Name: 시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 학습하세요 시간 해결 전기 분무 이온화 수소-중수소 교환 질량 분석법으로 단백질의 빠른 구조 변화를 밀리초 단위로 관찰하는 방법을. 본 기법은 구조 생물학 및 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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Adnan Sljoka 박사가 제공한 분석 도구를 사용하여 NMR 작업에서 예측된 '네이티브' 타우 앙상블에 대한 pdb 좌표 파일을 제공한 Markus Zweckstetter 박사에게 감사드립니다. 이 작업을 위한 자금은 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)의 ENGAGE 보조금 프로그램에서 제공했습니다.

참고 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)의 레이저 어블 레이션 (PMMA)에 의해 생성 된 증기는 독성이있을 수있다. 레이저 조각사가 작동 환기 시스템에 연결되어 있는지 확인합니다. (, 보안경, 얼굴 마스크, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지 폐쇄 발가락 신발) 공학적 관리 (흄 후드, 예리한 컨테이너) 및 개인 보호 장비의 사용을 포함하여 마이크로 유체 장치를 구축 할 때 모든 적절한 안전 방법을 사용합니다. 그것은 가능한 분석 과정을 방해 오염 물질을 감소 ACS 등급 이상의 모든 존재와 함께, 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 등급의 시약을 사용하는 것이 가장 중요합니다. 미세 유동 장치의 제조 1 <ol><li> PMMA 마이크로 유체 플랫폼의 건설 <ol><li> 표준 PMMA 블록 (8.9 X 3.8 X 0.6 cm) 및 구 시약을 도입하기위한 proteo을 입력 채널을 레이저 어블 레이션-용해 챔버 및 레이저 조각기 (17), (18)를 이용하여 출력 채널. 주의 : 연장 된 타원형 (30 × 5 mm X 0.05)의 단백질 분해 챔버 에칭. 입력 및 출력 채널은 PMMA 블록의 단부까지 연장하고, GA (30) 모세관을 수용하기 위해 두 폭과 깊이보다 더 큰 75 μm의 없어야한다. </li><li> . 1/64 &quot;두께 차단 디스크와 회전 공구를 사용하여 약 10cm 각의 두 부분으로 30 GA 스테인레스 금속 모세관 컷 모세관의 단부 (이것은 아래 보면서 용이해진다 부드럽게 사포를 사용하여 광학 현미경). </li><li> 납땜 인두를 사용하여 에칭 된 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) 블록으로 모세관 녹아. 입력 채널은 자동 주사기 펌프에 연결되며, 상기 출력 채널은 MS에 결합을 위해 사용될 것이다. </li></ol></li><li> 연속 흐름 시간 해결 운동 믹서의 건설 <ol><li> 융합을 구합니다석영 유리 모세관 (ID : 75 μm의, OD 150 μm의) 약 40cm의 약 15cm의 28 GA 스테인레스 금속 모세관 삽입. 필요한 반응 시간에 따라, 더 큰 ID와 장기간 외부 금속 또는 모세관을 사용한다. 