Name: 자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 배우세요 디지털 마이크로플루이딕스를 활용한 임상 프로테오믹스 자동화 방법입니다. 단백질 추출, 알킬화, 효소 소화 등 여러 단계를 통합하여 실온에서 병렬 분석이 가능합니다.

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우리는 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) 및 금융 지원 캐나다 암 협회 감사드립니다. SCCS 감사 NSERC과 VNL 감사 대학원 장학금에 대한 온타리오 대학원 장학금 (OGS) 프로그램. ARW는 캐나다 연구 의자에 대한 CRC 감사드립니다.

1 부 : 장치 제작 <ol><li> 피라 냐가 솔루션의 클린 유리 기판 (3시 1분 CONC 황산 :. 30 % 과산화수소). 자주 교반 10 분 피라 냐가 솔루션의 기판을 둡니다. </li><li> deionized (DI) 물에 rinsing와 N 2 가스로 기판을 건조 후, 크롬 증착 (250 nm의 두께)에 대한 전자빔 챔버 내부에 기판을 배치. </li><li> 크롬 코팅 기판 탈수, 115에서 5 분 뜨거운 접시에 빵을 다음 이소프로판올에 씻어 ° C. </li><li> 스핀 코팅 (30 S, 3000 RPM)에 의해 헥사메틸디실아젠 (HMDS)와 기판 및 주요 건조. 시플리 S1811 포토 레지스트로 다시 스핀 - 코팅 (동일한 매개 변수를 사용하여). </li><li> 사전 베이킹 핫 플레이트 (100 ° C, 2 분)에 기판, 다음 패턴 photomask를 통해 5 S에 대한 자외선 (UV) 방사선에 노출에 의해 포토 레지스트. </li><li> DI 워터에서 3 분 및 세척을위한 시플리 MF 321 개발자의 UV - 노출된 기판을 개발. 100 뜨거운 접시에 포스트 - 베이크 1 분 ° C. </li><li> 30 S.에 대한 크롬 에칭에 immersing에 의해 에칭 노출 크롬 남아있는 포토 레지스트를 제거하는 10 분 AZ300T 스트리퍼에서 다음 젖어, 디 물에 헹굼. DI 물에 씻어 N 2 가스로 건조. </li><li> 크롬을 패턴 기판 베어링에 보증금 2-5 μm의 화학 기상하여 Parylene - C (단열 고분자) 증착. 보증금 60 S. 2000 RPM에서 스핀 코팅 솔루션 (1 % Fluorinert에 WT / WT FC - 40)에 의해 테플론 - AF 50 NM (표면 소수성를 만들기 위해) 핫 플레이트 (160 ° C, 10 분)에 게시 - 베이크. </li><li> 상단 플레이트 형태로, 코트 위에서 취소 패턴 인듐 주석 산화물 (ITO) 유리 기판 50 nm의 테플론 - AF. </li><li> 핫 플레이트 (160 ° C, 10 분)에 두 기판을 게시 - 베이크. </li></ol> 2 부 : 장치 설정 및 자동화 <ol><li> &quot;두 판&quot;구성 운영 디지털 microfluidic 장치에 1 방울은 바닥 기판 (패턴 전극) 및 최고의 기판 (일반적으로 ITO에서 형성 일 연속, 투명 전극과) 사이에 위치하고 있습니다. </li><li> 장치를 설정하려면, 때론 부드러운 근근이 살아가고하여 하단 기판의 접촉 패드에서 폴리머 코팅을 제거합니다. 커플 40 핀 커넥터 (그림 1A)와 하단의 기판의 패드를 찾아냈다. </li><li> 전원에 LabView (내쇼날 인 스트 루먼트, 오스틴, TX), 가정 내장된 컨트롤 박스 (내쇼날 인스 트루먼 트의 DaqPad의 신호에 의해 제어되는 고전압 릴레이의 배열을 갖춘), 함수 발생기 및 증폭기를 실행하는 컴퓨터 . 