가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

이 절차의 전반적인 목표는 가변 각도 에피 형광 현미경 검사로 식물 세포 표면에서 형광 태그가 지정된 단백질의 움직임을 관찰하는 것입니다. 이 용기는 단백질이 판세포 표면에서 어떻게 작용하는지와 같은 식물 세포 생물학 분야의 발전에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 절차를 시작하기 전에 형광 공격 단백질의 실시간 역학을 시각화할 수 있다는 것입니다.

제조업체의 지침에 따라 현미경의 레이저 센터링 및 초점을 보정합니다. 그런 다음 대물 렌즈가 없는 광 경로를 사용하여 현미경 검사실 천장의 중심을 찾고 컬러 씰로 위치를 표시합니다. 다음으로, 대물 렌즈로 천장을 비추고 조명이 비춰진 영역을 중앙 위치로 이동합니다.

그런 다음 레이저의 초점을 맞추고 레이저의 위치를 천장 중앙으로 미세 조정합니다. 레이저의 센터링 및 포커싱은 성공적인 가변 각도 에피 냄새 현미경 또는 VAEM 관찰에 매우 중요합니다. 사용자는 실험을 시작하기 전에 현미경 회사의 전문 직원에 의해 교육을 받아야 합니다.

현미경이 준비되면 30마이크로리터의 기저 완충액을 76 x 26mm 유리 슬라이드의 중앙에 분배합니다. 그런 다음 해부 가위를 사용하여 7일 된 묘목에서 공동 리드인을 제거하고 관찰면이 위로 향하게 하여 공동 리드인을 기저 완충액 드롭에 띄웁니다. 다음으로, 18 x 18mm의 중앙에 30마이크로리터의 기저 완충액을 추가합니다.

유리를 덮고 덮개 유리를 거꾸로 뒤집습니다. 부드러운 표면 장력은 방울이 떨어지는 것을 방지하고 한쪽 가장자리에 핀셋으로 커버 유리를 잡습니다. 반대쪽 가장자리를 유리 슬라이드에 놓아 버퍼가 공동 인입 위에 오도록 합니다.

그런 다음 덮개 유리의 가장자리를 슬라이드에 유지합니다. 방울이 올레인 바로 위에 오도록 드롭의 위치를 조정합니다.ample 및 커버 유리를 떨어뜨립니다. 기포가 없으면 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 여분의 완충액을 닦아내고 즉시 제제를 현미경으로 옮깁니다.

명시야 조명을 사용하여 관찰할 셀을 선택합니다. 다음으로, 형광 단백질을 관찰할 수 있는지 확인하고 에피 형광 조명을 사용하여 세포 표면에서 Z축 위치를 설정합니다. VAEM을 수행하려면 컨트롤러 박스를 사용하여 레이저 빔의 진입 각도를 기울입니다.

라이브 이미지를 주의 깊게 모니터링하면서 점차적으로. 처음에는 이미지가 흐릿하게 보입니다. 레이저 각도가 증가함에 따라 VAEM 이미지의 흐림이 줄어들어 결국 선명한 이미지를 생성합니다.

이 시점에서 레이저 각도 증가를 중지하십시오. 이제 괜찮습니다. 더 나은 이미지를 얻기 위해 레이저 진입 각도를 조정하고 필요에 따라 광학 및 이미지 센서 매개변수를 조정합니다.

그런 다음 상용 현미경 소프트웨어를 사용하여 동영상을 다중 페이지 TIFF 이미지 파일로 획득합니다. 여기서 동영상은 STA 모델 셀의 표면에서 깜박이는 GFP 라벨이 지정된 점을 보여줍니다. 피지를 사용하여 DOT 체류 시간으로 표시된 GFP를 정량화하려면 파일 열기 메뉴로 이동하여 획득한 다중 페이지 팁 파일을 엽니다.

직선 선택 도구를 사용하여 관심 있는 쪽에 선을 배치합니다. 다음으로, 이미지 스택 동적 해상도 슬라이스 플러그인을 사용하여 그래프 이미지를 생성합니다. 선이 변경되면 그래프 이미지가 동적으로 변경됩니다.

파일 아래에 이미지를 TIFF 파일로 저장하고 tiff 메뉴로 저장합니다. 그런 다음 노이즈 감소를 수행하려면 프로세스 필터 가우시안 블러 메뉴로 이동하여 크로노그래프 이미지에 가우시안 필터를 적용합니다. 시그마 반경 매개변수는 필요에 따라 조정해야 합니다.

이미지 adjust threshold 도구를 사용하여 임계값을 설정하여 신호 영역을 분할하고 analyze set measurements 메뉴를 엽니다. 다음으로, 측정 설정 창에서 경계 사각형을 확인하고 가능한 최소 픽셀 수를 선택합니다. 그런 다음 analyze(분석) 아래의 analyze particles(입자 분석) 메뉴를 선택합니다.

Y축에 대해 관심 점의 시간을 측정하고 디스플레이 결과를 확인하고 관리자 상자에 추가하여 데이터 값을 봅니다. 마지막으로 결과 테이블 메뉴에서 파일, 다른 이름으로 저장을 선택하고 적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 도트 이미지 지속 시간의 데이터 세트를 처리합니다. 여기서, chm 그래프 분석에 의해 측정된 185 GFP 순찰 1점의 거주 시간은 8번째 에딘에 있는 12개의 독립적인 보조 세포에서 그래프와 같이 표시됩니다.

적합 밀도 기능은 대부분의 GFP 순찰 1 도트가 약 3.5초의 피크로 2초에서 10초 동안 보조 셀에 상주하는 것으로 나타났습니다. 이것은 보조 세포 표면에 있는 양성자 펌프의 빠른 exocytosis endocytosis를 시사합니다. 이 비디오를 작업한 후에는 가변 각도 에피 형광 현미경을 사용하여 식물 세포 표면에서 ary 유형 단백질 역학을 시각화하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.