유전자 인코딩 된 형광 전압 센서의 두 가지 유형의 잠재적 이미징 막

이 절차의 전반적인 목표는 유전적으로 인코딩된 전압 표시기를 사용하여 막 전위 변화를 광학적으로 보고하는 것입니다. 이 방법은 유전적으로 인코딩된 다양한 전압 형광 프로브를 사용한 이미징의 강점과 약점을 설명합니다. 예를 들어, FRET 기반 프로브는 비율계량 이미징의 이점을 제공하지만 더 낮은 신호를 제공합니다.

이 기술의 주요 장점은 신경 활동을 실시간으로 시각화할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 신호 대 잡음 비율이 그리 크지 않고 여러 노이즈 소스와 잘못될 수 있는 여러 단계가 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 새로운 사용자는 종종 혼란스러워하고 간섭을 실제 신호로 간주합니다.

이 방법의 시각적 시연은 사용 중인 프로브의 유효성과 실제로 나타내는 내용을 확인하는 데 중요합니다. 설정을 위해 FRET 기반 GEVI의 이미징을 위해 저속 CCD 카메라와 고속 CCD 카메라 사이에 이미지 스플리터가 설치됩니다. 실험하기 전에 이색성 거울과 두 개의 방출 필터가 있는 필터 큐브를 이미지 스플리터에 삽입합니다.

단일 형광 단백질로 GEVI를 이미징할 때 이 두 번째 필터 큐브를 제거합니다. 실험을 시작하려면 내부 형광에 비해 강하고 국소적인 막 형광을 보이는 건강한 HEK293 세포를 찾고 원형 세포가 분열하거나 죽어갈 때 패치를 붙이지 마십시오. 그런 다음 테스트 펄스를 적용하여 현재 응답을 확인합니다.

그런 다음 패치 클램프 피펫을 세포 표면 바로 위로 내립니다. 그런 다음 세포막에 부드럽게 닿을 때까지 피펫을 천천히 내립니다. 멤브레인 저항은 1-2 메가 옴으로 증가해야합니다.

그 후, 피펫을 통해 음압을 부드럽게 가하여 기가옴 밀봉을 설정합니다. 기가옴 밀봉이 달성되면 파이펫 전위를 원하는 유지 전위로 설정합니다. 다음으로, 고속 CCD 카메라를 세포체에 초점을 맞춥니다.

FRET 기반 GEVI 녹음의 경우 분할 이미지의 크기를 조정하여 이미지 분배기의 노브를 사용하여 각 방출 파장에 대해 균일한 간격의 보기를 제공합니다. 그런 다음 전체 세포 구성을 형성하기 위해 음압을 가하여 세포막을 파열합니다. 이제 이미징 소프트웨어를 엽니다.

그런 다음 SciMeasure 카메라 획득 메뉴를 클릭하여 CCD 수집 페이지를 엽니다. 그런 다음 녹음을 저장할 새 데이터 파일을 만듭니다. 아날로그 출력을 클릭한 다음 ASCII를 읽고 이미징을 수행하기 위해 펄스 프로토콜 파일을 엽니다.

그런 다음 내부 반복 횟수의 평균을 클릭하여 시행 횟수의 평균을 구합니다. 그런 다음 아날로그 출력 페이지를 닫습니다. CCD 획득 페이지에서 특정 획득 매개변수를 설정합니다.

그 후, 수집을 위한 프레임 수와 시행 횟수에 대한 특정 값을 입력합니다. 그런 다음 데이터 광학 장치와 BNC 가져 오기 버튼을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 전압 이미징이 진행되는 동안 오실로스코프를 모니터링하여 레코딩 전반에 걸쳐 안정적인 전체 셀 구성을 보장합니다.

분수 형광 변화를 계산하려면 파일을 클릭한 다음 데이터 파일 읽기를 클릭하여 이전 단계에서 기록된 데이터 파일을 엽니다. 휴지광 강도의 세포 이미지는 오른쪽에서 볼 수 있어야 합니다. 그런 다음 show BNC's를 클릭하여 현재 종료 전압 값을 표시합니다.

