Name: 병렬 세그먼트 흐름 열 조정과 멀티 플렉스 감지 활성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 배우세요 병렬 세그먼트 흐름 크로마토그래피 컬럼 조정법을 활용한 멀티플렉스 검출 기술입니다. 복잡한 혼합물 샘플의 화학적 특성과 생리활성을 신속하게 분석하여 정품과 위조품을 구분하는 데 활용할 수 있습니다.

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이 작업은 UWS와 ThermoFisher Scientific의 지원을 받았습니다. 저자 중 한 명(DK)은 Australian Postgraduate Award 수상을 인정합니다.

참고 :이 프로토콜은 다중 검출을위한 다중 검출기와 결합 된 HPLC 시스템에 PSF 열을 사용하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 독자를 가정하는 크로마토 그래피 및 다양한 HPLC 검출 방법에 대한 기본 지식과 경험을 가지고 작성되었습니다. 주의 : (메탄올, 즉 MSDS)를 사용하기 전에 모든 재료 및 시약에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 용매 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 용리액을 처리 할 때 모든 적절한 안전 관행의 사용을 확인합니다. HPLC, 분석 균형과 검출기 계측 공학 컨트롤의 적절한 사용을 보장하고, 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발)의 사용을 보장합니다. HPLC 기기의 1. 설치 <ol><li> LIN 초순수 (예, 100 % 밀리 Q 물)를 가진 HPLC 기기를 준비전자의 모바일 위상 라인 B에 대한 100 % 메탄올 제조 업체 요구 사항에 따라 펌프를 제거. 사용되는 검출기 중 하나가 MS를하는 경우는, 여기로, 두 이동상 A와 B로 0.1 % 포름산을 추가 </li><li> 검출기 및 열 사이의 데드 볼륨을 최소화하기 위해도 2에 도시 된 바와 같이 HPLC 쓸모 요소 및 검출기를 설정한다.이 칼럼에 대해 검출기의 편리한 배치를 필요로한다. HPLC 시스템 구성의 유연성이 바람직하다. </li></ol> UV-VI와 MS 검출기 2. 설치 <ol><li> 관심의 샘플 (예를 들어, 280 ㎚)에 따라 원하는 파장의 UV-마주 검출기를 설정합니다. </li><li> 전체 검사 검출 방법을 이용하여 이온 총 개수 (TIC) 분석을위한 양성 모드에서 MS 검출기를 설정한다. 따라서 다음과 같은 파라미터를 조정할 MS : 증발기 온도를 500 60 유닛의 속도, 보조 가스 유동 설정 ° C, 모세관 온도 350 ° C, 시스 가스40 5 부에서의 가스 유동 및 분무 3.5 kV의 전압을 스윕. 이러한 설정은 분석 시료에 따라 특정 사용자 요구 나중에 조정할 수있다. </li></ol> DPPH • 시스템 감지기의 2,2- 디 페닐 -1- 피 크릴 급진적 (DPPH •) 시약 설치 3. 준비 <ol><li> DPPH • 25 mg의 무게 및 부피 플라스크에 메탄올 250 ㎖에 용해. </li><li> DPPH • 시약에 포름산의 250 μl를 추가합니다. 빛에 노출되는 것을 방지하기 위해 호일 플라스크 커버. </li><li> 10 분 동안 DPPH • 시약을 함유하는 플라스크를 초음파 처리. </li><li> 제조업체의 요구 사항에 따라 제조 된 DPPH • 시약 DPPH • 펌프를 제거. </li><li> T-조각의 입구에 펌프 라인을 연결하여 그림 2에 따라 DPPH • 시스템을 설정합니다. </li><li> 토륨 100 μL 반응 코일을 부착T 피스의 E 출구와는 검출기 반응 코일의 다른 쪽 끝을 연결. </li><li> 및 열 히터에 반응 코일 싸는 60 ° C로 컬럼 히터 온도를 설정한다. </li><li> 520 nm의 DPPH • 자외선 - 마주 검출기를 설정합니다. </li></ol> PSF 열 4. 설치 <ol><li> HPLC 기기에 PSF 컬럼의 입구를 연결합니다. </li><li> 0.13 mm의 ID 튜브의 15cm 길이를 사용하여 MS 검출기에 중앙 포트를 연결합니다. </li><li> 0.13 mm의 ID 튜브의 15cm 길이를 사용하여 자외선 마주 검출기에 주변 포트를 연결합니다. </li><li> 0.13 mm의 ID 튜브의 15cm 길이를 사용하여 DPPH • 탐지 시스템의 T-조각에 다른 주변 장치 포트를 연결합니다. </li><li> 열 스토퍼를 사용하지 않는 주변 장치 포트 블록. </li><li> 분당 1ml의 HPLC 펌프의 유량을 가지고 -1 100 % B에서 행 - 100 % 메탄올 (0.1 % 포름산). </li><li> 100 % 메탄올 모바일 산도와 열 평형4.6 밀리미터 (내경) x 250mm 길이 컬럼에 대해 20 분 동안 ASE. 이 시간은 사용자가 이용할 수있는 다른 컬럼의 사이즈에 따라 스케일링된다. </li></ol> 5. 멀티 플렉스 검출을위한 PSF 열 조정 <ol><li> 적어도 두 개의 빈 수집 용기를 사용하여 분석 저울 (DPPH • 검출기 용 검출기 UV-비스 하나에 접속 포트 당 하나)의 질량을 측정한다. </li><li> 두 개의 사전 무게 수집 용기 (5.1)에 UV-VI와 DPPH • 포트에서 이동상를 수집합니다. 수집에 대한 기간을 기록한다. 각각의 용기에 용매의 적어도 500 mg의를 수집합니다. </li><li> 수집 용기를 달아 이동상의 질량을 결정한다. 0.791 g -1 ml의 메탄올 농도를 감안할 때, 각 포트로부터 수집 이동상 체적을 결정한다. </li><li> 차이에 의해, 즉, 공칭 펌프 세트 유량 마이너스 DPPH • 통한 유량 및 UV-비스 디텍R 흐름 포트, MS 검출기 유속을 결정한다. 총 유량의 비율로 각각의 유동 비율을 표현한다. 주의 : 이상적으로, 유동 비율은 : MS는 총 유량의 18 %되는, UV-비스 22 %로, DPPH • 검출기 60 %. </li><li> 그렇지 않으면, 검출기 UV-비스에 배압을 변경함으로써 유량 비율을 조절한다. UV-비스로 되돌아가 너무 높은 경우, 예를 들어, UV-비스 검출기의 콘센트에 0.13 mm 아이디 튜브 15cm 섹션을 추가 첨가하여 비중을 감소시킨다. 그런 다음 5.5 단계 5.1를 반복합니다. </li></ol> 6. 최종 설치 조건 <ol><li> DPPH • 검출기에 연결된 배출구를 빠져 나가는 동일한 유량 DPPH • 시약 펌프의 유량을 설정한다. 참고 : UV-마주 다중화 PSF 열, DPPH •와 MS는 이제 분석을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+a+new+concept+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology%3A+Parallel+segmented+outlet+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%2C+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li>
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<li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li>
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</ol>

