시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을 하며, 시간 분해 ElectroSpray 이온화 수소-중수소 교환 질량 분석법의 전반적인 목표는 정렬되고 무질서한 단백질의 기능을 구동하는 급격한 구조 변화를 조사하는 것입니다. 이 방법은 일시적 단백질 확인의 분화구화와 같은 구조 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 전기 방광조영술 및 NMR과 같은 고전적인 고해상도 기술에 대한 최소한의 문제가 아닙니다. 이 기술의 주요 장점은 밀리초 시간 척도에서 반응을 모니터링할 수 있다는 것인데, 이는 고리 능선, 몰팅글로비아 및 본질적으로 무질서한 단백질을 특성화하는 데 중요합니다.

이 기술의 의미는 신경 퇴행성 질환 치료로 확장됩니다. 그들은 종종 본질적으로 무질서한 단백질 영역의 잘못된 접힘 또는 응집을 포함하기 때문입니다. 이 방법은 매주 구조화된 단백질에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 촉매 회전을 겪는 효소 또는 단백질, 단백질 및 단백질, 리간, 상호 작용의 특성화와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 레이저 조각기를 사용하여 표준 PMM8 블록에 시약, 프로 투석 챔버 및 출력 채널을 도입하기 위한 입력 채널을 통해 플레이트를 레이저로 레이저로 연결합니다. 그런 다음 30 게이지 스테인리스 스틸 금속 모세관을 164 인치 두께의 절단 디스크 용 회전 도구를 사용하여 두 개의 164cm 조각으로 자릅니다. 사포를 사용하여 모세혈관 끝을 매끄럽게 하면 광학 현미경으로 볼 수 있습니다.

이제 견고한 다리미를 사용하여 모세관을 에칭된 PMM8 블록에 녹입니다. 연속 흐름, 시간 분해 운동 혼합기를 구성하려면 40cm 용융 섬모 유리 모세관을 약 15cm의 28게이지, 강철, 금속 모세관에 삽입합니다. 다음으로, 내부 유리 모세관의 한쪽 끝에 저전력 레이저 조각기 설정을 사용하여 2mm 노치를 생성하고 내부 유리 모세관의 이 끝을 밀봉합니다.

이것은 단백질의 직교하고 효율적인 혼합을 보장하는 중요한 단계이며, 이는 일반적인 저하에 있는 노치를 통해 빠져 나옵니다. 노치와 모세관 끝 사이의 2mm 모세관 간 공간은 혼합물과 부피입니다. 적절한 크기의 피팅과 튜빙 슬리브를 부착하고 디테륨을 전달하는 데 사용될 T 커넥터를 통합합니다.

다음으로, 내부 유리 모세관을 금속 모세관의 끝과 정렬하여 광학 현미경으로 볼 수 있습니다. 이것을 0밀리미터 위치로 표시합니다. 이 운동 믹서를 혼합 T.의 한쪽 끝에 부착 한 다음 혼합 T.For 펩신 활성화의 운동 믹서의 반대쪽 끝에 40 센티미터 융합 실리카 유리 모세관을 부착하십시오.

재부유된 프로티엔스에 NHS 활성화 농업 속도 50mg을 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 부드럽게 회전합니다. 다음 날, 수지를 수집하기 위해 실온에서 2 분 동안 1,000 배 G에서 혼합물을 스핀 다운합니다. 그런 다음 바인딩되지 않은 protiyes를 흡인합니다.

그런 다음 1ml의 블로킹 버퍼에 아그로스를 배양하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 회전합니다. 수지를 수집하고 블로킹 버퍼를 흡인시킨 후, 펩신 아구로스를 1ml의 5% 아세트산으로 5분 동안 배양합니다. 수지를 모으기 위하여 1, 000 시간 G, 실내 온도에 2 분 동안, 혼합물을 회전급강하켜서, 그 후에 최고 natent를 흡인하십시오.

이전 단계를 반복한 후 총 3회 세척한 후 장기간 사용을 위해 섭씨 4도의 아세트산 1ml에 비드를 보관하십시오. 장치를 조립하려면 멸균 주걱을 사용하여 5% 아세트산의 활성 펩신 아구로스 비드 슬러리로 단백질 분해 챔버를 채웁니다. 두 개의 빈 PMMA 블록 사이에 PMMA 마이크로 팔레트 플랫폼을 덮개로 배치하여 장치를 밀봉하고 실리콘 고무를 덧대어 액체가 새지 않도록 밀봉합니다.

