자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

임상 단백질체학(clinical proteomics)은 질병의 조기 진단과 예후에 유용한 바이오마커의 발견을 약속하는 중요한 새로운 분야입니다. 여기에서 우리는 단백질 추출, 재가용화 환원, 알킬화 및 효소 분해를 포함하여 임상 단백질체학에 사용되는 여러 처리 단계를 통합하는 새로운 디지털 미세유체역학 또는 DMF 방법을 보고합니다. DMF는 전극 어레이에서 시료 단백질의 개별 마이크로 액적을 사용하며 실온에서 실행할 수 있어 시료의 병렬 자동 분석이 가능합니다.

이 방법론은 기존 방법에 비해 상당한 발전을 이루었으며 임상 단백질체학에서 유용한 새로운 도구가 될 가능성이 있습니다. 안녕하세요, 저는 토론토 대학교 화학과 및 생체 재료 및 생물 의학 공학 연구소의 Erin Wheeler 교수의 Steve Sche입니다. 안녕하세요, 저는 토론토 대학교 휠러 랩(Wheeler Lab)의 가브리엘(Gabriel)입니다.

저는 토론토 대학의 웨어러 연구실에서 일하는 비비안 루크입니다. 저는 에린 휠러입니다. 스티브 메이스(Steve Mace)와 비비안(Vivian)과 함께 일할 수 있어서 행운입니다.

오늘은 디지털 미세유체역학(microfluidics)을 이용한 단백질체학 처리 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 단백질과 생물학적 샘플을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 시작하겠습니다.

Piranha 용액에서 유리 기판을 청소하여 흄 후드에서 절차를 시작합니다. 적절한 보호 기능을 착용하고 있는 동안, 피라냐 용액은 30%과산화수소에 3:1 농축 황산으로 구성됩니다. 따라서 작업하는 동안주의해야합니다.

유리 기판을 피라냐에서 10분 동안 배양하고 세척 후 헹구고 탈이온화 또는 de 물을 넣고 질소 가스로 기판을 건조시킵니다. 크롬 증착을 위해 전자빔 증착 챔버 내부에 기판을 250 나노미터 두께로 놓습니다. 이 두께에 도달하면 챔버에서 기판을 제거하고 이소프로판올로 헹군 다음 섭씨 115도에서 5분 동안 핫 플레이트에서 건조합니다.

30 초에 스핀 코팅으로 건조 된 기판을 헥사 메틸 자일라진 또는 HMDS로 프라임합니다.3000 RPM 스핀 코드를 Shipley S 1811 사진으로 다시 돌립니다. 동일한 매개 변수를 사용하지 마십시오.

기판을 섭씨 100도의 핫 플레이트에서 직접 사전 굽습니다. 그런 다음 포토 마스크를 통해 5 초 동안 자외선 또는 자외선 조사에 노출시켜 포토 레지스트를 패턴화합니다. 다음으로, Shipley MF 3 21 현상액에서 UV 노출 기판을 현상

DI 워터 포스트에서 기판을 헹굽니다.섭씨 100도의 핫플레이트에서 1분 동안 직접 굽습니다. 기판을 완전히 덮을 수 있을 만큼의 크롬 에칭에 기판을 30초 동안 담궈 노출된 크롬을 에칭합니다.

DI 물로 기판을 헹구고 Z 300 T 스트리퍼에 10분 동안 기판이 잠길 수 있을 만큼 충분히 담그십시오. 남은 포토레지스트를 제거합니다. DI 물로 헹구고 질소 가스에서 건조시킵니다.

이 증착 후, 화학 기상 증착에 의해 기판 위에 2-5 마이크로 미터 Paraline C.An 절연 폴리머가 50 나노 미터의 테프론 AF를 증착하여 용액을 스핀 코팅하여 표면을 소수성으로 만듭니다.60 초 동안 2000 RPM에서 식물 신경 FC 40의 무게당 1 % 중량. 기판에.

통과되지 않은 인듐 주석 산화물 또는 ITO 유리 기판으로 반복하여 상판 포스트를 만듭니다. 섭씨 160도의 핫 플레이트에서 두 기판을 모두 굽습니다. 디지털 미세유체 장치를 설정하는 데 10분이 걸립니다.

메스로 긁어 바닥 기판의 접촉 패드에서 폴리머 코팅을 제거합니다. 하단 기판의 노출된 패드를 40핀 커넥터와 연결하여 실험실 보기를 실행하는 컴퓨터의 전원을 켭니다. 우리는 dpad에 의해 제어되는 신호가 있는 릴레이가 포함된 집에서 만든 컨트롤 박스를 사용합니다.