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이 연구는 특성화 및 다중 검출 병렬 분할 흐름 (PSF) 컬럼을 사용하여 HPLC를 사용하여 커피의 프로파일을 포함한다. PSF 열을 다중화 HPLC는 종래의 다중 검출 프로세스를 사용하여 소요 시간의 분획 내에 분자 특정 정보의 큰 정도를 획득하는 동안 샘플의 데이터의 복잡도를 감소시킴으로써 키 화학적 실체의 특성화 및 식별을 가능하게한다. PSF 열은 멀티 플렉스 검출을위한 플랫폼을 허용하지만, 단지 추가적인 데드 볼륨없이 튜브 모두 파괴 및 비파괴 검출기의 조합. DPPH •, UV-VI와 MS (TIC)는 에스프레소 커피의 분석을 위해 다중화했다. 4 포트 PSF 열은 세 개의 다른 검출기를 이용하여 커피 다중화 분석에 이용 하였다. PSF 열 배출구의 중앙 포트 THRE의 MS 검출기와 접속 된 두주변 E 포트 DPPH • 검출 시스템 또는 UV-비스 검출기 하나에 접속 하였다. 세 번째 사용 가능한 주변 ...

활동 흐름 기술 열 활성 플로우 기술 (AFT) 크로마토 그래피 컬럼은 최근 흐름 이질성 1-6과 관련된 분리의 비 효율성을 극복하기 위해 개발되었고, 또한 다중 검출을 가능하게 할 수 있습니다. 이 특정 통신 우리의 세부 사항에 병렬의 작동 과정은 다중 검출과 흐름 (PSF) 열을 분할. PSF 열의 키 기능적 장점은 : (1) 칼럼 베드의 방사상 중심 영역으로부터의 흐름은, (2) 검출 수단에 의해 처리되어야하는 이동상의 부피 유량의 주연 또는 벽 영역으로부터 격리 소스가 감소되고, (3) 검색 소스 각각 검출 프로세스를 통해 검출 지연을 주입하거나,이어서 포스트 칼럼 유동 스트림 7,8의 분할을 필요로하지 않고 샘플 정보를 확장 다중화 될 수있다. 수 PSF 칼럼의 디자인의 핵심 기능다중 검출 dvantage은 새로운 출구 피팅 및 프릿 조립입니다. (1) 기존의 컬럼에 비해 AFT 컬럼의 사진도. 이 분할 프로세스는 포스트 칼럼 유동 스트림 분할과 동일하지 병렬 분할 흐름 컬럼을 사용하여 얻어지는 것을 이해하는 것이 중요하다. 포스트 칼럼 흐름 스트림 (즉, 축 방향으로), 이에 따라, 각각의 흐름 스트림이 효율 및 민감도에 대한 동일 균등 샘플링 꼬리의 말단에 전연으로부터 샘플 전체 대역을 분할; 감도의 크기함으로써 분할 수에 의해 분할된다. PSF 그러나, 분할 프로세스 샘플 밴드 반경 방향, 축 방향하지. 이와 같이, 중앙 포트 샘플 피크 정점 - 피크의 가장 농축 영역. 피크가 확산 미행 지역에 따라 희석되지 않기 때문에, 여기에 감도는 최고입니다. 주변 포트에서 용출 샘플은 CENTRA에서만큼 효율적이지 않다밴드가 다소 축 방향으로보다 반경 샘플링되기 때문에 L 존하지만, 피크의 폭, 즉 축 방향으로 포스트 칼럼 분할 피크 분할 샘플링 프로세스의 경우보다 좁다. 따라서 농도 의존적​​ 검출기 감도가 감소되지 않습니다. PSF 열에서 출구 피팅 다중 출력 포트를 포함하고, 피팅이 단부의 내측에 환형 프릿이 수납된다. 출구 프릿 채널의 바깥 지​​름 부는 상기 주변 또는 벽 영역 출구 흐름 포트를 통해 칼럼 유출하면서이 환형 프릿 채널의 내부 부분은, 반경 방향 중심 유출구를 통해 칼럼 유출. 출구 프릿의 내측 및 외측 부분은이 흐름 영역 (2) 사이의 교차 흐름을 방지하는 불 투과성 배리어에 의해 분리된다. 이러한 설계의 결과로 칼럼 베드를 통해 중앙 방사상 유동 스트림 벽 영역 인 흐름으로부터 분리열을 IDE. 