컴퓨터 / 제어 박스 100 V RMS / 40 핀 커넥터를 통해 장치를 18 kHz에서 신호의 애플 리케이션을 통해 사용자 정의 컨트롤을 용이하게합니다. </li><li> 하단 기판의 가장자리에 위치 양면 테이프 두 조각 (140 μm의 총 두께)에 의해 장치를 조립하고 unpatterned ITO 슬라이드 (상단 플레이트)로 작성해야합니다. </li><li> 제어 시스템을 초기화하려면, 피드백 제어를 보정하기 위해 LabView 보정 프로그램 (자체 작성)를 실행합니다. </li><li> 해당 저수지 (아래 3 항 참조)에 샘플 및 시약을로드하고 상단 기판 (테플론 코팅 면이 아래로 향하게)으로 그들을 묶으십시오. 상단 기판에 접지 커넥터를 연결합니다. </li><li> LabView에서 작동 코드 (자체 작성)로드 및 비말의 작동을 시작하려면 프로그램을 실행합니다. </li></ol> 3 부 : 샘플 및 시약 준비 <ol><li> 100 MM TrisHCl (산도 7.8)와 0.08 %의 Pluronic F127 w / V. : 작업 버퍼 (WB)를 준비 </li><li> 같은 그림 1B에 표시된 WB와 피펫 예제에서 장치에 저수지 1 (R - 1)로 분석하는 단백질 (S), 디졸브. </li><li> R - 2로 침전제, 20 % Trichloroacetic 디 물 속에 산성 (TCA)와 피펫을 준비합니다. </li><li> 버퍼를 씻어 준비, 30분의 70 클로로포름 / acetonitrile (ACN)와 피펫 R - 4로. </li><li> R - 5로 resolubilizing 버퍼, 100 MM의 탄산수 소 암모늄 (산도 8.0)와 0.08 % Pluronic F127 W / V 및 피펫를 준비합니다. </li><li> R - 6에 WB와 피펫 10 MM에 reductant, 트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine (TCEP)를 디졸브. </li><li> R - 7으로 WB와 피펫 12 MM에 alkylating 에이전트 iodoacetamide (IAM)를 디졸브. </li><li> R - 8로 전체 단백질 샘플의 농도 (위, 3.1 참조) 피펫의 to1 / 5와 같은 농도에서 WB에 트립신을 디졸브. </li></ol> 4 부 : 디지털 Microfluidic 샘플 처리 <ol><li> 다음 절차는 자체로 작성된 LabView 코드에 의해 자동으로 구현됩니다. 저수지에서 적절 방울의 볼륨은 전극 (이 경우, 적절 방울이 ~ 600nL 있습니다)의 크기에 의해 정의됩니다. </li><li> R - 1 단백질 함유 시료의 비말과 R - 2 (그림 2, 프레임 1)에서 침전제의 비말을 분배. 두 방울을 병합하여 통합 비말은 PR의 강수량 그 결과, 5 분 품어 수표면에 oteins (그림 2, 프레임 2-3). 폐기물 저수지, R - 3 (그림 2, 프레임 4) 떨어진 시켰던 단백질에서 뜨는을 행동시키다. </li><li> R - 4에서 세척 버퍼 세 방울을 분배하고 폐기물 저수지, R - 3 (그림 2, 프레임 5)에 시켰던 단백질에 걸쳐 몰아라. </li><li> 침전물은 건조하도록 허용하고, 단백질에 R - 5 resolubilizing 버퍼의 비말을 분배. 침전물은 (그림 2, 프레임 6) 해산 때까지 버퍼 20 분 부화 수 있습니다. </li><li> R - 6에서 reductant의 비말을 분배하고 샘플 비말로 병합합니다. 원형 패턴 6 전극에 걸쳐 그것을 작동하여 결합 비말을 섞는다. 비말은 humidified 챔버 (그림 3, 프레임 1-2)에 실온에서 1 H에 대한 부화 수 있습니다. </li><li> R - 7에서 에이전트를 alkylating의 비말을 분배하고 (4.5)를 혼합하여 다음 예제 비말, 그것을 병합합니다. 비말은 빛으로부터 보호 humidified 챔버에 상온에서 15 분, (그림 3, 프레임 2-3)에 대한 부화 수 있습니다. </li><li> R - 8 트립신의 비말을 분배하고, (4.5)를 혼합하여 다음 예제 비말, 그것을 병합합니다. 