Name: Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 배우세요 생물 샘플에서 비표적 대사체학 분석을 위한 UPLC-HRMS 기법을 활용한 방법입니다. 액체-액체 추출과 고해상도 질량 분석을 통해 대사 프로파일을 비교하고 차등적으로 풍부한 대사체를 식별합니다.

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우리는 NIH 보조금 P30ES013508 및 5T32GM008076의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 SIEVE 2.0 및 박사 부부에 액세스하기 위해 온도 과학을 감사합니다. 유용한 토론 유진 Ciccimaro 및 온도 과학의 마크 샌더스.

1. 세포 시료 전처리 <ol><li> 세포의 10 센티미터 플레이트 : 미리 표시 10 mL 유리 원심 분리기 튜브에 미디어 해제 세포 현탁액의 1.5 ML를 수집합니다. 접착 라인의 경우, 세포는 얼음에 보관 매체의 1.5 ML에 부드러운된다고으로 해제해야합니다 옵션 :. 내부 표준 물질을 사용하는 경우,이 단계에서 적절한 나누어지는을 추가합니다. 코멘트 : 세포 대사의 담금질 특정 대사 산물 중요합니다. 시간에 민감한 대사 산물의 분석을 위해, 같은 차가운 메탄올 추출 등의 절차가 고려되어야한다. 17 </li><li> 샘플을 포함하는 10 ML 유리 튜브에 각각 6 클로로포름 ML (CHCl 3) / 메탄올 (CH 3 OH) (2:1 V / V)를 추가합니다. 30 분 동안 저속에 쉐이커 또는 다중 vortexer에 샘플을 설정합니다. 흔들어 후, 샘플은 4에서 10 분 동안 1,935 XG에서 낮은 가속 / 감속 설정으로 원심 분리 ° C 완전히 단계를 분리 할 수​​ 있습니다. 선택 </eM&gt; : CHCl 3 사용하지 않으려면, 추출은 (CH 2 망할 CIA 2) 디클로로 메탄으로 수행 할 수있다 18,12. </li><li> 긴 줄기 파스퇴르 피펫 사용하여 새 사전 표시 10 ㎖ 유리 원심 분리기 튜브에 유기 (아래) 레이어를 전송할 수 있습니다. 4.1 계속합니다. </li><li> 나중에 깨끗한 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 위 수성을 전송합니다. 질소 가스 하에서 시료를 증발. 액상 탈염을 위해 2.6.2을 계속하거나 직접 분석을 위해 4.1를 계속합니다. </li></ol> 2. 혈청의 샘플 추출 <ol><li> 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 혈청 20 μl를 전송 옵션 :. 내부 표준 물질을 사용하는 경우,이 단계에서 적절한 나누어지는을 추가합니다. </li><li> 10 초 동안 CH 3 OH와 소용돌이의 190 μl를 추가합니다. </li><li> 10 초 동안 CHCl 3와 소용돌이의 380 μl를 추가합니다. </li><li> 상 분리를 유도하기 위해 H 2 O 120 μl를 추가합니다. 소용돌이 10 초 샘플 및 10에 대한 RT에서 평형 수분. </li><li> 4시 10 분 8,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 ° C 단계를 구분합니다. </li><li> 깨끗한 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 더 낮은 유기 상을 전송합니다. 4.1 계속합니다. </li><li> 나중에 깨끗한 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 위 수성을 전송합니다. 질소 가스 하에서 시료를 증발. </li><li> 200 μL H 2 O에서 샘플을 다시 일시 중지합니다 산 또는 염기 시약 (0.1 % 아세트산, 포름산 0.1 %의 수산화 암모늄)를 우선적으로 산도에 민감한 대사를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 완전히 샘플을 다시 일시 중단 얼음에 20 분간 초음파 처리. </li><li> 500 μL CH 3 OH와 C18 스핀 컬럼을 활성화합니다. </li><li> 500 μL H 2 O의 두 세척과 스핀 열 평형 후 샘플을로드합니다. 산 / 염기 시약을 사용하는 경우 세척 단계에서이 농도를 유지한다. </li><li> 샘플을 탈염하는 500 μL H 2 O로 씻으십시오. 산 / 염기 시약을 사용하는 경우 다시 세척이 농도를 유지단계. </li><li> 이전 레이블 깨끗한 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 H 2 O 3 OH CH 200 μL 80 %의 두 권으로 용출. 