이들 두 영역에서의 흐름의 상대적인 부분은 분리 효율이나 검출 감도와 같은 열 기술의 다양한 기능적 측면을 최적화하기 위해 압력 관리를 통해 거의 모든 원하는 비율로 변할 수있다. 본질적으로, 이러한 설계는 효과적으로 더 좁은 내부 지름을 갖는, 큰 포맷 칼럼 &#39;가상&#39;항목에서 설정 한 칼럼 베드 이질성과 벽 효과 9,10 극복 진정한 벽없는 열과 그에 열 함수. PSF 컬럼의 주요 이점은 열 효율, 감지 소스 (S) 및 멀티 플렉스 검출을 가능하게하기위한 용매의 최소화 처리의 개선이다. 그러나, 추가적인 이점이 어떤 대역의 테일링 및 향하고있는 영역이 전체적으로 용출로부터 제거되기 때문에 용출 또는 검출에 용질을 프로파일 있다는 것은 달리 동일한 S 관찰되는 것보다 높은 농도로 존재채용 분할 비율에 따라, 종래의 칼럼에 주입하고 집중 하중 olute. 결과적으로 자주 PSF 컬럼 2 실시 분리 용 신호 강도의 증가가 관찰된다. 사실, 분할 비율은 네 개의 출력 포트 각각으로부터 흐름 종료 중 25 %, 자외선 (UV) 검출을 통해 관찰 된 신호 강도가 종래을 사용하여 알 수있는 바와 같이 동일한 신호 강도가 거의 보여 지도록 조정하면 이동상의 전체 (100 %) 7 열 분석된다. 또한, 중앙 및 벽 유동 출구 영역 사이의 비 미세 조정은 열 효율이 최적화 될 수있다. (1) 유량 (2) 분할 비, 및 (3) 용질 고정 계수 : 열 효율의 향상이 이러한 효율성 향상은 세 가지 요인의 함수이기 때문에, 하나의 값을 명시 할 수 없다 AFT 컬럼을 사용하여 관찰 . 그럼에도 불구하고, 효율 이익은 전환 수에 비해entional 열은 거의 항상 관찰하고, 이러한 이득은 때때로 이론적 플레이트 1,2- 수의 100 % 이상이다. 튜닝 기능은 분할 비율은 분석 효과적으로 &#39;가상&#39;칼럼의 직경을 조정할 수 있으며, 이는 검출 처리와 관련하여 중요한 인자이다. 분할 비율은 방사상 중앙 출구 포트로부터 용출 이동상 21 % 인 경우, 예를 들면, 가상 2.1 mm의 내부 직경 (ID) 열은 실제 4.6 mm ID 열에서 확립된다. 이러한 조건 하에서, 가상 2.1 mm ID 열은 유량에 따라, 종래의 2.1 mm ID 열보다 70 % 이상 더 클 수있다 효율성 및 용질 고정 인자 10 행한다. 멀티 플렉스 검출을 위해 사용되는 전류 PSF 컬럼 디자인은 4 포트는 출구 피팅 포함하지만, 열이 장착 될 수있는 2 포트는 최종 피팅 또한, 그러나,이 검출 t 제한두 검출기 오. 그 네 검출기 다중화 검출 범위를 넓히는 4 포트 출구 PSF 컬럼에 동시에 연결될 수를 제외하고이 열의 기본 동작은, 그러나, 동일하다. 이외에도 전후 열의 결합 튜브에서 유일한 추가적인 요구 PSF 열을 주변 출구 포트에 접속 될 수있는 튜빙, 각 튜브를 통과하는 이동상의 양을 측정 할 수있는 수단이되는 동작하도록, 일반적으로 질량 측정 또는 체적 측정 중. 튜닝을 용이하게하기 위해서, 모든 출구 유동 튜브의 내경은 동일해야한다. 둘레 방향 및 반경 방향 중앙 배출 포트 사이의 유동 비율은 단순히 끼워 주연 출구 또는 방사상 중앙 배출구에 호스 포스트 검출기의 길이에있는 튜브의 길이를 변화시킴으로써, 압력 관리의 사용을 통해 변경된다. 멀티 플렉스 감지 PSF 열을 사용하여 </stroNG&gt; PSF 열의 중요한 장점은 출구 배출 포트들의 각각은 다중화 따라서 검출을 가능하게하는 검출 소스에 직접 접속 될 수 있다는 것이다. 잘 설계된 검출 시스템에 다중화 검출 단일 분석 시료 내의 요소의 특성에 관해서 상당한 정보를 제공 할 수있다. 