자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

임상 프로테오믹스는 질병의 조기 진단 및 예후에 유용한 바이오마커 발견을 가능하게 하는 중요한 새로운 학문 분야입니다. 본 논문에서는 단백질 추출, 재용해, 환원, 알킬화 및 효소 소화를 포함하여 임상 프로테오믹스에 사용되는 여러 처리 단계가 통합된 새로운 디지털 미세유체 또는 DMF 방법을 보고합니다. DMF는 전극 어레이 상에서 시료 단백질의 개별 미세 액적을 사용하며 상온에서 구동할 수 있어, 시료의 병렬 자동 분석이 가능합니다.

이 방법론은 기존 방식보다 크게 진보한 것이며, 임상 프로테오믹스 분야에서 유용한 새로운 도구가 될 가능성이 있습니다. 안녕하세요, 저는 토론토 대학교 화학과 및 생체재료 및 의생명공학 연구소의 Erin Wheeler 교수님 연구실 소속 Steve Sche입니다. 안녕하세요, 저는 토론토 대학교 Wheeler 연구실의 Gabriel입니다.

저는 토론토 대학교 Wearer 연구실의 Vivian Luke입니다. 저는 Erin Wheeler이며, Steve Mace 그리고 Vivian과 함께 연구하게 되어 기쁩니다.

오늘은 디지털 미세유체 기술을 이용한 단백질체 처리 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 단백질 및 생물학적 시료를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

피라냐 용액(Piranha solution)으로 유리 기판을 세척하여 흄 후드 내에서 실험 절차를 시작합니다. 적절한 보호 장구를 착용한 상태에서, 피라냐 용액은 농축 황산과 30% 과산화수소를 3:1 비율로 혼합하여 조제하므로 취급 시 각별한 주의가 필요합니다.

유리 기판을 피라냐 용액에 10분 동안 침지하고, 세척 후 탈이온수로 헹군 다음 질소 가스로 건조합니다. 크롬을 250 nanometers 두께로 증착하기 위해 기판을 전자빔 증착 챔버 내에 배치합니다. 해당 두께에 도달하면 기판을 챔버에서 꺼내 이소프로판올로 헹군 후, 핫플레이트에서 115 degrees Celsius로 5분 동안 건조합니다.

건조된 기판을 hexa methyl xylazine 또는 HMDS로 30초 동안 스핀 코팅하여 프라이밍합니다. 동일한 파라미터를 사용하여 Shipley S 1811 포토레지스트로 3000 RPM에서 다시 스핀 코팅합니다.

기판을 핫플레이트 위에서 100 °C로 수 분 동안 사전 베이크합니다. 그런 다음 포토마스크를 통해 5초 동안 자외선(UV) 조사하여 포토레지스트의 패턴을 형성합니다. 다음으로, 기판이 충분히 잠길 정도의 Shipley MF 3 21 현상액에서 UV 노광된 기판을 3분 동안 현상합니다.

기판을 DI water로 헹굽니다. 핫플레이트 위에서 100 °C로 1분 동안 직접 베이킹합니다. 기판이 완전히 잠길 정도의 크롬 식각액에 30초 동안 침전시켜 노출된 크롬을 식각합니다.

기판을 DI water로 헹구고, 기판이 충분히 잠길 정도의 Z 300 T 스트리퍼에 10분 동안 담급니다. 이는 잔류 포토레지스트를 제거하기 위함입니다. DI water로 헹군 후 질소 가스로 건조합니다.

이 증착 과정 이후, 화학 기상 증착법을 통해 기판 위에 2~5 µm 두께의 절연 폴리머인 Paraline C를 증착합니다. 그 다음, 플루오리네이트된 FC 40 용액(1% w/w)을 2000 RPM에서 60초 동안 스핀 코팅하여 표면을 소수성으로 만들기 위해 50 nm 두께의 Teflon AF를 기판 위에 증착합니다.

상부 플레이트 포스트를 제작하기 위해 처리되지 않은 인듐 주석 산화물 또는 ITO 유리 기판으로 위 과정을 반복하십시오. 디지털 미세유체 장치를 구성하기 위해 두 기판을 핫플레이트에서 160 °C로 10분 동안 가열하십시오.

메스로 긁어내어 하단 기판의 접촉 패드에서 폴리머 코팅을 제거합니다. 하단 기판의 노출된 패드를 40핀 커넥터에 연결하고 LabVIEW가 실행 중인 컴퓨터의 전원을 켭니다. 당사는 dpad로 제어되는 신호 릴레이가 포함된 자체 제작 제어 박스를 사용합니다.