비말, 37 3 H에 대한 부화 ° C를 철판에 humidified 챔버 (그림 3, 프레임 3-4)에서 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : 후처리 샘플 준비 <ol><li> 물에 2.5 % trifluoroacetic 산성의 0.6 ML를 추가하여 최고 기판과 담금질의 소화 반응을 제거합니다. </li><li> 제조 업체의 지침에 따라 C18 ZipTips을 (Millipore, 빌레 리카, MA)를 사용하여 침묵 반응 생성물을 정화. </li><li> 100 ML의 최종 볼륨 디 물 샘플을 정화 희석. </li></ol> 6 부 : 질량 분광법 <ol><li> 탠덤 질량 분석기로 성관계를 나노 HPLC에 처리 샘플을 평가합니다. HPLC 시스템은 Eksigent 테크놀로지이며 트랩 칼럼 (3mm의 디아. C18 비즈, 150 μm의 ID를 X 2.5 cm)와 반전 상 분리 칼럼 (3 μm의 디아 갖춘 여기서 사용됩니다. C18 비즈, 75 μm의 ID x는 15cm). 여기에 사용되는 질량 분석기는 써모 피셔 사이 언티픽 -에서 LTQ입니다. </li><li> 물에 5 % acetonitrile로 구성된 모바일 단계에 5μL/min에서 트랩 칼럼에 2 μL 샘플을로드합니다. 20 % acetonitrile에서 25 분 이상 80 % acetonitrile에 선형 그라데이션을 사용하여 0.5μL/min에 반대 위상 칼럼에서 샘플을 분리. 또 다른 10 분에 대해 80 % acetonitrile에서 실행을 계속합니다. </li><li> 탠덤 질량 분광법에 의한 열의를 eluting 밴드를 분석합니다. 작품 여기보고에서, eluent는 NewObjective에서 nanoelectrospray 방출기 (10 μm의 ID와 테이퍼 20 μm의 아이디)를 통해 질량 분석계로 샘플링됩니다. </li><li> SEQUEST 같은 데이터베이스 검색 프로그램을 사용하여 샘​​플에서 단백질을 식별합니다. 이 작품에서는, 우리는 Bioworks v3.01 (온습 피셔 사이 언티픽)에 통합 SEQUEST의 버전을 사용하고, 확인된 단백질은 1.0E - 03 미만의 확률 점수 (99.9 % 신뢰 구간에 해당) 및시의 시퀀스 coverages 있었 최소 30 % (그림 4). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> 그림 1. (A) 사진 자동 비말의 작동을위한 40 핀 커넥터에 DMF 장치를 성관계를합니다. (B) 장치의 개략도는 샘플과 proteomic 검사 결과에 필요한 시약의 위치를​​ 묘사. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> 영화에서 그림 2. 프레임은 20 % TCA (침전제)와 30분의 70 %의 클로로포름 / acetonitrile (솔루션 린스)의 자동 추출 및 BSA의 정화를 묘사. 프레임 6, 시켰던 단백질 100 MM의 탄산수 소 암모늄의 비말에 redissolved 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> 그림 3. 순차 감소, 알킬화 및 resolubilized 단백질의 비말의 소화를 설명하는 동영상에서 프레임. 이 그림에서는 시약은 지혜로움에 대해 염료와 색, 연습, 시약은 색 없습니다. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> 디지털 microfluidics 처리 소 혈청 알부민의 샘플 그림 4. MS의 크로마토 그램. 25 서로 다른 펩티드는 44%의 시퀀스 범위를 해당 (99.9 % 신뢰 구간) 확인되었습니다.