중요한 파괴 및 비파괴 시험 검출 지연없이 정확히 동시에 수행 될 수있다. 이것은 구성 요소가 UV 및 / 또는 질량 분광법 (MS) 검출로 응답 7,11 용출 관찰하여, DPPH • 시약을 사용하여 실시 예, 산화 방지제를 들면, 절대 할당을 허용한다. 따라서, 네 개의 독립 탐지기 네 출구 포트 중 통해 각 검출기에 관한 흐름의 적절한 부분들과 동시에 동작 할 수있다. 이들 포트를 통과하는 유동이 용이 검출기에 도달하는 모든 용질의 양을 조절할 수 있기 때문에 적합하도록 조절 될 수있다주어진 소스 검출기의 감도. 그것은 가장 효율적인 용질 이주 방사상 중앙 출구 포트를 통해 관측되는 점에 유의해야한다. 주변 각 포트에는 각 포트를 통해 25 %로 설정하면, 약간 덜 효율적인 기존의 열보다 동등한 분리 효율을 제공합니다. 이와 같이, 이것은 정량적 검출기 방사상 중앙 출구 포트에서 샘플을 분석하도록 설정하는 것이 중요하다. 다중화 검출 목적 PSF 열을 설정할 때 효율적이고 높은 품질의 결과를 달성하기 위해 만들어 질 필요 사항들이있다; 즉, 각 포트에 대한 튜브의 크기이며, 선택 검출기 및 유량 조정의 유형에있는 포트. 각 포트에 대한 튜브 치수 크로마토 그래피 후 컬럼 튜브의 길이가 분리 효율과 성능에서 중요한 역할을한다. 대형 마약 단속반검출기 열 콘센트에서 길거나 넓은 ID 튜브의 결과로 D-볼륨은 효율성, 해상도와 감도의 손실이 발생할 것입니다. 다중화의 이점을 제공하는 반면 효과적인 분리를 제공하는 최대 전위를 달성하기 PSF 열을 설정할 때, 따라서, 적절한 배관 사이즈가 이용되어야한다. 감지기 포트 그림 2는 다중 검출 (자외선 - 가시 (U-비스), 질량 분석기 (MS)와 2,2- 디 페닐 -1- 피 크릴 (DPPH •) 검출)의 예를 들어 설정의 그림입니다. 그림 중앙 포트 DPPH • 반면, MS 검출기에 부착되고 UV-비스 검출기 주변 포트에 연결되어 도시한다. MS는 세 가지의 가장 민감한 검출기 때문에, 중앙 배출구로부터 지시되었다이 검출기에 흐른다. DPPH • 감지으로 presenc에 선택적입니다산화 방지제의 전자,이 검출기에 흐름, 가장 민감하고 밴드 폭이 넓어에 가장 관대은 주변 포트에서 지시되었다. UV-비스 2 차 &#39;일반&#39;검출기, 그래서 제 주변 포트에서 지시 된이 검출기에 흐른다. 흐름 조정 튜브가 적절한 검출기 포트로부터 연결되면, 각각의 검출기로부터 나오는 흐름은 필요한 양으로 조정할 수있다. 각 검출기로부터 나오는 흐름의 양을 측정하는 간단한 방법은 주어진 기간에 걸쳐 각각의 포트를 통해 용출 이동상의 양을 계량한다. 백분율 흐름에 따라서 결정될 수 있으며, 유동 비율은 단축 또는 적절히 선택 검출기 요구 사항에 맞도록 검출기에 출구 라인에 연결된 호스를 길게하거나 조정할 수있다. 다른 탐지기의 예를 들면, 플로우 셀, 유동의 다양한 요구를 가지고형광 검출기 (FLD)는 유동 속도가 제한되지 않으며, 치료는 플로우 셀의 과압을 방지하기 위해주의해야한다. 따라서 FLD를 통해 흐름의 제어는 일반적으로 다른 검출기에 걸쳐 압력 강하 및 유량의 나머지 다음 FLD 통과를 조정함으로써 달성된다. 전달되는 유동의 양에 민감한 검출기 MS이다. 일반적으로, 현재의 하이 엔드 질량 분석기 용이 약 1~1.5 ㎖ / 적당히 수성 이동상 분을 처리 할 수​​있다. 이 유량 위, 소스의 홍수는 MS가 작동 할 수 있습니다. 