산 / 염기 시약을 사용하는 경우 다시 세척 단계에서이 농도를 유지한다. 4.1 계속합니다. </li></ol> 3. 조직의 샘플 추출 <ol><li> 조직에 따라 냉동 조직의 10-100 밀리그램 사이에 사용합니다. 얼음 목욕 PBS 1 ㎖ (1 M, 산도 6.8)로 미리 표시된 2 ㎖ 낮은 유지 에펜 도르프 튜브에 조직의 모든 조각을 추가 선택 사항 :. 내부 표준 물질을 사용하는 경우 추가하기 전에, 버퍼에 추가 조직. </li><li> 각 에펜 도르프에서 30 초 동안 전기 조직 분쇄기 얼음의 조직을 균질화. 샘플 사이, 각각 CH 3 OH와 H 2 O를 포함하는 두 개의 별도의 튜브에 조직 분쇄기를 청소하십시오. </li><li> 미리 표시 10 mL 유리 원심 분리기 튜브에 플라스틱 피펫으로 조직 균질을 전송합니다. 전송 후 각 에펜 도르프 튜브 린스CH 3 OH 1 ㎖로 2 배와 유리 튜브에 조직 균질 액으로 세척을 추가합니다. </li><li> 조직 균질 및 CH 3 OH 세척을 포함하는 10 ML 유리 튜브의 각 CHCl 3 4 ML을 추가합니다. 30 분 동안 저속에 쉐이커 또는 다중 vortexer에 샘플을 설정합니다. </li><li> 진동 후 완전히 단계를 구분하는 10 분 동안 1,935 XG에서 낮은 가속 / 감속 설정으로 샘플을 원심 분리기 선택 :. 클로로포름을 사용하지 않으려면, 추출은 CH 2 망할 CIA 2 개발되었습니다. </li><li> 긴 줄기 파스퇴르 피펫 사용하여 새 사전 표시 10 ㎖ 유리 원심 분리기 튜브에 유기 (아래) 레이어를 전송할 수 있습니다. 4.1 계속합니다. </li><li> 긴 줄기 파스퇴르 피펫 사용하여 새 사전 표시 10 ㎖ 유리 원심 분리기 튜브에 수성 레이어를 전송합니다. 탈염을 위해 2.6.2로 이동하거나 4.1로 진행합니다. </li></ol> 4. 재 서스펜션과 UPLC에 대한 샘플의 여과 <ol><li> SAMP을 증발질소 가스 하에서 레. </li><li> 재구성하여 원하는 UPLC 방법 (표 1 참조) 시작 솔루션의 적절한 볼륨 샘플을 건조. 50-100 μL 일반적으로 바람직한 재 서스펜션 볼륨입니다. 부드럽게 소용돌이 및 / 또는 분석을 용해에 도움 아래 샘플을 피펫. </li><li> 시료가 완전히 필터 (~ 5 분)를 통과 한 때까지 14,000 XG에에서 0.22 μm의 나일론 튜브 필터와 스핀에 샘플을 전송합니다. 샘플에 남아있는 침전물 눈에 보이는이 없는지 확인하십시오. </li><li> 인서트 미리 표시 UPLC 유리 병에 필터링 된 시료의 상등액을 전송합니다. 캡 유리 병은, 다음 샘플 유리 병의 바닥에서 모든 거품을 제거하기 위해 유리 병을 가볍게. 냉장 자동 시료 주입기 (4-5 ° C)에서 샘플을 놓습니다. </li></ol> 5. UPLC 설정 <ol><li> 액체 크로마토 그래프의 제어 소프트웨어를 사용에 나열된 조건을 기반 유기 샘플 실행을 만들 <str사연&gt; 표 1. . 다음 사항 표 1에 나열된 조건 해제 수성 단계에 대한 방법을 만들기 : 대상 분석 알려진 일련의 높은 관심이 있다면,이 화합물의 무거운 표시된 아날로그를 사용하여 UPLC 조건을 최적화하며, 이러한 조건을 사용하여 메서드를 생성 . </li><li> UPLC 적절하게 평형을 허용합니다. 이 열을 연결하고 새 열 (보통 3-5 열 볼륨)의 평형 볼륨에 대한 제조 업체의 지침을 수행하기 전에 용매의 전체 프라이밍를 포함해야합니다. 미래의 문제를 진단하는 데 도움이되는 압력을 다시 시작 로그를 유지합니다. </li></ol> 6. 질량 분광계 설정 <ol><li> 고해상도 질량 분석기의 제어 소프트웨어를 사용하여 표 2에 나열된 조건을 사용하여 긍정적 인 모드 메서드를 만듭니다. 그런 다음 같은 조건을 사용하여 음의 모드 메서드를 만듭니다 사항 :. 대상 분석 물질의 알려진 세트는 높은 INT의 경우erest 최적화 소스 및 이들 화합물의 무거운 표시된 아날로그를 사용하여 광학 조건 및이 조건을 사용하는 방법을 생성합니다. </li><li> 기기를 청소하고 교정, 분광계에 안정적인 스프레이를 수립하고 적절하게 소스 및 광학에서 발산하는 교정 솔루션을위한 시간을 허용합니다. 스프레이 허용 안정성 LC 방법을 사용하는 것과 동일한 유량 보정 용액의 주입 최소 100 스캔을 통해 강도의 RSD ~ 5 %를 주어야한다. </li><li> 모든 샘플에 대한 순서를 설정, 적절한 주입 볼륨을 설정하고 첫 번째 샘플 전에 빈을 실행합니다. 