<ol><li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+Revolution%3A+A+New+Paradigm+for+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mat%22%5BJournal%5D)">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li>
<li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li>
<li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li>
</ol>

proteomics의 표준 시료 처리 및 가공의 부족은 필드에 대한 중요한 제한 사항입니다. 또한, 기존의 macroscale 샘플 처리 손실 및 오염을 샘플로 이어질 수있는 여러 컨테이너 및 솔루션 전송을 포함합니다. 이러한 문제에 대한 잠재적인 해결책은 디지털 microfluidics 1 (DMF)에 의존 샘플 처리를위한 통합 시스템을 형성하는 것입니다. 이전 작품에서는, DMF는 이기종의 불필요한 오염 물질의 효율적인 제거 단백질이 포함된 솔루션을 유용하는 표시했다. 마찬가지로 2, DMF는 통합에 대한 다단계 솔루션 위상 처리의 통합 (감소, 알킬화와 소화)와 호환되도록 표시되었습니다 장치. 여기 3 우리는 솔루션 위상 처리 다음 강수량에 의해 단백질의 추출을위한 자동 비말 컨트롤과 함께 완벽하게 통합된 시스템을 증명하고있다. 우리는 이와 같은 방법을 널리 채택있다면, proteomic 샘플 처리에 내재된 인간의 오류가 대부분 더 나은 재현성과 분석의 결과, 제...

자동 proteomic 처리를위한 디지털 microfluidics

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

임상 proteomics는 질병의 조기 진단과 예후에 대해 도움이 될 생체의 발견 약속, 중요한 새로운 분야로 떠오르고있다. 임상 proteomic 방법이 다양하지만, 일반적인 특성은 매우 이질적인 유체 (즉, 혈청, 전혈 등) 사전 분석 (2) 광범위한 생화학 처리 단백질의 추출 (I)가 필요합니다. 여기, 우리는 임상 proteomics에 사용되는 몇 가지 처리 단계를 통합하는 새로운 디지털 microfluidics (DMF) 기반의 방법을보고합니다. 이것은 단백질 추출, resolubilization, 감소, 알킬화 및 효소 소화가 포함되어 있습니다. 디지털 microfluidics은 nanoliter - microliter 크기 방울이 열려있는 표면에 조작하는 microscale 유체 처리 기술입니다. 방울이 유전체 층으로 코팅 아르 전극의 배열의 상단에 위치 - 전기 가능성이 비말에 적용하면 요금이 유전체의 양쪽에 축적. 요금은 비말의 위치를​​ 제어하는​​ 데 사용할 수있는 정전기 손잡이 역할을하고, 일련의 전극의 순서를 바이어스에 의해 방울은 분배 이동, 병합, 혼합, 그리고 표면에 분할 할 수 있습니다. 따라서, DMF는 빠르게, 순차, 다단계, 소형 자동 생화학 assays를 운반하는데 자연 적합합니다. 이것은 종래의 방법 (수동 또는 로봇 pipetting에 의존)을 통해 상당한 발전을 대표하고, 임상 proteomics에 유용한 새로운 도구가 될 수있는 잠재력이있다. 메 J. Jebrail, 비비안 N. 룩, 그리고 스티브 CC Shih이 작품에 동등하게 공헌했습니다. 세르지오 LS 프레이리의 현재 주소는 600 사우스 43 번가, 필라델피아, PA 19104에 위치한 사이언스 대학에 있습니다.

전기 분야의 응용 프로그램에 의해 전극의 배열에 - 디지털 Microfluidics는 개별 방울 (ML ~ NL)의 조작에 의해 특징 기법입니다. 그것은 빠른 속도, 순차, 소형 자동 생화학 assays을 수행에 적합합니다. 여기서 우리는 몇 가지 proteomic 처리 단계를 자동화 할 수있는 플랫폼을보고합니다.

자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

임상 프로테오믹스는 조기 진단과 ...에 유용한 바이오마커의 발견을 가능하게 하는 중요한 새로운 학문 분야로 부상했습니다.