그러나, 대부분의 질량 분석기에서 검출 감도가 낮은 흐름 속도를 사용하여 이득되고; 따라서 PSF 흐름 분할 기능은 MS 검출과 관련된 애플리케이션에 매우 유용하다. 높은 열 체적 유량하지만 MS 검출기로 운반 저용량 부하와 함께, 이용 될 수있다. MS 검출기의 조정 흐름은, 그러나, 이전의 압력 강하를 조절함으로써 이루어질 수 있어야MS 검출기보다는 포스트 MS. 압력이 용이 부적절한 데드 볼륨을 추가하지 않고 조정될 수있다 여기 좁은 보어 튜빙 (0.1 mm의 ID)의 사용은 매우 유용하다. 검출기의 유형에 분할 비의 조정을 따라 전 또는 후 어느 검출기를 수행 할 수있다. 이러한 UV-비스를 사용하는 등의 비파괴 검출기는, 유동 비율을 측정 한 후 검출기를 조정하면된다. 단일 검출기 파괴가 설정된 다중화에 사용되는 경우 유동 비율은 다시 다른 포트 유동 비율에 대해 계산함으로써 결정된다. 시약 기반 검출기는 DPPH •로 사용되는 경우, 유동 비율은 시약의 첨가없이 포스트 검출기를 측정한다; 둘 이상의 파괴 검출기가 사용된다면, 그때 유량비 미리 검출기 측정된다. 인식 추가 계측, 이러한 DPPH • 필요할 수 있습니다 시스템, 흐름을 바꿀 수 있습니다 여분의 시스템 압력이있을 것이다백분율 일단 검출 시스템에 부착. 따라서,주의 깊은 고려가 파괴 검출기의 시스템 압력, 유량 비율을 조정 사전 검출기에 지불해야한다. 상관없이 임의의 포트를 통해 설정된 유량의 비율의 정량 정보는 적절한 표준화 통해 얻어 져야한다. 유량비가 설정되면, 그러나, 그들이 견고하고, 심지어 그들이 구배 용출 조건하에 7 변경하지 않는, 이 원고를 동반 상세한 비디오 프로토콜은 검출 다중화 모드에서 PSF 열 기능을 사용하고 조정하는 방법을 보여하기위한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>HPLC 기기</td><td></td><td></td><td>: 다중화 검출을 위해 선택되는 여러 검출기. 선택한 검출기에는 추가 기기(예: 와 같은 펌프가 필요할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>병렬 분할 흐름 HPLC 컬럼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>정의되지 않음</td><td>곧 상용화</td></tr><tr><td>예정 메탄올</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>PEEK 튜빙</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>다양한 길이 및 ID</td></tr><tr><td>컬럼 스토퍼</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>: 사용하지 않는 주변 장치 포트를 차단합니다.</td></tr><tr><td>PEEK 튜브 커터</td>, <td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 분석 저울,</td><td>모든 브랜드</td>, 모든 브랜드<td></td><td></td></tr>, 스톱워치, <tr><td></td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>용리액 수집 용기,</td><td>모든 브랜드</td><td></td>의 <td>1-2ml 샘플 바이알을 용리액 수집 용기로 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

