Name: 유전자 인코딩 된 형광 전압 센서의 두 가지 유형의 잠재적 이미징 막 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 유전자 인코딩 형광 전압 센서를 이용한 막 전위 변화 실시간 이미징 방법을. HEK293 세포와 뉴런에서 신경 활동을 시각화하고 FRET 기반 프로브의 비율 측정 장점을 활용하세요.

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본 연구는 교육과학기술부 보조금 WCI 2009-003과 한국과학기술연구원 제도적 프로그램 프로젝트 2E24210의 지원을 받아 한국연구재단의 WCI(World Class Institute) 프로그램의 지원을 받았습니다. 이성무는 교육부 산하 국립연구재단(NRF)의 Global Ph.D. Fellowship 프로그램(NRF-2013H1A2A1033344)의 지원을 받았다.

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저자는 공개 아무것도 없어.

신경 조직은 여러 가지 방법으로 전압이 약간 억제 과분극가 시냅스 입력이 비교적 큰 전압 변화에 약간의 탈분극 및 활동 전위 결과 발생 원인 이용한다. GEVIs하여 막 전위의 변화를 측정 할 수 동시에 신경 회로의 여러 구성 요소를 분석 유망한 잠재력을 제공한다. 이 보고서에서 우리는 GEVIs를 사용하여 막 전위의 이미지 변화를위한 기본적인 방법을 보여줍니다. 전압 이미징 변경 주요 키 세포막에서 GEVI의 효율적인 표현이다. 세포 내 발현은 프로브의 SNR을 감소시키는 비 형광 반응을 생성한다. 형질 전환 조건의 최적화는 크게 광 측정의 일관성을 개선한다. 소설 GEVI을 테스트 할 때 실제로, 광학 활성의 차이는 북동에 전적으로 기인 있는지 확인하는 것도 알려진 프로브를 테스트하는 것이 좋습니다w 프로브 셀없는 상태. 도 6은 전압 촬상의 감도를 감소 내부 형광의 효과를 나타낸다, ΔF ...