주 : 금속 모세관의 &#39;참&#39;내경을 결정하는 정확한 반응 시간을 얻기 위해 중요하다. 이것은 비록 용매 모세관 유동 및 후방 압력, 레코딩 HPLC에 금속 모세관을 부착시킴으로써 이루어질 수있다. 내경 계산에 배압이 이루어질 수 있으며, 금속 모세관의 실제의 내경이 결정. 이것은 (윈도우 버전 6.49의 경우) 분자량 계산기 소프트웨어를 사용하여 계산 될 수있다. </li><li> 내측 유리 모세관의 일단에 저출력의 레이저 조각기를 이용하여 설정 2mm 노치 생산 내측 유리 모세관 (도 2)의 단부를 밀봉. 또한, 세라믹 유리 capillar를 사용하여 노치을Y 커터 공구 나 미세 절단 날과 회전 분쇄기. </li><li> 라인업 금속 모세관의 끝 부분과 상기 내부 유리 모세관 (이는 광 현미경에 의해 용이하게 볼 수있다). </li><li> 믹싱 티의 일단 (도 2)이 부착 운동 믹서. </li><li> 믹싱 티 운동 혼합기의 반대쪽에 약 40cm의 (가 150㎛ : 75 μm의, OD ID) 융합 된 석영 유리 모세관을 첨부. 이러한 반응을 종결 산 (5 % 아세트산의 pH 2.4)을 제공하기 위해 사용된다. 주의 : 반응물 자동 주입 펌프를 사용하여 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 튜브를 통해 기밀 주사기로 장치에 공급된다. </li></ol></li><li> 펩신의 활성화 <ol><li> 돼지의 위 점막에서 20mg의 펩신을 달아 결합 완충액 (0.1 M 인산 나트륨, 0.15 M 염화나트륨, pH를 6.0) 1 ㎖에 중단. </li><li> N 개의 -hydroxysuccinimide (NHS) 부활 아가 로스 비드 50 mg의 체중을 재들에 추가uspended 프로테아제 부드럽게 밤새 4 ℃로 회전한다. </li><li> 수지를 수집하고 실온에서 2 분 동안 1,000 XG에서 스핀 다운. </li><li> 언 바운드 단백질 분해 효소를 대기음. </li><li> 버퍼 (1 M 트리스 -HCl, pH를 6.0) 차단를 1ml 아가 로스를 인큐베이션하고 1 시간 동안 실온에서 부드럽게 회전한다. </li><li> 수지를 수집하고 실온에서 2 분 동안 1,000 XG에서 스핀 다운. </li><li> 블로킹 버퍼 대기음. </li><li> 1 mL의 5 % 아세트산, 5 분 동안 pH를 2.4 펩신 아가 로스 부화. </li><li> 수지를 수집하기 위해 2 분 동안 1,000 XG에서 스핀 다운. </li><li> 뜨는을 대기음. </li><li> 세 세척의 총 1.3.10 - 반복 1.3.8 단계를 반복합니다. </li><li> 장시간 사용을 위해 4 ℃에서 1 mL의 아세트산 비드를 저장한다. </li></ol></li><li> 장치 조립 <ol><li> 멸균 주걱을 사용하여 5 % 아세트산 펩신 활성 아가 로스 비드 슬러리와 단백질 분해 챔버를 채운다. </li><li> PMMA 마이크로 유체 platfor 배치장치를 밀봉하는 덮개와 같은 두 개의 빈 PMMA 블록 사이에서 m은 액밀 시일을 만드는 실리콘 고무 늘어서. </li><li> 압력 실에 장치를 금속 클램핑 플레이트를 사용한다. 주 : 클램프 맞춤 미세 유체 플랫폼을 맞추기 위해 제출되었다 10.1 cm X 7.4 cm X 1.2 cm 측정 개의 플레이트로 구성되어있다. </li><li> 10 μL / 분의 속도로 5 % 아세트산, pH가 2.4를 흐른다. 1 μL / 분의 속도로 단백질 라인 비록의 50 mM 아세트산 암모늄 완충액 (pH 6.9)을 흐른다. 