포스트 컬럼 유도체 화 반응 흐름 고성능 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여

본 방법의 전반적인 목표는 반응 흐름 컬럼(reaction flow column)을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 후 유도체화(high performance liquid chromatography post column derivatization) 또는 PCD 방법의 효율성과 민감도를 향상시키는 것입니다. 이 방법은 HPLC 검출기에 대한 응답성이 낮은 화합물을 분석하는 제약, 생의학 및 환경 과학과 같은 분야의 핵심적인 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 반응 코일이 필요하지 않다는 점입니다.

컬럼 유출액과 유도체화 시약의 혼합이 기존 방법보다 더 효율적으로 이루어지기 때문에, 이 방법은 항산화제, 아미노산 및 페놀에 대한 통찰을 제공하는 데 사용되어 왔습니다. 또한 티올, 금속, 항생제 및 독소와 같은 다른 종류의 화합물에도 적용할 수 있습니다.

전체 시료가 유도체화되지는 않지만, 밴드 확장이 적기 때문에 유출 흐름 내 분석물의 농도는 기존의 컬럼 후 유도체화 분석보다 더 높습니다. 이 절차를 시작하려면, Line A에는 100% water를, Line B에는 100% methanol을 이동상으로 하여 HPLC 기기를 준비하고, 제조사의 요구 사항에 따라 펌프를 퍼징하십시오. HPLC 기기 구성 요소와 추가 유도체화 펌프를 설정하십시오.

그 다음, UV/VIS 검출기를 520 nanometers 파장에서 분석하도록 설정합니다. 반응 흐름(RF) 컬럼의 입구를 HPLC 장비에 연결합니다. 0.13 millimeter 내경의 15 centimeter 길이 튜빙을 사용하여 출력 주변 장치 포트를 UV/VIS 검출기에 연결합니다.

다음으로, DPPH 펌프 라인을 RF 컬럼 출구의 주변 포트에 연결합니다. RF 컬럼 출구의 사용하지 않는 주변 포트는 컬럼 스토퍼를 사용하여 막습니다. RF 컬럼의 출구 중앙 포트에 내경 0.13 millimeter인 15 centimeter 길이의 튜빙을 연결합니다.

HPLC 펌프의 유속을 100% methanol에서 1 mm/min으로 설정합니다. 그 다음, 100% methanol로 컬럼을 10분 동안 평형화합니다. 이 단계에서 DPPH와 methanol을 사용하여 0.1 mg/mL 용액을 준비합니다.

DPPH 시약이 들어 있는 플라스크를 10분 동안 초음파 처리합니다. 제조사의 요구 사항에 따라 준비된 DPPH 시약으로 DPPH 펌프를 퍼지합니다. 그 다음, 건조하고 깨끗한 용기 두 개를 준비하여 하나에는 "중심(central)", 다른 하나에는 "말초(peripheral)"라고 표시합니다. 두 용기의 무게를 정확하게 측정합니다.

중앙 포트에서 나오는 유출액을 "central"이라고 표시된 용기에 1분 동안 수집합니다. 중앙 포트 용기의 무게를 다시 측정하여, 중앙 포트로부터 흐른 유체의 무게를 계산합니다. RF 컬럼의 주변 포트에 연결된 UV/VIS에서 나오는 유출액에 대해 이전 단계들을 반복합니다.

말초 포트 용기의 무게를 계산하십시오. 다음으로, 중앙 및 말초 포트에서 나오는 유량의 백분율을 계산하십시오. 유량 비율이 정확해질 때까지 이전 단계들을 반복한 후, DPPH 펌프의 유량을 0.5 milliliters per minute로 설정하십시오.

분석이 완료되면 유도체화 시약 펌프의 흐름을 중단하십시오. DPPH 시약 펌프 라인을 주변 포트에서 제거하고 포트를 마개로 막으십시오. 컬럼을 보관할 이동상으로 평형화하며, 이동상이 1 mm/min의 속도로 10분 동안 컬럼을 통과하도록 하십시오.

그 다음, HPLC 장비의 버블 페이즈 펌프의 흐름을 중단하십시오. 마지막으로, DPPH 시약을 메탄올로 교체하고 추가 펌프를 퍼지하십시오. 일반 PCD와 RF-PCD 장비를 모두 사용하여 DPPH 라디칼로 유도체화한 리스트레토 커피 샘플의 두 가지 크로마토그램이 여기에 제시되어 있습니다.

RF-PCD 및 기존 PCD 모드 모두에서 분석된 각 아미노산의 계산된 정량 한계와 검출 한계가 여기에 나열되어 있습니다. 기존 PCD 방법, RF-PCD 방법 및 RF-PCD 방법의 유도체화되지 않은 스트림을 사용하여 분석한 4가지 아미노산의 크로마토그램이 여기에 표시되어 있습니다. 기존 PCD와 RF-PCD 방법을 모두 사용하여 얻은 glycine 및 leucine 피크 신호의 비교 결과가 여기에 표시되어 있습니다.

기존의 PCD 방법, RF-PCD 방법, 그리고 RF-PCD 방법의 비유도체화 스트림을 사용하여 분석했을 때의 트립토판 피크 너비를 비교한 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 유도체화 계획에 반응하는 성분과 반응하지 않는 성분이 모두 포함된 21가지 성분의 테스트 샘플을 분리, 유도체화 및 검출하였습니다. 비교를 위해 동일한 혼합물을 유도체화하지 않은 상태로 분리하고 검출하기도 하였습니다.

RF-PCD 컬럼을 사용하여 유도체화한 para-Cresol과 유도체화하지 않은 para-Cresol의 피크 모양 비교 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 이 기술을 숙달하면 기존의 컬럼 후 유도체화 분석과 동일한 시간 내에 설정할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 규정된 유속 비율을 최대한 엄격하게 준수하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 OPA, ninhydrin 또는 halogen과 같은 다른 컬럼 후 유도체화 시약을 사용하여 다른 화합물을 분석할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 반응 흐름 컬럼을 설정하고 조정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.