병렬 세그먼트 흐름 열 조정과 멀티 플렉스 감지 활성화

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology(AFT)는 유동 불질성을 극복하여 효율성과 감도 측면에서 분리 성능을 높이고 multiplexed detection을 가능하게 하도록 설계된 새로운 형태의 컬럼 기술입니다. 이러한 형태의 AFT는 병렬 세그먼트 흐름(PSF) 컬럼을 사용합니다. PSF 컬럼 배출구 엔드 피팅은 2개 또는 4개의 포트로 구성되며, 최대 4개의 검출기를 연결하도록 다중화할 수 있습니다. PSF 컬럼은 다중화 검출을 위한 플랫폼을 제공할 뿐만 아니라 추가 데드 볼륨 튜브 없이 파괴 및 비파괴 검출기를 동시에 결합할 수 있습니다. 각 포트를 통과하는 유량은 특정 감지기의 요구 사항에 맞게 압력 관리를 통해 조정할 수도 있습니다. PSF 컬럼을 사용하여 다중화 검출을 달성하기 위해 최적의 분리 성능과 결과 품질을 보장하기 위해 제어할 수 있는 여러 파라미터가 있습니다. 즉, 각 포트에 대한 튜브 치수, 각 유형의 검출기에 대한 포트 선택 및 유량 조정입니다. 이 프로토콜은 멀티플렉스 검출 모드에서 작동하는 PSF 컬럼을 사용하고 조정하는 방법을 보여주기 위한 것입니다.

다중화 HPLC 분석 PSF 모드 (도 1)에 AFT 컬럼을 사용하여 수행하고,도 2에 도시 된 바와 같이 설정 하였다. 설정이 유형의 커피 샘플 전체에 UV-VI를 DPPH • 및 MS를 사용하여 동시에 분석하도록 허용 이온 수 (TIC) 모드. 도 3에 도시 된 바와 같이 크로마토 동시에 기록 되었기 때문에, 체류 시간의 조정에 기초하여 TIC 응답 - ​​응답 DPPH • 커피 시료의 화합물은 다음 쉽게 UV-VI와 MS까지 정합 될 수있다. 긍정적 인 응답은 MS-TIC 검출기에서 본 어디에, 피크 분자량은 DPPH • 피크의 체류 시간은 표에게. 1리스트를 기록하고, UV-VI와 / 또는 MS에 이러한 피크의 반응시켰다 따라서 분자 질량 제공 검출기. AF 허용 다른 탐지 프로세스 사이의 피크를 일치의 용이성복잡한 샘플에 대한 검사 및 특성...