임상 프로테오믹스는 질병의 조기 진단 및 예후에 유용한 바이오마커 발견을 가능하게 하는 중요한 새로운 학문 분야입니다. 본 논문에서는 단백질 추출, 재용해, 환원, 알킬화 및 효소 소화를 포함하여 임상 프로테오믹스에 사용되는 여러 처리 단계를 통합한 새로운 디지털 미세유체(digital microfluidics, DMF) 방법을 보고합니다. DMF는 전극 어레이 상에서 시료 단백질의 이산 미세 물방울을 이용하며 상온에서 작동할 수 있어, 시료의 자동화된 병렬 분석이 가능합니다.이 방법론은 기존의 방식보다 크게 진보된 것이며, 임상 프로테오믹스 분야에서 유용한 새로운 도구가 될 잠재력을 가지고 있습니다. 안녕하세요, 저는 토론토 대학교 화학과 및 생체재료 및 의공학 연구소의 Erin Wheeler 교수님 연구실의 Steve Sche입니다. 안녕하세요, 저는 토론토 대학교 Wheeler 연구실의 Gabriel입니다.저는 토론토 대학교의 Wheeler 실험실 소속인 Vivian Luke입니다. 저는 Erin Wheeler이며, Steve Mace 그리고 Vivian과 함께 연구하게 되어 영광입니다.오늘은 디지털 미세유체 기술을 이용한 단백질체 분석 처리 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 단백질과 생물학적 시료를 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.피라냐 용액(Piranha solution)으로 유리 기판을 세척하며 흄 후드 내에서 실험 절차를 시작하십시오. 적절한 보호구를 착용한 상태에서, 피라냐 용액은 진한 황산과 30% 과산화수소를 3:1 비율로 혼합하여 제조합니다. 따라서 취급 시 각별한 주의가 필요합니다.유리 기판을 피라냐 용액에 10분 동안 침전시키고, 세척 후 탈이온수(deionized water)로 헹군 다음 질소 가스로 건조합니다. 기판을 전자빔 증착기에 넣고 크롬을 250 nanometers 두께로 증착합니다. 해당 두께에 도달하면 기판을 챔버에서 꺼내 이소프로판올로 헹군 후, 핫플레이트에서 115 °C로 5분 동안 건조합니다.건조된 기판을 hexa methyl xylazine 또는 HMDS로 30초 동안 스핀 코팅하여 프라이밍합니다. 동일한 파라미터를 사용하여 Shipley S 1811 photoresist로 3000 RPM에서 다시 스핀 코팅합니다.기판을 핫플레이트 위에서 100 °C로 사전 베이킹합니다. 그런 다음 포토마스크를 통해 5초 동안 자외선(UV) 조사를 하여 포토레지스트 패턴을 형성합니다. 다음으로, 기판이 충분히 잠길 정도의 Shipley MF 3 21 현상액에 UV 노광된 기판을 넣고 3분 동안 현상합니다.기판을 DI water로 헹굽니다. 핫플레이트에서 100 °C로 1분 동안 직접 베이크합니다. 기판이 완전히 잠길 정도의 크롬 식각액에 30초 동안 담가 노출된 크롬을 식각합니다.기판을 DI water로 헹구고, 기판이 충분히 잠길 정도의 Z 300 T 스트리퍼에 10분 동안 담급니다. 이는 잔류 포토레지스트를 제거하기 위함입니다. DI water로 헹군 후 질소 가스로 건조합니다.이 증착 과정 이후, 화학 기상 증착법(CVD)을 통해 기판 위에 2~5 µm 두께의 Paraline C 절연 폴리머를 증착합니다. 그 다음, 표면을 소수성으로 만들기 위해 Florinert FC 40에 1% w/w로 희석된 Teflon AF 용액을 기판 위에 2000 RPM으로 60초 동안 스핀 코팅하여 50 nm 두께로 증착합니다.상부 플레이트 포스트를 만들기 위해 처리되지 않은 인듐 주석 산화물 또는 ITO 유리 기판으로 동일하게 반복합니다. 디지털 미세유체 장치를 구성하기 위해 두 기판을 핫플레이트 위에서 160 °C로 10분 동안 굽습니다.메스로 긁어내어 하단 기판의 접촉 패드에서 폴리머 코팅을 제거합니다. 하단 기판의 노출된 패드를 40핀 커넥터와 연결하고 LabVIEW가 실행 중인 컴퓨터의 전원을 켭니다. 당사는 dpad로 제어되는 신호 릴레이가 포함된 자체 제작 제어 박스를 사용합니다.컴퓨터 제어 박스를 통해 40핀 커넥터를 사용하여 장치에 18 kilohertz 신호당 100 volts RMS를 인가하도록 제어합니다. 또한 함수 발생기와 증폭기의 전원을 켭니다. 