플로우를 통해 마이크로 반응기와 MS 검출을위한 단백질의 빠른 효소 처리

이 프로토콜의 전반적인 목표는 전기 분무 이온화 질량 분석기로 단백질을 식별할 수 있도록 단백질의 빠른 효소 분해를 수행하는 플로우 스루 트립틱 mircoreactor의 제작을 설명하는 것입니다. 이 방법은 분리 및 정제된 단백질의 아미노산 염기서열을 설명하여 구조 및 기능의 다운스트림 특성화를 지원하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 빠르고 비용 효율적이며 미세 가공 플랫폼을 사용하는 워크플로에 통합하기 쉽다는 것입니다.

먼저 유리 모세관 식칼을 사용하여 큰 유리 모세관 튜브를 7-8cm 길이로, 작은 튜브 를 3-5cm 길이로 자릅니다. 현미경을 사용하여 양쪽 모세관 끝이 돌출된 버 없이 깨끗하고 직선으로 절단되어 있는지 확인합니다. 더 작은 모세관을 약 6mm 정도 큰 모세관의 한쪽 끝에 삽입합니다.

그런 다음 Q-tip을 사용하여 모세혈관 접합부 주위에 작은 접착제 방울을 바르고 접착제를 실온에서 밤새 경화시킵니다. 다음으로, 삽입된 모세관을 약 10-15mm 길이로 자릅니다. 이 끝은 electrospray 이온화 이미터로 작동할 것입니다.

더 큰 직경의 모세관의 반대쪽 끝을 길이가 4cm에서 5cm 사이로 미리 절단되고 PEEK 유니온에 연결된 1/32인치 PEEK 튜브에 삽입합니다. 그런 다음 5cm 길이의 1/16 PTFE 튜브 조각을 유니온의 반대쪽 끝에 삽입하고 조입니다. 깨끗하고 건조한 2밀리리터 유리 파일에 4밀리그램의 C18 입자를 넣고 0.5밀리리터의 이소프로판올을 추가합니다.

바이알을 닫습니다. 초음파 세척기에 넣고 초음파 처리하여 용액에 입자를 고르게 분산시킵니다. 다음으로, 250 마이크로 리터 주사기를 사용하여 200 마이크로 리터의 C18 슬러리를 추출합니다.

주사기를 1/16인치 PTFE 튜브에 삽입하고 슬러리를 큰 모세관에 천천히 분배합니다. 2-3mm의 입자 충전이 이루어질 때까지 모세관이 입자로 채워지는 것을 현미경으로 관찰합니다. 더 작은 모세관 튜브는 키스톤 효과를 통해 이러한 입자를 마이크로 반응기에 유지합니다.

마지막으로, 50 마이크로 리터의 물과 아세토 니트릴 용액 50 마이크로 리터로 헹군 다음 1 마이크로 리터의 아세토 니트릴과 혼합 된 49 마이크로 리터의 물이 들어있는 용액 50 마이크로 리터로 헹굽니다. PEEK 유니온에서 모세관 마이크로리액터를 분리하고 PEEK-T에 연결합니다. 그런 다음 1/32인치 PEEK 슬리브로 절연된 2cm 길이의 백금 와이어를 삽입하여 PEEK-T의 측면 암에 누출 없는 연결을 제공합니다.

반 미터 길이의 샘플 이송 모세관을 PEEK-T의 반대쪽 끝에 연결합니다. 1/32인치 PEEK 슬리브를 사용하여 누출 없는 연결을 제공하십시오. XYZ 스테이지에서 PEEK-T를 고정합니다.

그리고 전기 분무 이온화 이미터를 질량 분석기 입구 모세관에서 약 2mm 떨어진 곳에 배치합니다. 그런 다음 백금 와이어를 질량 분석기의 전기 분무 이온화 전원 공급 장치에 연결합니다. 또한 1/16인치 PEEK 슬리브를 사용하여 샘플 이송 모세관의 반대쪽 끝을 스테인리스강 유니온에 연결하여 누출 없는 연결을 제공합니다.

다음으로, 4-5cm 길이의 1/16인치 PTFE 튜브 조각을 스테인리스강 유니온의 반대쪽 끝에 연결합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 직렬 MS 데이터 수집 파라미터를 MS 기기를 제어하는 소프트웨어 패키지에 입력합니다. 해석을 수행하기 위한 설정을 준비할 수 있도록 메소드 파일로 저장합니다.

