표면의 Z축 위치를 설정합니다. VAEM을 수행하려면 컨트롤러 박스를 사용하여 레이저 빔의 입사각을 조절합니다.

라이브 이미지를 주의 깊게 모니터링하며 서서히 조절하십시오. 처음에는 이미지가 흐릿하게 보일 것입니다. 레이저 각도가 증가함에 따라 VAEM 이미지는 덜 흐릿해지며, 최종적으로 선명한 이미지가 생성됩니다.

이 시점에서 레이저 각도 증가를 멈추십시오. 이제 레이저 입사각을 미세하게 조정하여 더 나은 이미지를 얻고, 필요에 따라 광학 및 이미지 센서 파라미터를 조정하십시오.

그 다음 상용 현미경 소프트웨어를 사용하여 다페이지 TIFF 이미지 파일 형식으로 동영상을 획득합니다. 여기에서 동영상은 STA 모델 세포 표면에서 GFP로 표지된 점들이 깜빡이는 모습을 보여줍니다. Fiji를 사용하여 GFP로 표지된 DOT의 체류 시간을 정량화하려면, 파일 열기 메뉴로 이동하여 획득한 다페이지 TIFF 파일을 엽니다.

직선 선택 도구를 사용하여 관심 있는 부위에 선을 긋습니다. 다음으로, image stacks dynamic res slice 플러그인을 사용하여 그래프 이미지를 생성합니다. 선의 위치가 바뀜에 따라 그래프 이미지도 동적으로 변경됩니다.

파일의 'TIFF로 저장' 메뉴를 통해 이미지를 TIFF 파일로 저장하십시오. 그다음 노이즈 감소를 수행하기 위해 '프로세스 필터'의 '가우시안 블러' 메뉴로 이동하여 크로노그래프 이미지에 가우시안 필터를 적용하십시오. 시그마 반경 파라미터는 필요에 따라 조정해야 합니다.

이미지 조정 임계값 도구를 사용하여 임계값 설정으로 신호 영역을 분할하고, 측정 세트 분석 메뉴를 엽니다. 다음으로, 측정 세트 창에서 바운딩 사각형을 체크하고 가능한 최소 픽셀 수를 선택합니다. 그런 다음 분석, 입자 분석 메뉴로 이동합니다.

관심 있는 점의 시간을 Y축을 기준으로 측정하고, 표시된 결과를 확인한 후 데이터 값을 보기 위해 매니저 상자에 추가하십시오. 마지막으로 결과 테이블 메뉴에서 파일, 다른 이름으로 저장을 선택하여 적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 점 이미지 지속 시간의 데이터 세트를 처리하십시오. 여기에서는 chm 그래프 분석으로 측정한 8개 edin 내 12개의 독립적인 보조 세포로부터 얻은 185개 GFP patrol one 점의 체류 시간이 그래프에 표시된 바와 같이 나타나 있습니다.

적합된 밀도 함수를 통해 대부분의 GFP patrol one 점들이 부세포에 2초에서 10초 사이로 머물렀으며, 정점은 약 3.5초였음을 확인하였습니다. 이는 부세포 표면에서 양성자 펌프의 빠른 엑소사이토시스와 엔도사이토시스가 일어남을 시사합니다. 이 비디오를 학습한 후에는 가변 각도 에피 형광 현미경을 사용하여 식물 세포 표면의 다양한 유형의 단백질 동역학을 시각화하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.