여기에서는 다중화 검출을 가능하게 하는 병렬 분할 유동 크로마토그래피 컬럼의 작동 및 튜닝을 위한 프로토콜을 제시합니다.

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

본 HPLC 절차의 전반적인 목표는 병렬 분절 흐름 컬럼을 조정하여 다중 검출이 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 건강 및 웰빙, 환경 과학, 법과학, 그리고 바이오 발견과 같이 복잡한 시료 분석이 필요한 모든 분야의 핵심 질문에 답을 제공합니다. 이 기술은 종합적인 시료 분석을 가능하게 하는 동시에, 복잡한 혼합물 내 물질의 화학적 및 생물학적 활성 특성에 관한 정보를 제공합니다.다중 검출 프로토콜을 통해 신속한 분석 또한 가능합니다. 이 방법은 커피나 와인과 같은 복잡한 혼합물의 화학적 지문을 정의하는 전략 수립을 가능하게 하여, 제조사가 자사 제품과 저가의 모조품을 구별할 수 있도록 합니다. 초기에는 정확한 분석을 위해 전체 시료를 단 하나의 검출기로만 보내지 않는 방식이 생소하게 느껴질 수 있습니다.하지만 각 흐름 스트림 내의 분석물 농도는 기존 컬럼의 전체 흐름 스트림보다 높습니다. 우선, 이동상 A와 B로 각각 100%UE water와 순수 methanol을 사용하여 HPLC 장비를 설정하십시오. MS 검출기를 사용하는 경우, 두 이동상 모두에 0.1%formic acid를 첨가한 후 제조사의 지침에 따라 HPLC 펌프를 퍼지하십시오.제조사의 지침에 따라 MS, UV, VS 및 DPPH 검출기를 조립하십시오. 검출기 라인의 데드 볼륨(dead volume)이 최소화되도록 구성 요소들을 적절하게 배치하십시오.그런 다음 UV VISTA 검출기의 파장을 해당 시료에 특이적인 파장으로 설정하십시오. MS 검출기의 경우 280 nanometers로 설정합니다. 전스캔(full scan) 검출법을 이용한 총 이온 수 또는 TIC 분석에는 양이온 모드(positive mode)를 사용하십시오.MS 검출기의 온도와 가스 유량을 다음 값으로 평형화하십시오. 기화기 온도는 500 °C, 모세관 온도는 350 °C, 보조 가스 유량은 40 units, 스윕 가스 유량은 5 units, 시스 가스 유량은 60 units, 그리고 스프레이 전압은 3.5 kV로 설정합니다. DPPH 라디칼 시약을 준비하려면, 먼저 부피 플라스크에 DPPH 라디칼 25 mg을 메탄올 250 mL에 녹이십시오.용액에 250 µL의 formic acid를 첨가하고 10분 동안 초음파 처리합니다. 그 다음, 빛 노출을 방지하기 위해 플라스크를 덮고 알루미늄 호일로 감쌉니다. 이어서, DPPH 라디칼 시스템을 구축하기 위해 제조사의 지침에 따라 DPPH 라디칼 용액으로 펌프를 퍼지합니다.펌프 라인이 T-피스의 유입구에 단단히 고정되었는지 확인한 다음, 100 µL 반응 코일을 T-피스의 유출구에 연결하십시오. 디텍터를 반응 코일 ENC 케이스의 다른 쪽 끝, 반응 코일 및 컬럼 히터에 부착하십시오. 마지막으로 DPPH 라디칼 UV 디텍터를 520 nm로 설정하십시오.병렬 분절 흐름(parallel segmented flow, PSF) 컬럼을 구성하려면, 먼저 컬럼 입구를 HPLC 장비에 연결하십시오. 다음으로, 튜빙을 사용하여 중앙 포트를 MS 검출기에 연결합니다. 동일한 규격의 튜빙을 사용하여 하나의 주변 컬럼 포트를 UV VS 검출기에 연결하고, 다른 포트를 DPPH 라디칼 검출 시스템의 T-피스에 연결하십시오.사용하지 않는 모든 주변 포트를 컬럼 스토퍼로 막습니다. 내경 4.6 mm, 길이 250 mm 컬럼의 경우, HPLC 유량을 100% 이동상 B 기준 분당 1 mL로 조정합니다. 20분 동안 평형화합니다.PSF 시스템의 튜닝을 시작하려면 먼저 빈 수집 용기를 준비하십시오. 