본 연구의 주요 초점은 유전자 코드 형광 단백질을 이용하여 시험관 내에서 막 전위 변화 결상을 입증하는 것이다. 막 전위의 이미지 변화는 신경 회로의 활동을 연구의 흥미로운 가능성을 제공합니다. 형광 강도의 변화에​​ 따라서 막 전위 변화는 카메라의 각 화소는 비 침입 신경 활성의 측정을 가능하게되면 서로 게이트 전극. 40 년의 경우, 유기 전압에 민감한 염료는 1-4 잠재적 인 멤브레인의 변화를 관찰하는 데 유용되고있다. 그러나, 이들 염료는 세포 특이성이 부족하다. 또한, 일부 세포 유형은 염색하기 어렵다. 유전자 인코딩 된 전압 지표 (GEVIs)는 세포가 구체적으로 연구 형광 전압에 민감한 프로브를 표현하는 데 이러한 한계를 극복. GEVIs의 세 가지 클래스가 있습니다. GEVI의 첫 번째 클래스는 VO를 사용단일 형광 단백질 (FP) 5-9이나 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 쌍 10-12 중 하나와 전압 센싱 포스파타제 도메인에서 전 압을 감지. 센서의 두 번째 클래스는 형광 표시 직접적으로 13-15로 또는 전기 FRET (16, 17)를 통해 미생물 로돕신을 사용합니다. 세 번째 클래스는 두 개의 구성 요소, 막 고정 된 FP 및 막 결합 담금질 염료 18 ~ 20 인 두 번째 구성 요소 인 유전 적 구성 요소를 사용합니다. 두 번째와 세 번째 클래스가 시험 관내 및 슬라이스 실험 (19, 20)에 대한 유용하지만, 센서의 첫 번째 클래스는 현재 생체 내 6를 분석하는 데 유용합니다. 이 보고서에서 우리는 시험 관내에서 GEVIs의 첫 번째 클래스 (그림 1)를 사용하여 막 전위의 영상을 보여줄 것입니다. 전압 센서의 첫 번째 클래스는 생체 내 이미징로 전환 할 수있는 가장 쉬운 방법입니다. GEVIs U 이후약 센서 로돕신 클래스보다 밝게 50 배 FP 융합 전압 감지 영역이다 tilizing 그들이 아크 램프 조명을 이용하기보다는 매우 강력한 레이저를 필요로 묘화 될 수있다. 휘도 불균형의 또 다른 결과 GEVIs의 일류 쉽게 뇌의 자동 형광을 초과 할 수 있다는 것이다. 로돕신 기반 프로브는 할 수 없습니다. 센서의 세 번째 클래스는 첫 번째 클래스만큼 밝은하지만 생체 내에서 관리하기 어려운 화학 소광의 추가가 필요합니다. 그러므로 우리는 하나의 FP (Bongwoori) 8 FRET 쌍으로 구성된 프로브 (나비 2) (12)와 프로브의 인수를 시연 할 예정이다. 나비 2.242과 나비 2.244라는 이름의 녹색 형광 기증자, 클로버로 구성된 11, 빨간 형광 수용체, mRuby2 - VSFP-CR (클로버 - mRuby2 전압에 민감한 형광 단백질)의 나비 버전은 FRET이 보고서에 구축되어 <s&gt; 12입니다. 녹음 이러한 유형의 도입은 연구자에게 제공 할 정보의 유형 GEVIs의 더 나은 이해를 제공한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" /> 그림 1.이 보고서 (A)에 군데 유전자 인코딩 된 전압 표시 (GEVIs) 횡단 막 전압 감지 도메인과 형광 단백질을 갖는 GEVI 기반의 모노 FP의 두 가지 유형. (B) 횡단 막 전압 감지 도메인, FRET 공여체와 수용체로 구성 FRET 기반 GEVI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>반전 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>60X 대물 렌즈 (수치 조리개 = 1.35)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>여기 필터</td><td>Semrock</td><td>&nbsp; FF02-472/30</td> 봉우리 이색성 거울 Semrock<td>의 초 황도 pHluorin의 전압 이미징 용</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-497 / LP</td><td></td></tr><tr><td>75W 크세논 아크 램프</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource Illuminator</td><td>LED 및 레이저도 효과적인 광원</td></tr> 저<tr><td>속 CCD 카메라</td><td>Hitachi</td><td>KP-D20BU</td><td></td></tr><tr><td>듀얼 포트 카메라 어댑터</td><td>올림푸스</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>고속 CCD 카메라</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>이미지 스플리터</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>여기 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/23-25</td><td>FRET 쌍 기반 GEVI의 전압 이미징 Clover와 mRuby2)</td></tr><tr><td>이색성 미러</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터</td><td>Chroma</td><td>ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>이색성 미러</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>진동 차단 시스템</td><td>키네틱 시스템</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>패치 챔버</td><td>워너 악기</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 마이크로 커버 글라스 (22 x 40 mm)</td> <td>전자 현미경 과학</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>워너 악기</td><td>TC-344B</td><td></td></tr> <tr><td># 0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm 직경 유리 커버 슬립</td><td>Ted Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>Lipofection agent</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>인산 칼슘 시약</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB 증폭기</td><td></td></tr><tr><td>다중 채널 데이터 수집 소프트웨어</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>이미지 수집 및 분석 소프트웨어</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>스프레드시트 응용 프로그램 소프트웨어</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr><tr><td>데이터 분석 소프트웨어</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>Demagnifier</td><td>Qioptiq LINOS</td><td>Optem 표준 카메라 커플러 0.38x SC38 J 클램프</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R 컨포칼 현미경</td><td></td></tr><tr><td>퇴색 방지 시약</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 인코딩 된 형광 전압 센서의 두 가지 유형의 잠재적 이미징 막