주 : 아세트산 연속적 실험 전체에 걸쳐 디바이스를 통해 흐르는 것이 매우 중요하다. 거기에는 누설이없는 그 유체 ESI 소스 역할을한다 출력 채널에서만 종료되었는지 확인. </li><li> 몇 일렉트로 최적 조건을 달성하기 위해 조절 가능한 절연 스테이지를 사용하여 개질 중극 비행 시간 형 (Q-TOF) 질량 분광기의 선단부에 장치. 참고 : 바이 패스 스위치상업 ESI 소스의 존재를 시뮬레이션하기 위해 도입된다. (17) </li></ol></li></ol> 2. 시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 <ol><li> 펩신의 수집 및 단백질 만 스펙트럼 주 : ESI-MS 취득 60 V 디 클러스터링 전위에 5,000 4,500의 전압 양이온 모드에서 수행되며, 250 V 전위 집중. 스펙트럼은 (1 개) (S)의 주사 속도 350-1,500 m / z 범위에 걸쳐 취득 -1. <ol><li> 펩신 유일한 스펙트럼을 획득. 단백질이 추가되면이 스펙트럼에서 나타나는 모든 피크가 감산된다. </li><li> 50 mM의 아세트산 암모늄 완충액 이전 흘렀다 1 μL / 분의 속도로 50 ~ 100 μM 타우 / 인산화 타우 단백질 (19 정화 앞서 설명한 제조 13) 소개. </li><li> 단백질 만 스펙트럼을 획득. </li></ol></li><li> 취득 오F 시간 포인트 <ol><li> 100 μM 타우 / 인산화 타우 단백질은 1 μL / 분으로 흐르는 동안, 티 커넥터를 통해 3 μL / 분의 속도로 D O 2를 도입하고 운동 믹서에서 반응 할 수있다. 스펙트럼의 취득 전에 적어도 10 분 동안 평형을 허용 시스템. 음표 : 교환 후, 라벨링 반응 표지 단백질의 10 μL / 분으로 아세트산의 pH 2.4의 흐름과 절단에 의해 급냉된다 단백질 분해 챔버 내에서 발생한다. </li><li> 수동 레이블 시간을 증가 8의 42 밀리 초의 시간 혼합 달성 내측 유리 모세관의 위치를 ​​위로 끌어하기 위하여. 각 풀 - 백 사이에 적어도 10 분 동안 평형을 허용 시스템. </li></ol></li></ol> 3. 데이터 및 통계 분석 <ol><li> 펩티드를 확인하고 중수소 교환의 비율을 계산 <ol><li> , MS 스펙트럼 mMass 소프트웨어를 사용하여 분석 버전 5.5.0 (20)를 수행 </suP&gt;. </li><li> ExPASy FindPept 단백체 서버를 사용하여 펩티드를 확인하고 (21)을 필요한 경우 충돌 - 유도 해리 (CID)에 의해 확인한다. 참고 : 여기, 중수소 흡수 통합은 동위 원소 분포 분석 (22), (23)에 대한 자체 개발 FORTRAN 소프트웨어를 사용하여 측정 하였다. </li><li> 구체 웹 도구 (22, 24)를 사용하여 기본 시퀀스에 기초하여 이론적 극한 요금을 계산한다. </li><li> 단일 지수 비선형 회귀를 사용하여 데이터를 장착하고, 그래프와 통계 소프트웨어 (예 SigmaPlot)를 이용하여 정규화. 주 : 비율 K INT / K OBS 보호 인자 (PF)의 특정 영역은 상기 입체 앙상블 내의 구조화 정도 반 정량적 측정 값을 산출한다. </li></ol></li></ol>