컴퓨터 제어 박스는 40핀 커넥터를 통해 장치에 18 kHz당 100 V RMS 신호를 인가함으로써 사용자가 이를 제어할 수 있게 합니다. 또한 함수 발생기와 증폭기의 전원을 켭니다. 하단 기판의 가장자리에 총 두께 140 µm의 양면테이프 두 조각을 부착하여 장치를 조립합니다.

저장조 중 하나에 DI water 4 µL를 피펫으로 넣고, 패턴이 없는 인듐 주석 산화물 슬라이드의 테플론 코팅된 면이 아래를 향하도록 장치 위에 배치하여 장치를 밀봉합니다. 상단 플레이스 런에 접지 커넥터를 연결합니다. 피드백 제어를 보정하기 위해 LabVIEW로 제작된 초기화 프로그램을 실행하면 장치가 실험 준비 상태가 됩니다.

본 프로토콜에서는 디지털 미세유체 설계 및 사용법을 시연하기 위해 단백질 샘플로 소 혈청 알부민(bovine serum albumin) 또는 BSA를 사용합니다. BSA는 100 millimolar tris HCL pH 7.8 및 0.08%onic F1 27 weight per volume로 구성된 작업 버퍼(working buffer) 또는 WB에 희석합니다. 각 샘플과 시약 용액을 1 milliliter씩 준비하고, 이를 추가할 저장소(reservoir)를 표시합니다.

시약 준비를 마친 후, 장치에서 상단 플레이트를 제거하고 지정된 리저버에 용액 4 µL를 피펫으로 분주합니다. 리저버를 모두 채운 후, 상단 플레이트를 장치에 다시 장착합니다. 자체 제작한 LabVIEW 프로그램을 사용하여 다음 단계를 수행하십시오.

컴퓨터 인터페이스를 통해 사용자는 리저버에서 약 600 nanoliter 크기의 액적을 분주하고 전극 어레이 위에서 액적을 조작할 수 있음을 기억하십시오. 먼저, R1에서 단백질 함유 시료 액적을 분주하고 R2에서 침전제 액적을 분주합니다. 두 액적을 병합하고, 병합된 액적을 5분 동안 배양하여 단백질이 표면으로 침전되도록 합니다.

상층액을 침전된 단백질로부터 분리하여 폐액 저장조로 이동시킵니다. 침전된 단백질을 세척하기 위해, R four에서 세척 버퍼 세 방울을 분주하여 침전된 단백질을 가로질러 폐액 저장조로 밀어냅니다. 침전물을 건조시킨 후, R five에서 재용해 버퍼 한 방울을 단백질 위에 분주합니다.

침전물이 용해될 때까지 버퍼를 20분 동안 배양하십시오. 다음으로, R six에서 환원제 한 방울을 분주하여 샘플 방울과 병합하십시오. 결합된 방울을 6개의 전극에 걸쳐 원형 패턴으로 작동시켜 혼합하십시오.

액적을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. R seven에서 알킬화제 액적을 분주하여 샘플 액적과 병합시킨 후 혼합합니다. 빛이 차단된 실온 상태에서 액적을 15분 동안 배양합니다.

마지막으로, R 8에서 트립신 한 방울을 분주하여 샘플 방울과 병합시킨 후 혼합합니다. 핫플레이트 위의 페트리 접시에서 37 °C로 3시간 동안 방울을 배양합니다. 반응을 종료하려면 상단 플레이트를 제거하고 피펫팅을 통해 소화를 중단시킵니다.

반응 액적 위에 2.5% trichloroacetic acid 수용액 0.6 mL를 분주합니다. 바닥 플레이트에서 시료 액적을 직접 사이펀으로 흡입하여 퀜칭된 반응 생성물을 정제합니다. 제조사의 지침에 따라 C 18 zip tip을 사용하여 시료를 필요에 따라 희석하고 질량 분석법으로 평가함으로써, 이 시스템을 이용해 시료 내의 단백질을 식별할 수 있습니다.

이어서 질량 분석법을 통해 1 × 10⁻³ 미만의 확률 점수(99.9% 신뢰 구간에 해당)와 최소 30%의 서열 커버리지를 기준으로 단백질을 식별하였습니다. 따라서 DMF는 자동화된 프로테오믹스 시료 처리법으로 매우 유용한 방법론입니다. 지금까지 저희는 단백질을 자동 방식으로 추출하고 처리하기 위해 디지털 미세유체 기술을 어떻게 활용하는지 보여드렸습니다. 이 방법론은 단백질 분리 및 식별 과정에서 발생하는 시료 손실과 오염 문제에 대한 잠재적인 해결책을 제공합니다.

우리는 향후 이 방법을 면역 분석 및 세포 기반 분석을 포함한 다른 생물학적 응용 분야에 적용하기를 희망합니다. 이러한 유형의 실험을 수행할 때 가장 중요한 것은 즐거운 마음으로 임하는 것을 기억하는 것입니다. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.