Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

다음 실험의 전반적인 목표는 서로 다른 그룹의 생물학적 샘플의 대사 프로필의 스냅샷을 비교하는 것입니다. 이것은 유기 분자와 극성 분자를 분리하기 위해 액체, 액체 추출을 사용함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 액체 크로마토그래피로 분자를 추가로 분리하고 추가 분석을 위해 머무름 시간, 질량 대 전하 비율 및 강도 데이터를 제공하는 고분해능 질량 분석법으로 분석합니다.

다음으로 액체 크로마토그래피 실행이 정렬되고 특징이 검출, 정량 및 정렬됩니다. 그룹 간에 차등적으로 풍부한 기능을 식별하기 위해. 결과는 액체 크로마토그래피, 고분해능 질량 분석법으로 검출된 분석물의 차등 풍부도를 기반으로 처리 조건에 따른 특징의 차이를 보여줍니다.

이 방법은 세포 대사를 연구하는 데 사용할 수 있지만 바이오마커 발견 또는 제노 생체 대사에 대한 통찰력을 제공할 수도 있습니다. 부착 라인의 경우 10cm 플레이트의 세포에 1.5ml의 배지를 추가합니다. 플레이트를 얼음 위에 놓고 부드럽게 긁어 세포를 들어 올립니다.

1.5ml의 리프팅된 세포 현탁액을 사전 라벨링된 10ml 유리 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 샘플이 들어있는 10 밀리리터 유리관 각각에 2 대 1 클로로포름 메탄올 6 밀리리터를 첨가합니다. 진탕 후 30분 동안 저속으로 샘플을 흔든 후 섭씨 4도에서 10분 동안 낮은 가속 감속으로 샘플을 원심분리하여 긴 줄기 목초지 피펫을 사용하여 상을 완전히 분리합니다.

유기층을 사전 라벨링된 새로운 10ml 유리 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 수성 층을 깨끗한 플라스틱 2 밀리리터 einor 튜브로 옮깁니다. 이 시점에서 질소 가스에서 유기 및 수성 샘플을 증발시킵니다.

원하는 UPLC 방법을 위해 50 - 100 microlit의 시작 용액에서 건조된 샘플을 재구성합니다. 분석물을 용해하는 데 도움이 되도록 샘플을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 각 샘플을 0.22 미크론 나일론 튜브 필터로 옮기고 샘플이 필터를 완전히 통과할 때까지 약 5분 동안 최대 14, 000회 G로 회전시킵니다.

샘플을 검사하여 샘플에 눈에 보이는 침전물이 남아 있지 않은지 확인합니다. 여과된 샘플의 상등액을 바이알에 캡을 삽입한 상태로 사전 라벨링된 UPLC 바이알로 옮깁니다. 그런 다음 튕겨서 샘플 바이알 바닥에서 거품을 제거합니다.

샘플을 냉장 자동 샘플러에 넣습니다. 이제 액체 크로마토그래프용 제어 소프트웨어를 사용하여 유기 샘플에 대한 실행을 생성합니다. 그런 다음 최적화된 UPLC 조건을 기반으로 유기 샘플에 대한 실행을 생성합니다.

최적화된 UPLC 조건을 사용하여 수성 상에 대한 분석법도 생성할 수 있습니다. 알려진 표적 분석물 세트에 관심이 높은 경우, 이러한 화합물의 중량 표지 유사체를 사용하여 UPLC 조건을 최적화하고 분석법을 생성합니다. 이러한 조건을 사용하여 UPLC가 적절하게 평형을 이루도록 합니다.

여기에는 용매의 완전한 프라이밍이 포함되어야 합니다.컬럼을 부착하기 전에 새 컬럼의 평형 부피에 대한 제조업체의 지침을 따르고, 고분해능 질량 분석기용 제어 소프트웨어를 사용하여 향후 문제를 진단하는 데 도움이 되는 시작 역압 로그를 유지하십시오. 포지티브 모드 메서드를 만듭니다. 그런 다음 동일한 조건을 사용하여 네거티브 모드 메서드를 만듭니다.

기기를 청소하고 보정합니다. 분광계에 안정적인 스프레이를 설정하고 보정 용액이 소스와 광학 장치에서 적절하게 소멸될 시간을 허용합니다. 분무의 허용 가능한 안정성은 사용 중인 lc 방법과 동일한 유속으로 보정 용액을 주입하여 최소 100회 스캔하는 동안 강도의 상대적 표준 편차가 3-5%여야 합니다.