LTQ MS 시스템에는 자체 제작한 XYZ 스테이지가 포함된 수정된 ESI 소스가 장착되어 있어 질량 분석기를 다양한 시료 입력 접근 방식에 연결할 수 있습니다. 250마이크로리터 주사기에 2%의 아세토니트릴에 용해된 50밀리몰의 중탄산염 수용액을 로드합니다. 그런 다음 주사기를 마이크로 반응기에 연결하고 주사기 펌프 아래에 놓습니다.

마이크로리액터와 분당 2마이크로리터를 5분 동안 헹구어 분석을 준비합니다. 그런 다음 관심 단백질 샘플을 250마이크로리터 주사기에 넣고 샘플 용액을 분당 2마이크로리터로 5분 동안 주입합니다. 다음으로, 5마이크로몰 트립신 용액이 장전된 250마이크로리터 주사기를 주사기 펌프 아래에 놓고 흡수된 단백질을 마이크로리액터에 1-3분 동안 분당 2마이크로리터로 주입합니다.

각 실험 전에 트립신 용액을 새로 해동하고 준비하는 것이 중요합니다. 이것은 protolytic enzyme이 그 활성과 microreactor의 작동 pH를 유지하도록 할 것이며, 이는 약 8의 pH입니다. 250%의 트리플루오로아세트산이 2%아세토니트릴에 첨가된 1%로 구성된 수용액으로 250마이크로리터 주사기를 더 로드합니다.

이 용액을 사용하여 마이크로반응기를 분당 2마이크로리터로 5분 동안 헹궈 단백질 분해 분해 과정을 담금질합니다. 그런 다음 50% 아세토니트릴에 01% 트리플루오로아세트산이 첨가된 주사기로 전환하고 약 2000볼트의 전기 분무 이온화 전압에서 MS 데이터 수집 프로세스를 켭니다. 산성화된 용액을 사용하여 20-30분 동안 분당 300나노리터의 속도로 마이크로리액터에서 단백질 분해물을 용출하기 시작합니다.

함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 제공된 데이터 수집 파라미터를 사용하여 질량 분석 데이터를 획득합니다. 먼저 검색 엔진에 원시 데이터를 업로드하여 최소한의 중복을 가진 단백질 데이터베이스를 사용하여 LTQ MS 원시 파일을 처리합니다. 그런 다음 parent 및 fragment 이온 질량 허용 오차를 각각 2 및 1 dalton으로 설정하고 최대 2개의 절단이 누락된 완전 트립틱 단편만 검색에 사용합니다.

또한 높은 신뢰도와 중간 신뢰도의 오탐지 비율을 각각 1%와 3%로 설정하고, 특별히 특정 수정을 찾지 않는 한 번역 후 수정을 허용하지 않습니다. 마지막으로, 데이터를 필터링하여 신뢰도가 높은 펩타이드 일치항목만 선택합니다. 여기에 표시된 것은 마이크로리액터에서 단백질 가수 분해를 거친 단백질 혼합물에서 생성된 트립틱 펩타이드로 구성된 질량 스펙트럼입니다.

이러한 라벨은 가장 강력한 트립틱 펩타이드 이온을 나타내며 염기서열 및 해당 단백질 식별자를 제공합니다. 이 마이크로리액터는 단백질의 효소 분해를 수행하기 위한 구현하기 쉬운 실험 설정을 제공하며 30분 이내에 질량 분석 및 식별을 가능하게 합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 용액과 접촉하는 바이알 및 기기의 청결도를 유지하는 것이 시료 오염을 방지하는 데 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 다른 질량 분석 데이터 수집 방법을 사용하여 생성 펩타이드의 특성을 더 잘 분석하고 단백질 구조와 관련된 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 단백질체학(proteonomics) 분야의 연구자들이 단백질 분석을 위한 더 빠른 프로토콜을 개발하고 생물학적 샘플의 고처리량 탐사를 가능하게 하는 새로운 미세위상 플랫폼의 개발을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 기술은 25에서 50의 펩티드를 생성하는 다소 간단한 단백질 혼합물의 분석으로 제한됩니다.

이러한 펩타이드는 간단한 주입 실험으로 분석할 수 있으며 MS 분석 전에 액체 크로마토그래피를 분리할 필요가 없습니다. 유기 용제로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 화염을 피하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.