총 두께가 140 micrometer인 양면테이프 두 조각을 하단 기판의 가장자리에 부착하여 장치를 조립합니다.DI water 4 µL를 리저버 중 하나에 피펫으로 넣고, 패턴이 없는 indium tin oxide 슬라이드의 테플론 코팅면이 아래로 향하게 하여 장치 위에 배치함으로써 장치를 밀봉합니다. 상단 플레이트 런에 접지 커넥터를 연결합니다. 피드백 제어를 보정하기 위해 LabVIEW로 제작된 초기화 프로그램을 실행하면, 이제 장치를 사용하여 실험을 수행할 수 있습니다.본 프로토콜에서는 디지털 미세유체 설계 및 사용법을 시연하기 위해 단백질 샘플로 bovine serum albumin(BSA)을 사용합니다. BSA는 100 millimolar tris HCL pH 7.8에 0.08%onic F1 27 weight per volume이 포함된 작동 버퍼(working buffer, WB)로 희석합니다. 각 샘플과 시약 용액을 1 milliliter씩 준비하고, 이를 첨가할 리저버를 표시하십시오.시약 준비가 완료되면 장치에서 상단 플레이트를 제거하고, 지정된 리저버에 용액 4 µL를 피펫으로 분주합니다. 리저버를 모두 채운 후, 상단 플레이트를 장치에 다시 장착합니다. 자체 제작한 LabVIEW 프로그램을 사용하여 다음 단계를 수행하십시오.컴퓨터 인터페이스를 통해 사용자는 리저버에서 약 600 nanoliter 크기의 액적을 분주하고 전극 어레이 위에서 액적을 조작할 수 있음을 기억하십시오. 먼저, R1에서 단백질 함유 시료 액적을 분주하고 R2에서 침전제 액적을 분주합니다. 두 액적을 병합하고, 병합된 액적을 5분 동안 배양하여 단백질이 표면에 침전되도록 합니다.상층액을 침전된 단백질로부터 분리하여 폐액 저장조로 이동시킵니다. 침전된 단백질을 세척하기 위해, R 4에서 세척 버퍼 세 방울을 분주하여 침전된 단백질을 지나 폐액 저장조로 흘려보냅니다. 침전물이 건조되도록 둔 다음, R 5에서 재용해 버퍼 한 방울을 단백질 위에 분주합니다.침전물이 용해될 때까지 버퍼를 20분 동안 배양합니다. 다음으로, R6에서 환원제 한 방울을 분주하여 샘플 방울과 병합합니다. 병합된 방울을 6개의 전극 위에서 원형 패턴으로 작동시켜 혼합합니다.액적을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. R seven에서 알킬화제를 한 방울 분주하여 샘플 액적과 병합한 후 혼합합니다. 빛이 차단된 실온 상태에서 액적을 15분 동안 배양합니다.마지막으로, R 8에서 trypsin 한 방울을 분주하여 샘플 방울과 합친 후 혼합합니다. 핫플레이트 위의 페트리 접시에서 37 °C로 3시간 동안 방울을 배양합니다. 반응을 종료하려면 상단 플레이트를 제거하고 피펫팅을 통해 소화를 중단시킵니다.반응 액적 위에 2.5% trichloroacetic acid 수용액 0.6 mL를 분주합니다. 바닥 플레이트에서 샘플 액적을 직접 흡입하여 켄칭된 반응 생성물을 정제합니다. 제조사의 지침에 따라 C 18 zip tip을 사용하여, 이제 샘플을 필요에 따라 희석하고 질량 분석법으로 평가하여 이 시스템을 통해 샘플 내의 단백질을 식별할 수 있습니다.이어서 질량 분석을 통해 1 × 10⁻³ 미만의 확률 점수(99.9% 신뢰 구간에 해당)와 최소 30%의 서열 커버리지를 가진 단백질들을 식별하였습니다. 따라서 DMF는 자동화된 단백질체 시료 전처리를 위한 매우 유용한 방법론입니다. 오늘 저희는 단백질을 자동 방식으로 추출하고 처리하기 위해 디지털 미세유체 기술을 어떻게 활용하는지 보여드렸습니다. 이 방법론은 단백질 분리 및 식별 과정 중의 시료 손실과 오염 문제를 해결할 수 있는 잠재적인 대안을 제공합니다.저희는 향후 이 방법을 면역 분석 및 세포 기반 분석을 포함한 다른 생물학적 응용 분야에 적용하고자 합니다. 이러한 유형의 실험을 수행할 때 가장 중요한 것은 즐거운 마음으로 임하는 것임을 기억하십시오. 이것으로 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 단백질 배열의 표현을위한 마이크로 유체 접근 방식을 제시한다. 이 장치는 마이크로 기계 밸브에 의해 제어 반응 챔버의 수천으로 구성되어 있습니다. 마이크로 유체 장치는 microarray 인쇄 유전자 도서관에 결합되어 있습니다. 이러한 유전자 그런 다음 베꼈 및 실험 사용할 준비가 단백질 배열의 결과로, 칩에 번역되어 있습니다.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.