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그들이 단백질의 매우 상세한 구조를 제공하기 때문에 이러한 X 선 결정학 및 NMR 구조 생물학 등의 방법이 유리하지만, 이러한 이미지들은 정적이다. 과도 종과 약하게 구조화 된 도메인의 특성은 이러한 기존의 방법으로 공부하면 어려운되고 있습니다. 따라서, 이러한 유형의 시스템에 동적 통찰력을 얻기 위해이 빠른 시간 규모에서 일을하는 것이 중요합니다. 우리는 성공적으로 지역화 된 펩타이드 수준에서 잘 연구 된 IDP 내에서 발생하는 구조적 변화에 대한 자세한 통찰력을 얻기 위해 TRESI - HDX-MS를 적용했습니다. 이 기술의 핵심 한계 중 하나는 펩신은 불특정 프로테아제라고하고, 그 자체에, 거의 전체 시퀀스 범위를 생성하지 않습니다. 순서 범위와 특이성을 개선하는 데 도움이하는 한 가지 방법은 소화 챔버 (26)에 아스 페르 길 루스 saitoi에서 단백질 분해 효소 타입 XIII을 결합하는 것입니다. 그것은이...

지난 몇 년 동안 상당한 발전 단백질 구조와 역학 1, 2, 3, 4를 측정하기위한 분석 기술의 개발되었습니다. X 선 결정학은 단백질 구조를 결정하기위한 원리 공구 유지하는 동안, 단백질의 고농도가 필요하다 광범위한 최적화 회절 품질의 결정을 제조 할 필요가있다. 이러한 막과 본질적으로 연관된 장애 단백질로서 결정화하기 어려운 단백질, 고전 수소 - 중수소 교환 (HDX) NMR (5)에 의해 연구되었다. 그러나 최근 수십 년간, HDX에 전기 분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS)의 커플 링은 빠르게 인기 6, 7 얻고있다. 질량 분석은 솔루션을 제공합니다X 선 결정학 및 NMR로 인한 제약 사항에. 특히, MS는 매우 민감한 (필수 μM 농도로 ㎚)이고, 단백질의 크기에는 제한이 거의 없다. 또한, MS 분석의 높은 듀티 사이클은 효소 회전율, 미스 폴딩, 복합체 및 기타 중요한 생물학적 과정을 겪는다 같은 단백질 연구의 가능성을 허용한다. 이러한 프로세스는 종종 두 번째 규모로 밀리 초에서 발생 및 분석에 앞서 시약의 신속한 혼합이 필요합니다. 2003 허용 반응에서 윌슨과 Konermann 소요 시간 - 해결 된 전기 분무 이온화 (TRESI)의 개발은 ESI-MS에 의한 의사 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. 이들의 설정은 계속 조정 가능한 반응 실 용적 8 모세관 믹서로 통합된다. 장치는 좁은 상호 capillar 내 혼합을 허용하도록 밀봉 내부 모세관의 측면으로 잘라 노치 두 동심 모세관 이루어져내부 모세관 (일반적으로 2mm)의 단부에 절 결부의 공간 Y. HDX 실험에 적용 할 때, 상기 내부 모세관 관심 단백질을 운반 외측 모세관 표지 D를 다음 ESI로 직접 전송하기 전에 HDX 라벨링 있도록 조절 반응 챔버로 들어가기 전에 단백질과 혼합 겪는다 2 O 용액을 운반 출처. 간단히, HDX 용액 9, 10 중수소 원자 교환을 진행 백본 아미드 수소에 의존한다. 교환은 염기 - 촉매 생리적 pH에서, 산 촉매는 약 2.6 이하의 pH에서 함께 널리 사용되고있다. 산도, 온도, 용매 접근성과 분자간 수소 결합 : 교환 율은 네 가지 요인에 기초한다. 이전의 두 가지 요인이 실험 특히 펩티드 백본 아미드 위치에서의 환율에 걸쳐 일정하게 유지되기 때문에, 우선적 인 dependen단백질 구조 (11)에 t. 밀접 루프와 무질서 영역 (때때로 전혀) (12)에 비해 실질적으로 느린 속도로 중수소 소요될 것이다 α 나선과 β-시트 광범위한 안정된 수소 결합 네트워크 영역으로 접혀. 이 글로벌 단백질 분석을 가능 여기서 구조 섭동 (예., 응집 또는 기질 결합시) 중수소 흡수 (도 1)에 다른 리드. 운동 모세관 믹서 중수소 흡수 제이션을위한 단백질 분해 챔버를 포함하는 미세 유체 플랫폼으로 통합 될 수있다. 이러한 단백질 분해 챔버 효과적으로 교환 반응을 급냉시키기 위해 낮은 pH로 유지하고, 지역화 된 펩티드 (도 2)로 단백질을 소화하기 위해 고정화 산 프로테아제를 필요로한다. 두 번째 시간 규모에 밀리 초에서 모니터링 백본 교환은 특히 중요하다어려운 내 구조적 변화 특성 루프 영역, 용융 구체와 본질적으로 무질서 단백질 (실향민) (13) (14)을 특성화한다. 대안 적으로, TRESI-HDX 또한 COREX 알고리즘 (DX-COREX) 방법 (15, 16)에 결합 된 중수소 교환을 이용하여, 현재 X 선 결정학 및 NMR의 방법을 통해 해결할 원자 구조를 갖고 있지 않은 단백질을 특성화하는데 사용될 수있다. 이 상세한 프로토콜은 병원성 hyperphosphorylated 상태입니다으로 모두가 기본 형태뿐만 아니라의에, 타우, 실향민을 연구하기 위해 TRESI - HDX을 적용합니다. 기본 타우가 가장 잘 연구 실향민 중 하나이지만, 약간은 아밀로이드 대응 (13)에 대한 알려져있다.