샘플 사이 이월 또는 행렬 효과가 의심되는 경우, 적절한 공백 / 세척을 실행합니다. 샘플 분석을 도입하는 일괄 처리 효과를 방지하기 위해 난수 생성기 및 키를 사용하여 무작위 방식으로 설정해야합니다. 코멘트 : 가능성이 대상의 안정 동위 원소 표준이나 분석 기준 등 품질 관리 샘플이 될 수 있습니다신뢰성, 재현성, 그리고 유효한 결과를 해결하고 보장에서 매우 중요. 용매 빈 다음에 표준 만 샘플의 기술적 복제는 빈 실행에 신호 강도 및 체류 시간의 편차뿐만 아니라 이월에 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 순서를 시작하고 압력 변동, 또는 실행을 통해 신호 강도의 손실을 포함하여 문제를 주기적으로 모니터링 할 수 있습니다. 심각한 문제가 발견되는 경우, 실행을 중지하고 6.2에서 반복합니다. </li></ol> 7. 차이 분석 <ol><li> 두 워크 플로는이 프로토콜에 대한 안내되게됩니다. 첫 번째는 SIEVE 2.0, 써모 피셔에 의해 판매 독점 레이블 무료 차동 분석 소프트웨어를 통해이다. 두 번째 워크 플로 차이 분석을 시작하기 전에 XCMS 온라인, 스크립스 연구소를 통해 무료 플랫폼을 제공합니다. 11까지이며, 수동 틱을 확인하거나 실행의 재현성을 보장하기 위해 예제의 모든 알려진 화합물 여과 크로마토 그램에서 보면모든 샘플에 걸쳐 주입 / UPLC / 스프레이 안정성. </li><li> SIEVE <ol><li> 질량 분석기에서 SIEVE가 설치된 워크 스테이션의 하드 드라이브에. 원시 데이터 파일을 전송합니다. (참고 : 분석의 속도를 제한 할 수있는 네트워크 또는 USB 포트에 연결된 드라이브에 저장된 데이터 자체를 실행하는 것이 좋습니다되지 않습니다.) </li><li> 열기 체, 새로운 실험을 시작합니다. </li><li> SIEVE에 해당 파일을로드합니다. </li><li> 비교 그룹을 지정하고 SIEVE 분석을위한 변수를 생성 할 수 있도록하는 하나의 참조 파일을 선택합니다. </li><li> 프롬프트 및 개별 실험의 요구 사항에 따라 모든 매개 변수를 조정하십시오. 그것은 엄격한 매개 변수와 함께 시작하고 되돌아 가서 더 관대 한 설정은 분석 시간을 길게 수있는 매개 변수를 느슨하게하는 것이 좋습니다. </li><li> 매개 변수에서 양 또는 음의 모드에 대한 올바른 부가 생성물 목록을로드합니다. </li></ol></li><li> XCMS 온라인 <ol><li> 파일을 변환온라인 XCMS에 대한 허용 형식으로. 우리의 경우, 우리는 형식을 mzXML로 변환. 19 </li><li> 오픈 XCMS 온라인 및 작업을 만듭니다. </li><li> 업로드 및 데이터 세트 이름을 지정합니다. 두 데이터 집합 (예 : 제어 대 치료) 독립형 XCMS는 헤드 투 헤드 비교로 제한되어 있으므로 업로드 할 수 있습니다. </li><li> 드롭 다운 목록에서 원하는 설정을 선택합니다. 미리 채워진 매개 변수를 다른 기기에 설치할 경우에 사용할 수 있으며, 이러한 추가 실험 필요를 수정할 수 있습니다. 우리의 경우, 우리는 HPLC-Orbi2 설정을 사용합니다. </li><li> 제출하고 작업을 확인합니다. </li></ol></li><li> 데이터 분석 <ol><li> 분석이 완료되면 SIEVE 및 XCMS에 대한 각각 구조와 기능의 목록이 채워집니다. LC 정렬은 모든 랜드 마크 피크를 겹쳐 있는지 확인합니다. 정렬되지 않은 LC가 실행 중 하나가 랜드 마크 피크에 큰 편차를 표시하는 경우이 샘플 문제를 나타낼 수 있습니다. 옵션 : 내부 표준 물질을 사용하는 경우 SIEVE를 들어, 위치해당 피크 그룹과 선택된 프레임에 정상화. 온라인 XCMS를 들어, 정규화 보낸 후 스프레드 시트에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> 같은 샘플 집단 (예를 들어, 컨트롤 샘플) 내 변동 계수 (CV)에 의해 데이터를 플롯합니다. 어떤 큰 CV 값은 하나 또는 그 이상의 샘플 문제를 나타낼 수 있습니다. 원하는 특성 (예를 들어, P-값 &lt;0.05, 겹 변경&gt; 1.5 그룹 내에서 낮은 표준 편차 등)에 따라 목록을 정렬합니다. </li><li> 그룹간에 적절한 피크 정렬, 피크 통합, 가우스 피크 모양, 신호 강도, 동위 원소 및 부가 생성물 할당 각 피크를 검사합니다. </li><li> 추가 분석을 위해 원하는 데이터를 내보내거나 확인 및 MS n 개의 실험 대상 물질 목록을 생성 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