프레임 빼기 기능을 활용하여 응답성이 뛰어난 광 신호가 있는 픽셀을 식별하기 위해 페이지 모드를 RLI 프레임에서 프레임 빼기로 변경합니다. 다음으로, 뺄셈을 위한 두 개의 시점을 선택하고 막 전위 변화에 대한 반응으로 신호를 보여주는 세포 영역을 식별합니다. 그런 다음 각 픽셀을 드래그하거나 클릭하여 분석해야 하는 픽셀을 지정합니다.

선택한 픽셀의 평균 형광 강도를 그래픽으로 표현한 것이 소프트웨어 창의 왼쪽에 나타나야 합니다. 분수 형광 변화 값을 얻기 위해 RLI의 버튼으로 나누기를 클릭하여 빼낸 픽셀을 휴면 광 강도로 나눕니다. 데이터를 내보내려면 show BNC의 메뉴를 클릭 해제하여 현재 종료 전압 그래프를 제거합니다.

출력으로 이동하여 표시된 ASCII로 트레이스를 저장하여 곡선 피팅 해석을 위해 형광 트레이스를 ASCII 파일 형식으로 내보냅니다. 이 절차에서는 데이터 분석 프로그램에서 전압에 대한 반응으로 분수 형광 변화를 플로팅하여 형광 변화 대 전압 그래프를 그립니다. 그런 다음 곡선을 Boltzmann 함수에 맞추어 분석, 피팅, 시그모이드 맞춤을 클릭하여 광 신호의 전압 범위를 결정한 다음 대화 상자를 엽니다.

데이터 분석 프로그램을 사용하여 전압에 대한 응답으로 정규화된 분수 형광 변화를 다시 플로팅합니다. 광학 응답의 속도를 계산하려면 ASCII 파일을 열고 시간 대비 분수 형광 변화 추적을 플로팅합니다. 그런 다음 데이터 분석 소프트웨어에서 데이터 선택기를 클릭하고 스테핑 전압 펄스의 시작에 해당하는 하나의 시점과 광 신호가 정상 상태에 도달한 두 번째 시점을 선택합니다.

analysis, fitting, exponential fit을 클릭하여 이 범위를 single 및 double exponential decay function 모두에 맞춘 다음 대화 상자를 열고 더 나은 fit을 보고합니다. 이 그림은 단일 FP 기반 GEVI 봉우리를 발현하는 HEK cell의 형광 변화를 보여줍니다. 이것은 stepped 전압 pulses에 대한 반응으로 나타나는 일반적인 형광 변화입니다.

여기에서 HEK293 셀은 고속 CCD 카메라로 이미지화되었습니다. 이 이미지는 봉우리를 발현하는 세포의 휴지광 강도를 보여줍니다. 그리고 이것은 형광 변화가 관찰된 픽셀을 나타내는 프레임 빼기 이미지입니다.

여기에 표시된 것은 봉우리를 발현하는 쥐 해마 1차 뉴런에서 유도된 활동 전위의 광학 기록입니다. 활동 전위는 전체 셀 전류 클램프 모드에서 유발되었습니다. 분획 형광 변화 추적은 소마(soma)와 상관관계가 있는 픽셀에서 선택되었습니다.

이 그림에서 FRET 기반 GEVI를 발현하는 HEK 셀의 형광 변화는 두 파장에서 계단식 전압 펄스에 대한 반응을 보여줍니다. 고속 CCD 카메라로 1킬로헤르츠로 녹음합니다. 이 절차를 시도하는 동안 형광의 과발현은 세포의 건강에 영향을 미칠 수 있으므로 다양한 형광 수준을 테스트하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 다양한 회로의 뉴런 활동과 관련된 추가 질문에 답하기 위해 슬라이서 코딩과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다양한 유형의 프로브를 사용하여 멤브레인 전위를 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.