<table><tbody><tr><td>폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) 또는 PMMA</td><td>전문 플라스틱</td><td>SACR.250CCP</td><td>8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm</td></tr><tr><td>융합 실리카 유리 모세관</td><td>Polymicro Technologies</td><td>106815-0018</td><td>ID : 75 &micro; m, OD : 150 &마이크로; m</td></tr><tr><td>금속 모세 필라리</td><td>McMaster-Carr</td><td>28 ga &ndash; 89875K97 30 ga&nbsp; - 89875K99</td><td></td></tr><tr><td>플루오르화 에틸렌 프로필렌 (FEP) 튜빙</td><td>IDEX</td><td>1477 1548</td><td>ID: 0.007", OD: 1/16" ID: 0.020", OD: 1/16"</td></tr><tr><td>표준 폴리머 튜빙 커터</td><td>IDEX</td><td>A-327</td><td>1/16 "및 1/8" OD 튜빙</td></tr><tr>1/16 용<td>마이크로 정적 혼합 티</td><td>IDEX</td><td>M-540</td><td>" OD 튜빙</td></tr><tr><td>또는</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 티, 0.25&nbsp; mm 보어</td><td>Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td> <td>ZT1C</td><td>1/16 " OD 튜빙</td></tr><tr><td>PEEK 티 1/16" OD 튜빙</td><td>IDEX</td><td>P-727</td><td></td></tr><tr><td>10-32 암-암 Luer</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td></td></tr><tr><td>10-32 PEEK 이중 날개 너트</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td></td></tr><tr><td>페룰 1/16" OD 튜빙</td><td>IDEX</td><td>F-142</td><td></td></tr><tr><td>100 시리즈 로터리 툴</td><td>Dremel</td><td>F013010001</td><td></td></tr><tr><td>컷오프 디스크</td><td>Jobmate</td><td></td><td>1/64" 두께</td></tr><tr><td>스테레오마스터 디지털 줌 현미경</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-411</td><td></td></tr><tr><td>납땜 인두</td><td>Mastercraft</td><td>58-6301-2</td><td></td></tr><tr><td>VersaLaser</td><td>유니버설 레이저</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>Hamilton</td><td>81220</td><td>500&nbsp; &마이크로; L 용량</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-Activated Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>26196</td><td></td></tr><tr><td>돼지 위 점막의 펩신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6887-250MG</td><td></td></tr><tr><td>중수소산화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>151882-10X0.6ML</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>695092-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 아세테이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7330-500G</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software/Online Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDraw X3</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분자량 계산기</td><td></td><td>버전 6.49</td><td>오픈 소스 MS Tool</td></tr><tr><td>mMass</td><td></td><td>버전 5.5.0</td><td>오픈 소스 MS 도구</td></tr><tr><td>ExPASy FindPept</td><td>스위스 생물 정보학</td><td></td><td></td>연구소</tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat 소프트웨어</td><td>버전 11.0</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td>버전 1.5.0.4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QStar Elite Hybrid Q-TOF 질량분석기</td><td>AB SCIEX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

본질적으로 무질서 단백질 (실향민) 길이 때문에 안정적인 이차 구조 요소의 부족 구조적 생물 학자에 도전하고있다. 수소 - 중수소 빠른 시간 척도로 측정 교환 (HDX)는 네이티브 앙상블 일시적인 이형태 체의 특성을 허용 간단히 채워진 구조와 수소 결합 네트워크를 검출하는 고유 적합하다. 질량 분석에 HDX의 커플 링은 높은 감도, 낮은 샘플 소비와 단백질의 크기에 제한을 포함하여 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다. 이 기술은 밀리 초 시간 규모 HDX 라벨 시간을 모니터링 할 수있는 기능을 포함하여, 지난 몇 년간 크게 발전했다. 또한, 산성 프로테아제 마이크로 리액터 하우징 미세 유체 플랫폼 상 HDX 흐름을 도입함으로써, 우리는 펩타이드 레벨에서의 동적 속성을 지역화 할 수있다. 본 연구에서는 시간 - 해결 된 전기 분무 이온화 질량 분석법 (TRESI-MS)는 HDX의 WA 결합S는 타우 단백질에 잔여 구조의 상세한 그림뿐만 아니라 과인산에 유도 된 형태 적 변화를 제공하기 위해 사용된다.

네이티브 및 인산화 타우 분해 프로파일이 각각 77.1과 71.7 %의 서열 커버리지를 수득 유사 하였다. 펩타이드 중수소 흡수 값은 사내 개발 FORTRAN 소프트웨어를 사용하여 생성 된 이론적 인 분포로 관찰 동위 원소 분포를 피팅하여 구 하였다. 최상의 결합 분포 연관된 중수소 흡수 값과 함께 (도 3a)을 나타낸다. 통풍 운동 프로파일은 생성되고, 또한 하나의 지수 표현에 의해 설명되었다. 3 개 이상의 라벨 항상 관찰 모든 펩티드 운동 프로파일 (N = 3)를 분석 하였다. 관찰 된 흡수 값이 단일 지수 맞는 각 펩타이드 환율 상수 K 흑요석을 얻었다. 이것은 기본 시퀀스 종속 &quot;랜덤 코일&quot;고유 속도 상수 k 값 INT 비교된다. 계산 된 PF (INT K / K &lt;/ 1.52 S에서 ...

