유전자 인코딩 된 형광 전압 센서의 두 가지 유형의 잠재적 이미징 막

이 실험 절차의 전반적인 목표는 유전적으로 부호화된 전압 지시계를 사용하여 막 전위 변화를 광학적으로 보고하는 것입니다. 본 방법에서는 서로 다른 유전적으로 부호화된 전압 형광 프로브를 이용한 이미징의 장점과 단점을 설명합니다. 예를 들어, FRET 기반 프로브는 비율 측정 이미징(ratiometric imaging)이라는 장점을 제공하지만, 신호 강도는 더 낮게 나타납니다.

이 기술의 주요 장점은 신경 활동을 실시간으로 시각화할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 신호 대 잡음비가 매우 크지 않고, 여러 잡음원과 오류가 발생할 수 있는 단계가 많기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 초보 사용자는 종종 혼란을 느끼며 간섭 신호를 실제 신호로 오인하기도 합니다.

사용되는 프로브의 유효성과 그것이 실제로 무엇을 나타내는지를 확인하기 위해서는 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 설정을 위해, FRET 기반 GEVI의 이미징을 위해 저속 및 고속 CCD 카메라 사이에 이미지 분할기를 설치합니다. 실험 전에 다이크로익 미러와 두 개의 방출 필터가 포함된 필터 큐브를 이미지 분할기에 삽입하십시오.

단일 형광 단백질을 사용하는 GEVI를 이미징할 때는 이 두 번째 필터 큐브를 제거하십시오. 실험을 시작하려면, 내부 형광에 비해 강하고 국소화된 막 형광을 보이는 건강한 HEK293 세포를 찾고, 분열 중이거나 사멸 중인 원형 세포는 패칭하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 테스트 펄스를 가하여 전류 응답을 확인하십시오.

그 후, 패치 클램프 피펫을 세포 표면 바로 위까지 내립니다. 그런 다음, 피펫이 세포막에 살짝 닿을 때까지 천천히 내립니다. 이때 막 저항은 1~2 MΩ으로 증가해야 합니다.

그 후, 피펫을 통해 음압을 서서히 가하여 기가옴 밀봉(gigaohm seal)을 형성합니다. 기가옴 밀봉이 이루어지면, 피펫 전위를 원하는 유지 전위로 설정합니다. 다음으로, 고속 CCD 카메라의 초점을 세포체에 맞춥니다.

FRET 기반 GEVI 기록을 위해, 이미지 분할기의 노브를 사용하여 각 방출 파장의 뷰가 균일한 간격으로 배치되도록 분할 이미지의 크기를 조정합니다. 그 다음, 음압을 가하여 세포막을 파열시킴으로써 전세포 구성(whole cell configuration)을 형성합니다. 이제 이미징 소프트웨어를 실행합니다.

그런 다음 SciMeasure 카메라 메뉴의 acquire를 클릭하여 CCD 획득 페이지를 엽니다. 다음으로, 녹화 내용을 저장하기 위해 새 데이터 파일을 생성합니다. analog output을 클릭한 다음 read an ASCII를 클릭하여 이미징을 수행하기 위한 펄스 프로토콜 파일을 엽니다.

다음으로, trial 수를 평균화하기 위해 내부 반복 횟수의 평균(average the internal repetitions)을 클릭하십시오. 그런 다음 아날로그 출력 페이지를 닫으십시오. CCD 획득(CCD acquire) 페이지에서 특정 획득 파라미터를 설정하십시오.

그 후, 획득할 프레임 수와 트라이얼 횟수에 대한 특정 값을 입력하십시오. 그런 다음, take data optics plus BNC 버튼을 클릭하여 기록을 시작합니다. 전압 이미징이 진행되는 동안 오실로스코프를 모니터링하여 기록 전반에 걸쳐 안정적인 whole-cell 구성이 유지되는지 확인하십시오.

분수 형광 변화를 계산하려면 file을 클릭한 다음 read data file을 클릭하여 이전 단계에서 기록한 데이터 파일을 엽니다. 오른쪽에 정지 상태의 광도에서의 세포 이미지가 표시되어야 합니다. 다음으로, show BNC's를 클릭하여 현재의 종료 전압 값을 표시합니다.