타겟이 불분명 한 대사는 내인성 또는 생체이 biotransformations을 조사하거나, 그 샘플의 대사 프로파일을 캡처하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 해상도와 감도, 생성 된 대용량 데이터를 처리 할 수있는 능력을 샘플을 분리하고 분석하는 데 사용되는 기술과 유용한 정보 (예 : 정확한 질량 데이터베이스 검색)에 대한 데이터 집합을 채굴 할 수있는 능력을 가진 기술 저울의 출력. 최근, 이것은 고해상도 질량 분석기의 발전에 의해 촉진, 고 또는 초 고성능 액체 크로마토 그래피되었습니다. 차동 분석 소프트웨어는 분석 병목 현상을 해결하고 있으며, 적절한 정보학 파이프 라인의 높은 처리량. 20,21,22 선택과 유지 시간 교대, 필터링 및 통계 분석을위한 피크 검출 조정을 수행 할 수있는 것은, 알고리즘을 centroiding 데이터와 같은 고려 사항을 포함해야 피크 탐지, 첨단 통합, alignmenT, MS / MS 데이터를 통합 할 수있는 능력, 그리고 동위 원소 또는 부가 물을...

HRMS 분야의 최근 기술 발전으로 인해, 타겟이 불분명 한, 가설 생성 대사 접근은 복잡한 시료의 분석 가능한 방법이되고 있습니다. 백만 루틴 낮은 부분을 촉진 100,000 해상도 (PPM)의 질량 정확도 수 1 질량 분석기 널리되고있다 여러 공급 업체에서 제공. 2,3이 질량 정확도는 더 특이 분석의 정체성, 동위 원소 패턴 인식, 내전 식별의 예비 할당에 대한 신뢰하실 수 있습니다. 4 적절한 추출 절차 및 고성능 LC 또는 UPLC, 복잡한 혼합물과 결합 할 때 유지 시간 데이터에서 파생 된 추가 특이성 분석 할 수 있습니다. 5 UPLC 더 큰 크로마토 그래피의 효율성을 소유하고 그 결과 큰 데이터 집합이 어떤에 통합 될 수있는 가능한 대사 체 6.의 큰 범위를 만드는 민감도, 해상도 및 분석 시간을 허용여러 개의 차동 분석 소프트웨어 및 유용한 패턴이나 관심의 개별 분석을 위해 채굴. 7,8,9,10,11 상상 속 히트 곡이 처음 피크 검출 알고리즘의 조합, 정확한 질량 기반의 화학 수식 예측, 조각 예측을 사용하여 식별 할 수있는, 그리고 화학 데이터베이스 검색을. 이 방법은 수 시간이 소요되는 전체 구조 식별을 위해 또는 더 민감하고 더 구체적인 안정 동위 원소 희석 개발을위한 목표 UPLC / 선택 또는 다중 반응 모니터링 / 정량에 대한 현재 금 표준 방법입니다 MS 연구. 12 우선 순위 생물학적 시료의 다양한 자연 뇨 13, 셀 14, 혈청 15, 또는 조직 16 추출 프로토콜 최적화되었다. 이 프로토콜 기능을 추출 세포, 혈청 및 조직합니다. 적절한 경우, 코멘트 및 추가 참조는 수정 여부에 대한 포함되어 있습니다절차 화 : 안정 동위 원소의 포함을 해결하거나, 특히 불안정한 대사 산물 포함 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약</td></tr><tr><td>phosphate 완충 식염수</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>물(H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td>(최적)</td></tr><tr><td>아세토니트릴(CH3CN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td>(최적)</td></tr><tr><td>메탄올(CH3OH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>클로로포름(CH3Cl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td>Hazard</td></tr><tr><td>Dichloromethane(CH2Cl2)</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>클로로포름</td></tr><tr><td>Diethyl Ether</td><td>Sigma-Aldrich를 대체하려면</td><td>346136</td><td>클로로포름</td></tr><tr><td>포름산 (FA)</td>을 대체하려면<td>Fisher Scientific</td><td></td><td>(optima)</td></tr><tr><td>NH4OH</td><td>Fisher Scientific</td><td>A470-250</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>포름산암모늄(HCOONH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78314</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin C18 컬럼</td><td>Nest Group Inc</td><td>SS18V</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 유리 원심분리기 튜브</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 플라스틱 원심분리기 튜브</td><td>CellTreat</td><td>CLS-4301-015</td><td></td></tr><tr><td>LC 바이알 (유리)</td><td>Waters</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>LC 인서트 (유리)</td><td>Waters</td><td>WAT094171</td><td></td></tr><tr><td>LC 바이알 (플라스틱)</td><td>Waters</td><td></td><td></td>186002640</tr><tr><td>0.22 &mu; m 필터</td><td>Corning</td><td>8169</td><td>나일론</td></tr><tr><td>2ml Eppendorf Tubes</td><td>BioExpress</td><td>C-3229-1</td><td>Low Retention</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>High Resolution Mass Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>LTQ XL-Orbitrap</td><td></td></tr><tr><td>HPLC/UPLC</td><td>Waters</td><td>nanoACQUITY UPLC</td><td></td></tr><tr><td>Source</td><td>Michrom</td><td>Thermo 고급 소스</td><td></td></tr><tr><td>차등 분석 소프트웨어</td><td>Thermo Scientific</td><td>SIEVE 2.0</td><td></td></tr><tr><td>nanoACQUITY C18 BEH130</td><td>Waters</td><td>186003546</td><td>1.7 &mu; M 입자 크기, 150 mm x 100 &mu; m</td></tr><tr><td>Acentis Express C8</td><td>시그마-알드리치</td><td>54262</td><td>2.7 &mu; M 입자 크기, 15cm x 200 &mu; 중</td></tr></tbody></table>

ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (uplc-hrms)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

여기에서 우리는 등 그 생물 학적 샘플 신진 대사 프로파일을 분석 할 수있는 워크 플로우를 제시, 세포, 혈청, 또는 조직. 샘플을 먼저 액체 - 액체 상 적출에 의해 극성 및 비극성 분획으로 분리하고, 부분적으로 다운 스트림 분석을 용이하게 정제된다. 초기 추출 수용액 (극성 대사 물질) 및 유기 모두 (비 극성 대사 물질) 단계는 대사의 넓은 범위를 조사하기 위해 처리됩니다. 대사는 자신의 파티션 속성에 따라 다른 액체 크로마토 그래피 방법으로 구분됩니다. 이 방법에서는, 우리는 (UP) LC 방법을 마이크로 초 성과를 제시하지만, 프로토콜은 높은 흐름과 낮은 압력으로 확장됩니다. 질량 분석기에 도입 일반 또는 화합물 최적화 된 소스 조건 중 하나를 할 수 있습니다. 이온의 넓은 범위의 검출은 최근 C에 높은 해상도를 사용하여 광범위한 m / Z 범위에서 긍정적이고 부정적인 모드에서 전체 스캔 모드에서 수행됩니다악기를 alibrated. 레이블 무료 차동 분석은 생물 정보학 플랫폼에서 수행됩니다. 이 방법의 응용 프로그램은 대사 경로 검사, biomarker 발견과 약물 개발이 (가) 있습니다.

