병렬 세그먼트 흐름 열 조정과 멀티 플렉스 감지 활성화

본 HPLC 절차의 전반적인 목표는 병렬 분절 흐름 컬럼을 조정하여 다중 검출이 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 건강 및 웰빙, 환경 과학, 법과학, 그리고 바이오 발견과 같이 복잡한 시료 분석이 필요한 모든 분야의 핵심 질문에 답을 제공합니다. 이 기술은 종합적인 시료 분석을 가능하게 하는 동시에, 복잡한 혼합물 내 물질의 화학적 및 생물학적 활성 특성에 관한 정보를 제공합니다.

다중 검출 프로토콜을 통해 신속한 분석 또한 가능합니다. 이 방법은 커피나 와인과 같은 복잡한 혼합물의 화학적 지문을 정의하는 전략 수립을 가능하게 하여, 제조사가 자사 제품과 저가의 모조품을 구별할 수 있도록 합니다. 초기에는 정확한 분석을 위해 전체 시료를 단 하나의 검출기로만 보내지 않는 방식이 생소하게 느껴질 수 있습니다.

하지만 각 흐름 스트림 내의 분석물 농도는 기존 컬럼의 전체 흐름 스트림보다 높습니다. 우선, 이동상 A와 B로 각각 100%UE water와 순수 methanol을 사용하여 HPLC 장비를 설정하십시오. MS 검출기를 사용하는 경우, 두 이동상 모두에 0.1%formic acid를 첨가한 후 제조사의 지침에 따라 HPLC 펌프를 퍼지하십시오.

제조사의 지침에 따라 MS, UV, VS 및 DPPH 검출기를 조립하십시오. 검출기 라인의 데드 볼륨(dead volume)이 최소화되도록 구성 요소들을 적절하게 배치하십시오.

그런 다음 UV VISTA 검출기의 파장을 해당 시료에 특이적인 파장으로 설정하십시오. MS 검출기의 경우 280 nanometers로 설정합니다. 전스캔(full scan) 검출법을 이용한 총 이온 수 또는 TIC 분석에는 양이온 모드(positive mode)를 사용하십시오.

MS 검출기의 온도와 가스 유량을 다음 값으로 평형화하십시오. 기화기 온도는 500 °C, 모세관 온도는 350 °C, 보조 가스 유량은 40 units, 스윕 가스 유량은 5 units, 시스 가스 유량은 60 units, 그리고 스프레이 전압은 3.5 kV로 설정합니다. DPPH 라디칼 시약을 준비하려면, 먼저 부피 플라스크에 DPPH 라디칼 25 mg을 메탄올 250 mL에 녹이십시오.

용액에 250 µL의 formic acid를 첨가하고 10분 동안 초음파 처리합니다. 그 다음, 빛 노출을 방지하기 위해 플라스크를 덮고 알루미늄 호일로 감쌉니다. 이어서, DPPH 라디칼 시스템을 구축하기 위해 제조사의 지침에 따라 DPPH 라디칼 용액으로 펌프를 퍼지합니다.

펌프 라인이 T-피스의 유입구에 단단히 고정되었는지 확인한 다음, 100 µL 반응 코일을 T-피스의 유출구에 연결하십시오. 디텍터를 반응 코일 ENC 케이스의 다른 쪽 끝, 반응 코일 및 컬럼 히터에 부착하십시오. 마지막으로 DPPH 라디칼 UV 디텍터를 520 nm로 설정하십시오.

병렬 분절 흐름(parallel segmented flow, PSF) 컬럼을 구성하려면, 먼저 컬럼 입구를 HPLC 장비에 연결하십시오. 다음으로, 튜빙을 사용하여 중앙 포트를 MS 검출기에 연결합니다. 동일한 규격의 튜빙을 사용하여 하나의 주변 컬럼 포트를 UV VS 검출기에 연결하고, 다른 포트를 DPPH 라디칼 검출 시스템의 T-피스에 연결하십시오.

사용하지 않는 모든 주변 포트를 컬럼 스토퍼로 막습니다. 내경 4.6 mm, 길이 250 mm 컬럼의 경우, HPLC 유량을 100% 이동상 B 기준 분당 1 mL로 조정합니다. 20분 동안 평형화합니다.

PSF 시스템의 튜닝을 시작하려면 먼저 빈 수집 용기를 준비하십시오. 이 바이알을 사용하여 UV VS 및 DPPH 라디칼 포트에서 각각 이동상을 수집하십시오. 수집 시간을 기록하고 각 용기에 최소 500 milligrams의 용매를 수집하십시오.

다음으로, 수집 용기의 무게를 달아 이동상의 질량을 결정하고, 이 질량을 메탄올의 밀도로 나누어 각 포트에서 수집된 이동상의 부피를 계산합니다. 마지막으로, MS 검출기로 향하는 유속을 결정하고 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 전체 유속 대비 모든 검출기의 유속 비율을 백분율로 계산합니다. 유속 비율이 이상적인 값에서 크게 벗어난 경우, 필요한 곳에 튜빙을 추가하여 배압을 조절하고 수집 및 계산 과정을 반복하십시오.

마지막으로, DPPH 라디칼 시약 펌프의 유속을 검출기에 연결된 배출 포트의 유속과 일치하도록 설정합니다. 커피 시료에 대해 다중 HPLC 분석을 수행하였습니다. DPPH 라디칼 UV 및 질량 분석 크로마토그램을 동시에 기록함으로써, DPPH 라디칼에 양성 반응을 보인 시료 내 화합물을 UV 데이터와 쉽게 대조하여 확인할 수 있습니다.

또한 머무름 시간 정렬(retention time alignment)에 기반한 MS 반응에서 MSS TIC 검출기로부터 양성 반응이 관찰된 경우, 해당 피크의 분자량을 기록하였습니다. 서로 다른 검출 과정 간의 피크 매칭이 용이하므로, 커피와 같은 복잡한 시료에 대해 더 빠르고 효율적인 형태의 스크리닝 및 특성 분석이 가능합니다. 이 기술을 숙달하면, 본 절차에 따라 약 1시간 만에 설정을 마치고 시료 분석 준비를 완료할 수 있습니다. 추가적인 시료 정보를 얻기 위해 굴절률, 형광 검출기 또는 화학 발광과 같은 화학 기반 검출법 등의 다른 검출기를 사용할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 복잡한 시료에 대한 더 깊은 이해를 얻기 위해 검출 프로세스를 다중화하는 것의 중요성을 인식하게 될 것입니다. 또한, 병렬 분절 흐름 컬럼을 이용한 다중 검출은 바이오 탐색을 수행하는 매우 효율적인 방법입니다.