난수 생성기와 키를 사용하면 분석으로 인한 배치 효과를 피하기 위해 무작위 방식으로 샘플을 설정합니다. 모든 샘플에 대한 염기서열을 설정합니다. 적절한 주입 부피를 설정하고 첫 번째 샘플 전에 블랭크를 실행합니다.

샘플 간의 캐리오버 또는 매트릭스 효과가 의심되는 경우, 적절한 블랭크 또는 세척을 실행하고, 염기 서열을 시작하고, 실행 전반에 걸쳐 압력 변동 또는 신호 강도 손실과 같은 문제를 주기적으로 모니터링합니다. 심각한 문제가 감지되면 실행을 중지합니다. 기기를 청소하고 보정합니다.

분광계에 안정적인 스프레이를 설정하고 보정 용액이 소스와 광학 장치에서 적절하게 소멸될 시간을 허용합니다. 차등 분석을 시작하기 전에 총 이온 전류를 수동으로 확인하거나 샘플에서 알려진 화합물에 대해 필터링된 크로마토그램을 확인하십시오. 모든 샘플에서 실행 및 주입 슬래시 UPLC 슬래시 스프레이 안정성의 재현성을 보장하려면 질량 분석기의 RAW 데이터 파일을 체가 설치된 워크스테이션의 하드 드라이브로 전송하십시오.

체를 엽니다. 새로운 실험을 시작하고 적절한 파일을 체에 로드하십시오. 비교 그룹을 할당하고 단일 참조 파일을 선택하여 SIE V가 분석을 위한 파라미터를 생성할 수 있도록 합니다.

프롬프트에 따라 개별 실험의 요구 사항에 따라 매개변수를 조정합니다. 매개변수에서 positive 또는 negative mode에 대한 올바른 adduct list를 로드합니다. 분석이 완료되면 화면에 프레임 목록이 채워졌는지 확인합니다.

lc 정렬이 모든 랜드마크 피크와 겹치는지 확인합니다. 정렬되지 않은 lc runs 중 하나라도 랜드마크 피크에서 큰 편차를 보이는 경우. 이는 샘플에 문제가 있음을 나타낼 수 있습니다.

유사 표본 모집단 내에서 변동 계수를 기준으로 데이터를 표시합니다. 원하는 트레이트에 따라 목록을 정렬합니다. 다음으로, 그룹 간에 적절한 피크 정렬이 있는지 각 피크를 검토합니다.

피크 적분, 가우스, 피크 형상 신호 강도, 동위원소 및 부가물 할당. 추가 분석을 위해 원하는 대로 데이터를 내보내거나 최종 실험을 위한 확인 및 MS를 위한 목표 질량 목록을 생성합니다. 차등 녹색 점에 사용되는 두 프로그램에 의해 많은 수의 히트가 식별되었으며, 대조군에서 더 풍부한 특징인 반면 빨간색 점은 처리에서 더 풍부합니다.

도트 크기가 클수록 그룹 간의 접힘 변화 크기가 증가했음을 나타내고 색상의 강도는 그림의 채도가 증가함에 따라 P 값이 감소함을 나타냅니다. 다음은 유기상 양이온 모드를 보여주는 크로마토그램입니다: UPLC MS 분석 창 A는 S Civ 2.0의 총 이온 전류를 보여줍니다. XCMS에 의해 D paneth로 식별된 특징에 대한 추출된 이온 크로마토그램은 창 B에 표시됩니다. 창 C는 sve에서 알려진 rot으로 식별된 특징에 대해 추출된 이온 크로마토그램을 보여줍니다.

창 D는 총 이온 전류로 정규화된 sve에서 알려진 rot으로 식별된 특징에 대해 추출된 이온 크로마토그램을 보여줍니다. 알려진 부패 치료 그룹에서 감소된 차등적으로 풍부한 특징은 정확한 질량 데이터베이스 검색에 의해 d 파나딘으로 잠정적으로 확인되었습니다. 분석물의 정체는 U-P-L-C-H-R 탠덤 질량 분석법으로 확인되었습니다.

여기에 표시된 것은 샘플과 순수 화합물의 크로마토그램 및 질량 스펙트럼을 비교한 것입니다. 클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 환기가 잘 되는 흄 후드와 같은 적절한 예방 조치를 따라야 한다는 것을 잊지 마십시오.