제시된 결과는 농약과 미토콘드리아 복잡한 I 억제제 로테 논을 가진 SH-SY5Y 아교 모세포종 세포의 6 시간 처리에서 선택된 데이터를 보여줍니다. 간결 만 유기 상 긍정적 인 모드 데이터가 표시됩니다. 샘플을 처리하고 위에서 설명한대로 분석 (그림 1, 표 1, 표 2)와 레이블이없는 정량 SIEVE 및 XCMS 온라인으로 두 개의 차동 분석 플랫폼에 탑재되었다. 조회수 많은 수의 (그림 2, 그림 3) 차동 분석에 사용되는 두 개의 프로그램으로 식별되지만 이러한 기능은 가능성 유물, 제대로 통합 봉우리, 그리고 의심 분석 값의 다른 기능이 포함되어 있습니다. 이것은 적절한 신호 강도, 같은 그룹의 샘플 배경 수준, 좋은 크로마토 그래피 피크 모양 (그림 3)과 낮은 변동에 대한 안타를 심사하여 판단 할 수 있습니다. downstre을 보여초기 히트의 확인입니다, 우리는 3 ppm으...

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

다음 실험의 전반적인 목적은 서로 다른 생물학적 시료 군의 대사 프로파일 스냅샷을 비교하는 것입니다. 이는 액체-액체 추출법을 사용하여 유기 분자와 극성 분자를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 분자들을 액체 크로마토그래피로 추가 분리하고 고해상도 질량 분석법으로 분석하여, 이후 분석에 필요한 머무름 시간, 질량 대 전하비 및 강도 데이터를 얻습니다.다음으로 액체 크로마토그래피 런을 정렬하고 피처를 검출, 정량 및 분류합니다. 이는 그룹 간에 발현량이 차이 나는 피처를 식별하기 위함입니다. 결과는 액체 크로마토그래피 및 고해상도 질량 분석법으로 검출된 분석물의 상대적 함량 차이를 바탕으로 처리 조건에 따른 피처의 차이를 보여줍니다.이 방법은 세포 대사를 연구하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 바이오마커 발굴이나 제노바이오틱(xenobiotic) 대사에 대한 통찰을 제공할 수도 있습니다. 부착성 세포주의 경우, 10 centimeter 플레이트 내의 세포에 배지 1.5 milliliters를 첨가합니다. 플레이트를 얼음 위에 놓고 조심스럽게 스크레이핑하여 세포를 떼어냅니다.회수된 1.5 milliliters의 세포 현탁액을 미리 라벨을 붙인 10 milliliter 유리 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 샘플이 들어 있는 각 10 milliliter 유리 튜브에 2:1 클로로포름-메탄올 6 milliliters를 첨가합니다. 샘플을 저속으로 30분 동안 흔들어 줍니다. 흔든 후, 4 °C에서 1,935 ×g로 10분 동안 낮은 가속/감속 설정으로 원심분리하여 층을 완전히 분리한 다음, 긴 스템 파스퇴르 피펫을 사용하여 분리합니다.유기층을 미리 라벨을 붙여둔 새로운 10 milliliter 유리 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 수층을 깨끗한 플라스틱 2 milliliter einor 튜브로 옮깁니다. 이 시점에서 유기 및 수성 샘플을 질소 가스로 증발시킵니다.원하는 UPLC 분석법의 시작 용액 50~100 µL를 사용하여 건조된 샘플을 재구성합니다. 피펫으로 샘플을 부드럽게 위아래로 섞어 분석 물질이 잘 용해되도록 돕습니다. 그 후 각 샘플을 0.22 µm 나일론 튜브 필터로 옮기고, 샘플이 필터를 완전히 통과할 때까지 약 5분 동안 최대 14,000 ×g로 원심 분리합니다.시료를 검사하여 가시적인 침전물이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 여과된 시료의 상층액을 미리 라벨을 붙인 인서트 캡이 있는 UPLC 바이알로 옮기고 캡을 닫으십시오. 그 다음 바이알 바닥에 있는 기포를 제거하기 위해 가볍게 쳐주십시오.시료를 냉각된 오토샘플러에 넣습니다. 이제 액체 크로마토그래피 제어 소프트웨어를 사용하여 유기 시료에 대한 분석 런(run)을 생성하십시오. 그 다음, 최적화된 UPLC 조건에 따라 유기 시료에 대한 분석 런을 생성하십시오.최적화된 UPLC 조건을 사용하여 수성 상에 대한 분석법 또한 생성하십시오. 특정 표적 분석물 세트에 관심이 높은 경우, 해당 화합물의 중표지 유사체(heavy labeled analog)를 사용하여 UPLC 조건을 최적화하고 분석법을 생성하십시오. 이 조건들을 사용하여 UPLC가 충분히 평형 상태에 도달하도록 하십시오.컬럼을 연결하기 전에 용매를 충분히 프라이밍해야 합니다. 새 컬럼의 평형화 부피에 대한 제조사의 지침을 따르고, 고해상도 질량분석기 제어 소프트웨어를 사용하여 초기 배압 기록을 유지함으로써 향후 문제 진단에 활용하십시오. 