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

구조적 유연성은 단백질 기능에 결정적인 역할을 하며, 시분해 전기분무 이온화 수소-중수소 교환 질량 분석법(Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry)의 전반적인 목표는 정렬된 단백질 및 무질서 단백질에서 기능을 유도하는 급격한 구조적 변화를 조사하는 것입니다. 이 방법은 전자결정학 및 NMR과 같은 전통적인 고해상도 기술로는 접근하기 어려운 일시적인 단백질 구조의 특성화와 같은 구조 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 밀리초 시간 단위로 반응을 모니터링할 수 있다는 점이며, 이는 루프 영역, 몰딩 글로불 및 내재적 무질서 단백질을 특성화하는 데 중요합니다.이 기술의 영향은 신경퇴행성 질환의 치료로까지 확장됩니다. 이러한 질환들은 흔히 내재적으로 무질서한 단백질 영역의 미스폴딩이나 응집을 수반하기 때문입니다. 이 방법은 구조가 느슨한 단백질에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 촉매 전환을 겪는 효소나 단백질-단백질 및 단백질-리간드 상호작용의 특성 분석과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.이 절차를 시작하려면, 레이저 각인기를 사용하여 표준 PMM8 블록에 시약 도입을 위한 입력 채널, 투석 챔버 및 출력 채널이 포함된 플레이트를 레이저로 가공합니다. 그 다음, 회전 공구와 1/64인치 두께의 절단 디스크를 사용하여 30게이지 스테인리스강 금속 모세관을 10센티미터 길이의 두 조각으로 자릅니다. 사포를 사용하여 모세관의 끝부분을 매끄럽게 다듬으며, 이 과정은 광학 현미경으로 관찰하며 진행하면 수월합니다.이제 인두기를 사용하여 해당 모세관을 식각된 PMM8 블록에 녹여 고정합니다. 연속 흐름 시간 분해 Kinetics 믹서를 제작하려면, 40 cm 길이의 용융 실리카 유리 모세관을 약 15 cm 길이의 28 gauge 스틸 금속 모세관 내부에 삽입합니다. 다음으로, 저전력 레이저 각인기 설정을 사용하여 내부 유리 모세관의 한쪽 끝에 2 mm 홈을 만들고, 내부 유리 모세관의 이 끝부분을 밀봉합니다.이 단계는 단백질의 직교적이고 효율적인 혼합을 보장하는 중요한 과정이며, 단백질은 공통 디터륨(deterium)이 있는 노치(notch)를 통해 배출됩니다. 노치와 모세관 끝단 사이의 2 mm 모세관 간격이 혼합 부피가 됩니다. 적절한 크기의 피팅과 튜빙 슬리브를 장착하고, 디터륨을 전달하는 데 사용할 T-커넥터를 통합하십시오.다음으로, 광학 현미경으로 관찰하여 내부 유리 모세관을 금속 모세관의 끝단과 일직선으로 맞춥니다. 이 지점을 0 mm 위치로 표시합니다. 이 키네틱 믹서를 혼합 T-피스의 한쪽 끝에 부착합니다. 그 후 혼합 T-피스에 연결된 키네틱 믹서의 반대쪽 끝에 40 cm 용융 실리카 유리 모세관을 부착합니다. 펩신 활성화를 위해, Porsena gassic mucosa 유래 펩신 20 mg을 결합 버퍼 1 mL에 현탁합니다.재현탁된 단백질에 50 mg의 NHS 활성화 agro beads를 추가하고 4 °C에서 밤새 완만하게 회전시킨다. 다음 날, 상온에서 1,000 ×g로 2분간 원심분리하여 레진을 회수한다. 그런 다음 결합되지 않은 단백질을 흡입하여 제거한다.그 다음, agros를 1 mL의 blocking buffer에 넣고 상온에서 1시간 동안 천천히 회전시키며 인큐베이트합니다. 레진을 회수하고 blocking buffer를 흡입하여 제거한 후, pepsin agguros를 5% acedic acid 1 mL와 함께 5분 동안 인큐베이트합니다. 상온에서 1,000 ×g로 2분 동안 원심분리하여 레진을 회수하고, 상층액을 흡입하여 제거합니다.이전 단계를 총 3회 반복하여 세척한 후, 장기 보관을 위해 비즈를 1 mL의 아세트산에 넣어 4 °C에서 보관하십시오. 장치를 조립하려면 멸균 스패튤러를 사용하여 활성화된 펩신 어그로스 비즈를 5% 아세트산에 섞은 슬러리로 프로테아분해 챔버를 채우십시오. 액체 누설을 방지하기 위해 실리콘 고무를 댄 두 개의 빈 PMMA 블록 사이에 PMMA 마이크로 유체 플랫폼을 배치하여 장치를 밀봉하십시오.금속 클램핑 플레이트를 사용하여 장치를 압착 밀봉하십시오. 그런 다음 적절한 피팅을 사용하여 믹싱 T를 장치의 유입구에 연결하십시오. 