컴퓨터 컨트롤 박스는 40 핀 커넥터를 통해 장치에 18 킬로 헤르츠 신호 당 100 볼트 RMS의 적용에 대한 사용자 제어를 용이하게합니다. 또한 함수 발생기와 증폭기의 전원을 켭니다. 총 두께가 140마이크로미터인 양면 테이프 두 개를 하단 기판의 가장자리에 배치하여 장치를 조립합니다.

4마이크로리터의 DI 물을 저장소 중 하나에 피펫으로 넣고 테프론 코팅면이 아래를 향하도록 하여 패턴이 없는 인듐 주석 산화물 슬라이드를 장치 상단에 배치하여 장치를 둘러쌉니다. 접지 커넥터를 상판 런에 부착합니다. 실험실은 피드백 제어를 보정하기 위해 실험실 보기에서 초기화 프로그램을 만들었으며 이제 장치를 실험할 준비가 되었습니다.

이 프로토콜에서는 소 혈청 알부민 또는 BSA를 단백질 샘플로 사용하여 디지털 미세유체역학 설계 및 사용을 입증할 것입니다. BSA는 부피당 0.08%onic F1 27 중량으로 100밀리몰 트리스 HCL pH 7.8로 만들어진 작업 버퍼 또는 WB에 희석됩니다. 각 샘플과 시약 용액을 1ml씩 준비하고 첨가될 저장소를 표시합니다.

시약 준비 후 장치에서 상판을 제거하고 4마이크로리터의 용액을 할당된 저장소에 피펫으로 넣습니다. 저장소를 채운 후 상판을 장치에 교체하십시오. 사내 랩 보기 프로그램을 사용하여 다음 단계를 실행합니다.

컴퓨터 인터페이스를 통해 사용자는 저장소에서 약 600나노리터 방울을 분배하고 전극 어레이의 방울을 조작할 수 있습니다. 먼저, R 1의 샘플을 포함하는 단백질 방울과 R 2의 침전제 방울을 분배합니다. 두 방울을 합치고 결합된 방울이 5분 동안 배양하여 단백질이 표면에 침전되도록 합니다.

침전된 단백질에서 폐기물 저장소로 상등액을 작동시킵니다. R 3, 침전된 단백질을 세척하기 위해 R 4에서 세척 완충액 3방울을 분배하고 침전된 단백질을 가로질러 폐기물 저장소로 밀어 넣습니다. 침전물을 건조시키고 R 5의 재용해 완충액 한 방울을 단백질에 분배합니다.

침전물이 용해될 때까지 완충액을 20분 동안 배양합니다. 다음으로, R six에서 환원제 방울을 분배하고 샘플 방울과 병합합니다. 결합된 액적을 원형 패턴으로 6개의 전극에 걸쳐 작동하여 혼합합니다.

액적을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. R seven의 알킬화제 한 방울을 분주하고 이를 시료 한 방울과 병합한 후 혼합합니다. 물방울을 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 배양합니다.

마지막으로, R eight에서 트립신 방울을 분주하고 샘플 방울과 병합한 다음 혼합합니다. 물방울을 섭씨 37도에서 핫 플레이트의 페트리 접시에 담아 3시간 동안 배양합니다. 반응을 종료하려면 상판을 제거하고 피펫팅으로 분해를 담금질합니다.

물 속의 2.5% 트리클로로아세트산 6ml를 반응 방울에 묻힙니다. 담금질된 반응 생성물을 바닥 플레이트에서 직접 시료 방울을 빨아들여 정제합니다. 제조업체의 지침에 따라 C 18 지퍼 팁을 사용하여 이제 필요에 따라 샘플을 희석하고 이 시스템을 사용하여 샘플의 단백질을 식별하기 위해 질량 분석법으로 평가할 수 있습니다.

그 다음에는 99.9% 신뢰 구간 및 최소 30%의 염기서열 범위에 해당하는 1배 E에서 음의 3까지의 확률 점수로 질량 분석 단백질을 식별했습니다.따라서 DMF는 자동화된 단백질체학 시료 처리에 매우 유용한 방법론입니다. 그래서 우리는 오늘 디지털 미세유체를 활용하여 자동화된 방식으로 단백질을 추출하고 처리하는 방법을 보여주었습니다. 이 방법론은 단백질 분리 및 식별 중 시료 손실 및 오염에 대한 잠재적인 솔루션을 제공합니다.

우리는 미래에 이 방법을 면역 분석 및 세포 기반 분석을 포함한 다른 생물학적 응용 분야에 적용하기를 희망합니다. 이러한 유형의 실험을 할 때 가장 중요한 것은 그것을 즐기는 것을 기억하는 것입니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.