양이온 모드 방법을 생성하십시오. 그다음 동일한 조건을 사용하여 음이온 모드 방법을 생성하십시오.기기를 세척하고 교정하십시오. 분광계로 유입되는 분무 상태를 안정화하고, 교정 용액이 소스 및 광학계에서 충분히 제거될 때까지 기다리십시오. 분무의 허용 가능한 안정성은 사용 중인 LC 분석법과 동일한 유속으로 교정 용액을 주입하여 최소 100회 스캔했을 때 강도의 상대 표준 편차가 3~5% 이내여야 합니다.난수 생성기와 키를 사용하여 분석 과정에서 발생할 수 있는 배치 효과를 방지하기 위해 샘플을 무작위 순서로 배치하십시오. 모든 샘플에 대한 분석 시퀀스를 설정하십시오. 적절한 주입량을 설정하고, 첫 번째 샘플을 분석하기 전에 블랭크(blank)를 실행하십시오.시료 간의 전이(carryover) 또는 매트릭스 효과가 의심되는 경우, 적절한 블랭크 또는 세척 과정을 수행하고 분석 시퀀스를 시작하며, 분석 전반에 걸쳐 압력 변동이나 신호 강도 감소를 포함한 문제 발생 여부를 주기적으로 모니터링하십시오. 심각한 문제가 발견되면 분석을 중단하십시오. 기기를 세척하고 교정하십시오.분광계 내에 안정적인 스프레이를 형성하고, 보정 용액이 소스 및 광학계에서 충분히 소산될 때까지 기다립니다. 차등 분석을 시작하기 전, 전체 이온 전류를 수동으로 확인하거나 시료 내의 기지 화합물에 대한 필터링된 크로마토그램을 확인하십시오. 모든 시료에 걸쳐 분석 실행, 주입/UPLC/스프레이 안정성의 재현성을 보장하려면, 질량 분석기의 RAW 데이터 파일을 sieve가 설치된 워크스테이션의 하드 드라이브로 전송하십시오.sieve를 엽니다. 새로운 실험을 시작하고 해당 파일을 sieve에 로드합니다. 비교 그룹을 지정하고 단일 참조 파일을 선택하여 SIE V가 분석 파라미터를 생성하도록 합니다.안내에 따라 각 개별 실험의 요구 사항에 맞춰 파라미터를 조정하십시오. 파라미터 설정에서 양이온 또는 음이온 모드에 맞는 올바른 adduct 리스트를 로드하십시오. 분석이 완료되면 화면에 프레임 리스트가 생성되었는지 확인하십시오.lc 정렬이 랜드마크 피크와 겹치는지 확인하십시오. 정렬되지 않은 lc 런에서 랜드마크 피크의 편차가 크게 나타난다면, 이는 시료에 문제가 있음을 나타낼 수 있습니다.유사한 샘플 집단 내의 변동 계수별로 데이터를 도식화하십시오. 원하는 특성에 따라 목록을 정렬하십시오. 다음으로, 각 피크를 검토하여 그룹 간에 적절한 피크 정렬이 이루어졌는지 확인하십시오.피크 적분, 가우시안, 피크 형상 신호 강도, 동위원소 및 부가물 할당을 수행합니다. 추가 분석을 하거나 확인 및 MS 최종 실험을 위한 타겟 질량 리스트를 생성하기 위해 데이터를 원하는 형식으로 내보냅니다. 두 프로그램을 통해 다수의 히트(hit)가 식별되었으며, 녹색 점은 대조군에서 더 풍부한 특징을, 빨간색 점은 처리군에서 더 풍부한 특징을 나타냅니다.점의 크기가 클수록 그룹 간의 배수 변화(fold change)의 크기가 증가함을 나타내며, 색상의 강도는 색의 포화도가 높을수록 P 값이 감소함을 의미합니다. 여기는 유기상 양이온 모드 UPLC MS 분석 결과를 보여주는 크로마토그램입니다. 창 A는 S Civ 2.0의 총 이온 전류(total ion current)를 보여줍니다. 창 B에는 XCMS에 의해 D paneth로 식별된 특성의 추출 이온 크로마토그램(extracted ion chromatogram)이 표시되어 있습니다. 창 C는 sve로부터 알려진 rot로 식별된 특성의 추출 이온 크로마토그램을 보여줍니다.윈도우 D는 총 이온 전류로 정규화한, rot known으로 확인된 특징의 추출 이온 크로마토그램을 보여줍니다. rot known 처리군에서 감소한 차등 발현 특징은 정밀 질량 데이터베이스 검색을 통해 d panadine으로 잠정 확인되었습니다. 분석물의 정체는 U-P-L-C-H-R 탠덤 질량 분석법으로 확인되었습니다.여기에서는 샘플과 순수 화합물의 크로마토그램 및 질량 분석 스펙트럼을 비교하여 보여줍니다. 클로로포름을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 환기가 잘 되는 흄 후드 사용과 같은 적절한 예방 조치를 반드시 준수해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다.  이 문서에서는 시료 조직 및 준비, 데이터 수집, 데이터 분석, 품질 관리 및 대사 산물 식별을 포함하여 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 사용되는 일반적인 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