반응성 광학 신호가 나타나는 픽셀을 식별하기 위해 페이지 모드를 RLI 프레임에서 프레임 차감(frame subtraction)으로 변경하십시오. 다음으로, 차감을 위한 두 개의 시점을 선택하고 막전위 변화에 반응하여 신호를 보이는 세포 영역을 식별하십시오. 그 다음, 각 픽셀을 드래그하거나 클릭하여 분석이 필요한 픽셀을 지정하십시오.

선택된 픽셀의 평균 형광 강도를 나타낸 그래프가 소프트웨어 창의 왼쪽에 표시되어야 합니다. 'divide by RLI' 버튼을 클릭하여 감산된 픽셀을 휴지기 빛 강도로 나누어 분수 형광 변화 값을 얻으십시오. 데이터를 내보내려면 'show BNC' 메뉴의 체크를 해제하여 현재의 종료 전압 그래프를 제거하십시오.

출력(output)으로 이동하여 트레이스를 표시된 ASCII(displayed ASCII)로 저장함으로써 형광 트레이스를 ASCII 파일 형식으로 내보내어 곡선 적합 분석을 수행합니다. 이 과정에서는 데이터 분석 프로그램을 사용하여 전압에 따른 상대적 형광 변화량을 플롯함으로써 전압 대비 형광 변화 그래프를 그립니다. 그 후, 분석(analysis), 적합(fitting), 시그모이드 적합(sigmoidal fit)을 클릭하고 대화 상자를 열어 곡선을 Boltzmann 함수에 적합시켜 광학 신호의 전압 범위를 결정합니다.

데이터 분석 프로그램을 사용하여 전압에 따른 정규화된 분율 형광 변화를 다시 그래프로 나타냅니다. 광학 응답 속도를 계산하려면, ASCII 파일을 열고 분율 형광 변화 트레이스를 시간에 따라 그래프로 그립니다. 그런 다음 데이터 분석 소프트웨어의 데이터 선택기를 클릭하고, 계단형 전압 펄스가 시작되는 시점에 해당하는 첫 번째 시간 지점과 광학 신호가 정상 상태에 도달한 두 번째 시간 지점을 선택합니다.

분석(analysis), 피팅(fitting), 지수 피팅(exponential fit)을 클릭한 다음 대화 상자를 열어 이 범위를 단일 및 이중 지수 감쇠 함수에 피팅하고 더 적합한 피팅 결과를 보고하십시오. 이 그림은 단일 FP 기반 GEVI Bongwoori를 발현하는 HEK 세포의 형광 변화를 보여줍니다. 이는 단계적 전압 펄스에 반응하여 나타나는 전형적인 형광 변화입니다.

여기 HEK293 세포를 고속 CCD 카메라로 촬영하였습니다. 이 이미지는 Bongwoori를 발현하는 세포의 기저 광강도를 보여줍니다. 그리고 이것은 형광 변화가 관찰된 픽셀을 나타내는 프레임 차감 이미지입니다.

Bongwoori를 발현하는 생쥐 해마 일차 뉴런에서 유도된 활동 전위의 광학 기록 영상입니다. 활동 전위는 전체 세포 전류 클램프 모드(whole-cell currents clamp mode) 하에서 유발되었습니다. 분율 형광 변화 추적선은 세포체와 상관관계가 있는 픽셀에서 선택되었습니다.

이 그림에서는 FRET 기반 GEVI를 발현하는 HEK 세포의 형광 변화가 두 가지 파장에서 단계별 전압 펄스에 반응하는 모습을 보여줍니다. 고속 CCD 카메라를 사용하여 1kHz로 기록되었습니다. 이 절차를 수행할 때, 형광의 과발현이 세포의 상태에 영향을 미칠 수 있으므로 다양한 형광 수준을 테스트하는 것이 중요함을 기억하십시오.

이 절차 이후에 슬라이서 코딩(slicer codings)과 같은 다른 방법들을 수행하여 다양한 회로의 뉴런 활성과 관련된 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 다양한 유형의 프로브를 사용하여 막전위를 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.