이 바이알을 사용하여 UV VS 및 DPPH 라디칼 포트에서 각각 이동상을 수집하십시오. 수집 시간을 기록하고 각 용기에 최소 500 milligrams의 용매를 수집하십시오.다음으로, 수집 용기의 무게를 달아 이동상의 질량을 결정하고, 이 질량을 메탄올의 밀도로 나누어 각 포트에서 수집된 이동상의 부피를 계산합니다. 마지막으로, MS 검출기로 향하는 유속을 결정하고 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 전체 유속 대비 모든 검출기의 유속 비율을 백분율로 계산합니다. 유속 비율이 이상적인 값에서 크게 벗어난 경우, 필요한 곳에 튜빙을 추가하여 배압을 조절하고 수집 및 계산 과정을 반복하십시오.마지막으로, DPPH 라디칼 시약 펌프의 유속을 검출기에 연결된 배출 포트의 유속과 일치하도록 설정합니다. 커피 시료에 대해 다중 HPLC 분석을 수행하였습니다. DPPH 라디칼 UV 및 질량 분석 크로마토그램을 동시에 기록함으로써, DPPH 라디칼에 양성 반응을 보인 시료 내 화합물을 UV 데이터와 쉽게 대조하여 확인할 수 있습니다.또한 머무름 시간 정렬(retention time alignment)에 기반한 MS 반응에서 MSS TIC 검출기로부터 양성 반응이 관찰된 경우, 해당 피크의 분자량을 기록하였습니다. 서로 다른 검출 과정 간의 피크 매칭이 용이하므로, 커피와 같은 복잡한 시료에 대해 더 빠르고 효율적인 형태의 스크리닝 및 특성 분석이 가능합니다. 이 기술을 숙달하면, 본 절차에 따라 약 1시간 만에 설정을 마치고 시료 분석 준비를 완료할 수 있습니다. 추가적인 시료 정보를 얻기 위해 굴절률, 형광 검출기 또는 화학 발광과 같은 화학 기반 검출법 등의 다른 검출기를 사용할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 복잡한 시료에 대한 더 깊은 이해를 얻기 위해 검출 프로세스를 다중화하는 것의 중요성을 인식하게 될 것입니다. 또한, 병렬 분절 흐름 컬럼을 이용한 다중 검출은 바이오 탐색을 수행하는 매우 효율적인 방법입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

단백질 정제의 과정에서 사용될 적합한 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 (혼성 집적회로) 미디어를 식별하는 자동화된 방법을 설명하고있다. 방법은 자동화된 버퍼 블렌딩, 동적 시료 루프 주입, 순차 열 선택, 다중 파장 분석 및 분할 분획 eluate 컬렉션을 포함하여 중간 압력 액체 크로마 토그래피 시스템을 활용합니다.

단백질 정제에서 사용하기 위해 자동화된 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 칼럼 선정

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여기에서는 분리 성능 향상을 위해 CF(Curtain flow) 모드에서 AFT(Active Flow Technology) 컬럼의 작동 및 최적화를 위한 프로토콜을 제시합니다.

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High-precision Electromagnetic Flowmeter with Empty Pipe via Complex Programmable Logic Device 기반 파형 인식을 통한 빈 파이프 감지

배우세요 병렬 세그먼트 흐름 크로마토그래피 컬럼 조정법을 활용한 멀티플렉스 검출 기술입니다. 복잡한 혼합물 샘플의 화학적 특성과 생리활성을 신속하게 분석하여 정품과 위조품을 구분하는 데 활용할 수 있습니다.

병렬 세그먼트 흐름 열 조정과 멀티 플렉스 감지 활성화

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