하나의 샘플을 사용하여 생물학적 조직에서 지질, 대사 산물 및 단백질을 포괄적으로 추출하기위한 프로토콜이 제시됩니다.

단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

밀 곡물 대사 산물 및 지질의 비표적 분석을위한 방법이 제시된다. 이 프로토콜에는 아세토니트릴 대사산물 추출 방법 및 역위상 액체 크로마토그래피 질량 분광법 방법이 포함되며, 양극 및 음전소 이온화 모드로 수집됩니다.

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

우리는 효모 사카로미세스 세레바시아에있는 수용성 대사산물의 주요 클래스의 식별 그리고 양을 위한 프로토콜을 제시합니다. 설명된 방법은 다재다능하고 견고하며 민감합니다. 그것은 서로 수용성 대사 산물의 구조 이소목 및 고정 관형 형태의 분리를 허용한다.

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

이 프로토콜의 목표는 반표적 크로마토그래피-질량 분광법을 사용하여 혈장에서 페놀 대사 산물을 검출하는 것입니다.

노인의 혈장에서 페놀 대사 산물의 질량 분광법 분석에 결합 된 반 표적 초고성능 크로마토그래피

우리는 XY-Meta와 metaX를 함께 통합하는 표적화되지 않은 대사 산물 워크 플로우를 구축했습니다. 이 프로토콜에서는 XY-Meta를 사용하여 오픈 액세스 스펙트럼 참조에서 데코이 스펙트럼 라이브러리를 생성하는 방법을 표시 한 다음 FDR 제어를 수행하고 대사체 스펙트럼을 확인한 후 metaX를 사용하여 대사 산물을 정량화했습니다.

FDR 제어 기반 비표적 메타볼로임에 대한 식별 및 정량화의 통합 워크플로우

여기에서는 희귀 세포 유형의 대사 산물을 정확하고 안정적으로 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세포 분류를 위한 변형된 sheath 유체 및 관련 blank 샘플 생성을 포함한 기술 개선을 통해 샘플당 5000개의 세포만 입력하여 대사 산물을 포괄적으로 정량화할 수 있습니다.

희귀 일차 세포에 대한 표적 대사체학

배우세요 생물 샘플에서 비표적 대사체학 분석을 위한 UPLC-HRMS 기법을 활용한 방법입니다. 액체-액체 추출과 고해상도 질량 분석을 통해 대사 프로파일을 비교하고 차등적으로 풍부한 대사체를 식별합니다.

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

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