이제 산 라인을 통해 5% 아세트산을 분당 10 µL의 속도로 흘려주십시오.그런 다음 50 mM 암모니아산 완충액을 단백질 라인에 1 µL/min의 속도로 흘려줍니다. 최적의 전기분무 조건을 달성하기 위해 조절 가능한 절연 스테이지를 사용하여 장치를 개조된 사중극자 비행시간형 질량 분석기(QTOF mass spectrometer)의 전단에 연결합니다. ESI-MS 조건을 설정한 후, 펩신만 포함된 스펙트럼을 획득합니다.다음으로, 50 mM ammonium acetate 버퍼가 흐르던 곳에 50~100 µM의 tau 또는 phospho-tau 단백질을 분당 1 µL의 속도로 주입합니다. 데이터 수집 전 시스템이 최소 10분 동안 평형에 도달하도록 기다린 후, 단백질 단독 스펙트럼을 수집합니다. tau 또는 phospho-tau 단백질이 흐르는 동안 T 커넥터를 통해 deuterium oxide를 분당 3 µL의 속도로 주입하고, 키네틱 믹서(kinetic mixer) 내에서 반응하도록 합니다.표지 시간을 늘리기 위해, 내부 유리 모세관의 위치를 수동으로 뒤로 당겨 42 밀리초에서 8초 사이의 혼합 시간을 확보하고, 각 당김 작업 사이에 시스템이 최소 10초 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 이 애니메이션은 일반적인 실험의 작업 흐름을 보여줍니다. 단백질이 노치를 통해 배출되어 다가오는 중수소와 혼합됩니다.단백질 모세관을 뒤로 당겨 반응 시간을 조절함으로써 백본 M8 수소 교환이 지정된 반응 시간 동안 이루어집니다. 그 후 반응을 정지시키고 출구 ESI 니들이 포함된 미세 유체 플랫폼에서 소화를 진행합니다. 생성된 스펙트럼에는 소화된 단백질이 포함됩니다.개별 펩타이드에 대해 중수소 흡수 백분율을 계산한 후, 이를 단백질의 3D 구조에 매핑합니다. native tau 및 phospho-tau의 소화 프로필은 서로 유사했으며, 서열 커버리지는 각각 77.1%와 71.7%였습니다. 여기에는 4개의 단순 펩타이드에 대해 가장 잘 맞는 동위원소 분포와 그에 따른 중수소 흡수 값이 표시되어 있습니다. 각 펩타이드에 대해 시간에 따른 중수소 흡수 백분율의 관찰된 속도론적 도표를 사용하여 관찰된 실험적 속도를 추출합니다.계산된 무작위 퀄레 프로필(quale profiles)이 비교를 위해 제시되었으며, 이를 통해 이론적인 고유 등급(intrinsic grade)을 추출합니다. 예상대로, 일반적으로 이차 구조 요소와 관련된 범위에서는 보호 인자가 관찰되지 않았으며, 이는 네이티브 tau가 약한 내부 수소 결합을 보인다는 점을 확인시켜 줍니다. N-말단과 C-말단, 중앙 도메인, 그리고 응집 성향 부위에서는 유의미한 보호 효과가 관찰됩니다.과인산화 관련 tau의 경우, 단백질 전반에 걸쳐 중수소 섭취(deuterium uptake)가 전반적으로 증가한 것이 관찰되었습니다. N-말단과 C-말단, 그리고 hexapeptide two 영역에서 유의미한 증가가 나타났습니다. 보호 인자(protection factors)의 정도는 여기 표시된 바와 같이 무지개색 체계로 색칠되었습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 몇 시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 실험 절차를 시도할 때는 분석을 방해할 수 있는 오염 물질을 최소화하기 위해 HPC 등급 이상의 영역을 사용하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 3차원 단백질 구조를 맞추거나 단백질-단백질 및 단백질-리간드 상호작용 부위를 확인하기 위해 공유 결합 표지, 화학적 가교 결합, 컴퓨터 모델링 및 문서 연구와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, 구조 생물학 분야의 연구자들은 신경퇴행성 질환에서 가장 흔히 발견되는 내재적 무질서 단백질 및 도메인을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단백질 구조 및 역학 연구를 위해 시간 분해 전기 분무 이온화, 수소-중수소 교환, 질량 분석법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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Biochemistry