금속 클램핑 플레이트를 사용하여 장치를 압력 밀봉합니다. 그런 다음 적절한 피팅을 사용하여 혼합 T를 장치의 입구에 부착합니다. 이제 5 % 아세딕산이 분당 10 마이크로 리터의 속도로 산 라인을 생각했습니다.

그런 다음 분당 1마이크로리터의 속도로 단백질 라인을 통해 50mm 아모니아산 완충액을 흘려보냅니다. 최적의 전기 스프레이 조건을 달성하기 위해 조정 가능한 절연 스테이지를 사용하여 수정된 사중극자 비행 시간 또는 Qtof 질량 분석기의 프런트 엔드에 장치를 연결합니다. ESI-MS 조건을 설정한 후 펩신 전용 스펙트럼을 획득합니다.

다음으로, 50 밀리미터 아모늄 아시테이트 완충액이 이전에 흐르고 있던 곳에서 분당 1 마이크로리터의 속도로 100 마이크로몰러에 50 마이크로몰러 또는 포스포-타우 단백질을 도입합니다. 시스템이 최소 10분 동안 평형을 이룰 수 있도록 한 후, 획득하기 전에 단백질 전용 스펙트럼을 획득합니다. Tao 또는 phospho tao 단백질이 흐르는 동안 T 커넥터를 통해 분당 3 마이크로 리터의 속도로 duteriumoxide를 도입하고 운동 믹서에서 반응하도록합니다.

라벨링 시간을 늘리려면 내부 유리 모세관의 위치를 수동으로 당겨 42밀리초에서 8초의 혼합 시간을 달성하여 시스템이 각 풀백 사이에 최소 10초 동안 평형을 유지할 수 있도록 합니다. 이 애니메이션은 일반적인 실험의 워크플로를 보여 줍니다. 단백질은 노치를 통해 빠져나와 다가오는 듀테륨과 혼합됩니다.

백본 M8 수소는 할당된 반응 시간 동안 교환되며, 이는 단백질 모세관을 뒤로 당겨 변경할 수 있습니다. 그런 다음 반응을 담금질한 다음 출구 ESI 바늘을 포함하는 마이크로 유체 플랫폼에서 분해합니다. 생성된 스펙트럼에는 소화된 단백질이 포함되어 있습니다.

개별 펩타이드에 대한 중수소 흡수 비율은 계산된 다음 3D 단백질 구조에 매핑됩니다. native 및 phospho-tau의 분해 프로파일은 유사하여 각각 77.1 및 71.7%의 염기서열 범위를 산출했으며, 가장 적합한 동위원소 분포와 4개의 단순 펩타이드에 대한 관련 중수소 흡수 값이 여기에 나와 있습니다. 각 펩타이드에 대한 시간 대비 중수소 흡수에 대한 백분율의 관찰된 운동 플롯은 관찰된 실험 속도를 추출하는 데 사용됩니다.

계산된 임의 품질 프로파일은 비교를 위해 표시되며 이론적 고유 등급을 추출하는 데 사용됩니다. 예상대로, 일반적으로 2차 구조 요소와 관련된 범위에서 보호 계수가 관찰되지 않았으며, 이는 천연 타우가 약한 내부 수소 결합을 나타내는 것을 확인했습니다. N과 C 말단, 중앙 영역, 응집 엎드린 영역에서 상당한 보호가 관찰됩니다.

하이퍼 포스포(hyper phospho) 관련 타우(tau)에서는 단백질 전체의 중수소 흡수가 전반적으로 증가하는 것이 관찰되었습니다. N 및 C 말단과 헥사펩타이드 2 영역에서 상당한 증가가 있습니다. 보호 등급 계수는 여기에 표시된 것처럼 무지개 구성표로 색상이 지정됩니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 분석을 방해할 수 있는 오염 물질을 최소화하기 위해 HPC 등급 이상의 영역을 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 공유 라벨링, 화학적 가교, 컴퓨터 모델링 및 다큐 스터디와 같은 다른 방법을 수행하여 3차원 단백질 구조를 일치시키거나 단백질 및 단백질 레긴 상호 작용 영역을 확인할 수 있습니다.

개발 후,이 기술은 구조 생물학 분야의 연구자들이 nuerodegenerative disease에서 가장 흔한 본질적으로 무질서한 단백질과 도메인을 탐구 할 수있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단백질 구조 및 역학 연구를 위해 시간 분해 전기 분무 이온화, 수소 중수소 교환, 질량 분석기를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.