마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

우리는 단순화된 (아날로그) 판독으로 핵산을 정량화하기 위한 종말점 디지털 분석을 설명합니다. 당사는 특수 기기가 아닌 표준 qPCR 기계를 사용하여 액적 기반 디지털 분석의 벌크 형광을 측정하고 현미경 검사로 결과를 확인합니다.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

이 프로토콜은 미세유체 소자를 사용하여 자동화된 소량(0.15–1.5ml) 입자 분리를 수행하기 위한 시스템 아키텍처를 설명하고 음향 유체 소자 성능 및 작동을 최적화하는 방법에 대해 설명합니다.

미세 유체 정밀 작은 볼륨 샘플 처리를위한 플랫폼 및 음향 마이크로 디바이스로 구분 생물 입자 크기의 사용

전기 분무 이온화(ESI) 질량 분석기와 결합된 사내 내장 플로우 스루 트립틱 마이크로리액터를 사용한 단백질 분해 분해를 위한 빠른 프로토콜이 제시됩니다. 마이크로 리액터의 제작, 실험 설정 및 데이터 수집 프로세스에 대해 설명합니다.

플로우를 통해 마이크로 반응기와 MS 검출을위한 단백질의 빠른 효소 처리

이 프로토콜은 30분 이내에 10μL의 전혈에서 단백질의 펨토 어금니 감지 감도를 달성하는 방법을 보여줍니다. 이는 랩온-어-디스크(lab-on-a-disc)에 통합된 전기방사 나노섬유질 매트를 사용하여 달성할 수 있으며, 이는 높은 표면적과 향상된 신호 대 잡음비를 위한 효과적인 혼합 및 세척을 제공합니다.

전혈에서 고감도 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치

우리는 다수의 미세 채널에서 입자의 검출 및 사이징 다중화, 코드 분할 다중 접속 (CDMA)과 저항 펄스 센서 (RPS)를 결합하는 집적 표면 전극 네트워크와 미세 유체 플랫폼을 보여준다.

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

여기서, 우리는 질량 분광법 기반 정량적 단백질 분석을 위한 자동화된 혈장 단백질 소화 방법을 제시한다. 이 프로토콜에서는 단백질 변성, 감소, 알킬화 및 트립신 소화 반응을 위한 액체 전달 및 배양 단계가 간소화되고 자동화됩니다. 원하는 정밀도로 96웰 플레이트를 준비하는 데는 약 5시간이 걸립니다.

자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비

전기 습윤 기반 디지털 미세 유체는 마이크로 리터 볼륨 액적의 명백한 접촉 각도에서 전압 구동 변화를 활용하여 조작을 용이하게하는 기술입니다. 이를 기능화된 자기 비드와 결합하면 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 병원균의 시료 준비 및 식별을 위한 여러 실험실 단위 작업의 통합이 가능합니다.

자동화된 효소 연계 면역흡착제 분석기용 전기습식 기반 디지털 미세유체 분석 플랫폼

상세한 프로토콜과 3개의 Python 스크립트는 광원 로봇 액체 처리 시스템을 운영하여 세제 제거, 단백질 소화 및 펩타이드 탈염 단계를 포함하는 대량 분광 실험에 대한 반자동 단백질 샘플 준비를 수행하기 위해 제공됩니다.

오픈 소스 실험실 로봇에 의해 자동화 된 산탄총 프로테오믹스 샘플 처리

배우세요 디지털 마이크로플루이딕스를 활용한 임상 프로테오믹스 자동화 방법입니다. 단백질 추출, 알킬화, 효소 소화 등 여러 단계를 통합하여 실온에서 병렬 분석이 가능합니다.

자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

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