생화학

단백질의 입체 구조와 역학은 단백질 구조 및 기능 사이의 관계를 이해하기위한 열쇠이다. 고해상도 질량 분광법과 결합 수소 교환은 단백질의 형태 적 역학 연구뿐만 아니라 접촉 인터페이스 및 알로 스테 릭 효과를 포함하여 단백질 - 리간드와 단백질 - 단백질 상호 작용을 특성화하기 위해 다양한 방법이다.

수소 환율 질량 분석을 사용하여 단백질의 역학 분석

여기에서는 고체 분말 내 단백질에 대한 고체 상태 아미드 수소/중수소 교환 질량 분석법(ssHDX-MS) 및 고체 상태 광분해 라벨링 질량 분석법(ssPL-MS)에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 비정질 고체 상태의 단백질 형태 및 상호 작용에 대한 고분해능 정보를 제공하며, 이는 제형 설계에 유용할 수 있습니다.

질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

단백질 복합물의 건축은 그들의 기능을 위해 필수적입니다. 다양 한 대량 spectrometric 기법을 결합 하 여 그들의 어셈블리를 공부 하는 강력한 입증. 우리 화학 cross-linking 및 네이티브 질량 분석에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 어떻게 이러한 상호 보완적인 기술을 다 소 단위 단백질 어셈블리의 구조를 명료 하 게 도움이 보여.

화학 Cross-linking 및 여러 소 단위 단백질 어셈블리의 건축을 그대로 단백질 복합물의 질량 분석

질량 분석 (MS)는 구조 조사와 고분자 어셈블리의 역학에 대 한 중요 한 도구로 떠오르고 있다. 여기, 우리는 단백질 복잡 한 형성과 ligand 바인딩이 MS 기반 접근을 통합 합니다.

단백질 구조와 통합 구조 질량 분석, 단백질-리간드 단지 분석

Lanthipeptide 는 펩타이드 천연 제품의 생합성 중에 다단계 반응을 촉매합니다. 여기서, 우리는 펩타이드 천연 제품 생합성에 관여하는 다른 유사한 효소뿐만 아니라 란티페타이드 신디사이저의 형성 역학을 연구하기 위해 사용될 수 있는 연속, 상향식, 수소 중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS) 워크플로우를 설명합니다.

펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼

여기에 제시된 것은 하향식 질량 분광법과 결합 된 모세관 전기 영동 기반 수소 / 중수소 교환 (HDX) 접근법을위한 프로토콜입니다. 이 접근법은 동시 차등 HDX 및 전기 영동 분리를 수행함으로써 서로 다른 상태의 단백질과 다른 단백질 형태를 포함하여 서로 다른 단백질 종 간의 고차 구조의 차이를 특성화합니다.

모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환을 통한 하향식 질량 분석법을 통한 단백질의 형태적 특성화

중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

단량체 알파 시누클레인의 구조적 앙상블은 생리 기능과 물리 화학적 특성에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법 및 후속 데이터 분석을 수행하여 생리학적 조건 하에서 본질적으로 무질서한 단백질의 단량체에 대한 형태 정보를 결정하는 방법을 기술한다.

생리학적 조건하에서의 알파-시뉴클레인 구조역학 연구를 위한 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

학습하세요 시간 해결 전기 분무 이온화 수소-중수소 교환 질량 분석법으로 단백질의 빠른 구조 변화를 밀리초 단위로 관찰하는 방법을. 본 기법은 구조 생물학 및 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

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