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

유전자 인코딩 전압 표시기(GEVI)는 생체 내 기록에 유용하기 시작하는 지점까지 개선되었습니다. 궁극적인 목표는 in vivo 뉴런 활동을 이미지화하는 것이지만, 성공적인 in vivo 준비를 보장하기 위해서는 단일 세포의 활동을 이미지화할 수 있어야 합니다. 이 절차는 단일 세포에서 막 전위를 이미지화하여 최종적으로 in vivo에서 이미지화할 수 있는 기반을 제공하는 방법을 설명합니다. 여기에서는 단일 형광 단백질(FP) 또는 체외에서 Förster 공명 에너지 전달(FRET)이 가능한 두 개의 형광 단백질에 융합된 전압 감지 도메인으로 구성된 GEVI를 이미징하는 방법에 대해 설명합니다. 이미지 스플리터를 사용하면 두 개의 서로 다른 파장에서 생성된 이미지를 동일한 CCD(전하 결합 소자) 카메라에 동시에 투사할 수 있습니다. 이미지 분할기는 광 경로에 두 번째 필터 큐브를 배치합니다. 이 두 번째 필터 큐브는 GEVI의 FP에 따라 donor 및 acceptor 형광 파장을 분리하기 위해 dichroic filter와 two emission filter로 구성됩니다. 이 설정을 통해 수용체와 공여체 형광 파트너를 동시에 기록할 수 있으며, 멤브레인 전위는 전체 세포 패치 클램프 구성을 통해 조작됩니다. 단일 FP로 구성된 GEVI를 사용할 때 두 번째 필터 큐브를 제거하여 이미지 스플리터의 미러가 단일 이미지를 CCD 카메라에 투사할 수 있습니다.

일시적으로 형질 감염된 세포는 크게 형광 강도의 변화 및 ​​세포막 발현의 정도를 나타낼 수있다. 심지어 같은 coverslip에 일부 세포는 내부 형광의 다양한 수준을 제공합니다. 이는 세포에 의해 흡수 형질 제의 양 가장 쉽다. 때때로 너무 많이 발현이 세포 사멸 (27)의 결과로 펼쳐진 단백질 응답을 체험 할 수있는 세포 발생 (밝은, 높은 내부 형광, 세포를 반올림). 실험 따라서 내부 식 잡음비 (SNR)에 신호를 저하 무응답 형광을 생성 이후 가능한 한 적은 내부 형광 밝은 세포 희미 세포 모두를 테스트 할주의한다. 또 다른 고려 사항은 그림 3. 발색단의 성숙 속도 인 수용체 chromoph의 형광에서 차이를 보여줍니다공여 발색단 (클로버)보다 긴 숙성 시간이 광석 (​​mRuby2). <p...

유전적으로 암호화된 전압 지표를 사용하여 막 전위의 변화를 이미징하는 방법에 대해 설명합니다.

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 유전적으로 부호화된 전압 지시계를 사용하여 막 전위 변화를 광학적으로 보고하는 것입니다. 본 방법에서는 서로 다른 유전적으로 부호화된 전압 형광 프로브를 이용한 이미징의 장점과 단점을 설명합니다. 예를 들어, FRET 기반 프로브는 비율 측정 이미징(ratiometric imaging)이라는 장점을 제공하지만, 신호 강도는 더 낮게 나타납니다.이 기술의 주요 장점은 신경 활동을 실시간으로 시각화할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 신호 대 잡음비가 매우 크지 않고, 여러 잡음원과 오류가 발생할 수 있는 단계가 많기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 초보 사용자는 종종 혼란을 느끼며 간섭 신호를 실제 신호로 오인하기도 합니다.사용되는 프로브의 유효성과 그것이 실제로 무엇을 나타내는지를 확인하기 위해서는 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 설정을 위해, FRET 기반 GEVI의 이미징을 위해 저속 및 고속 CCD 카메라 사이에 이미지 분할기를 설치합니다. 실험 전에 다이크로익 미러와 두 개의 방출 필터가 포함된 필터 큐브를 이미지 분할기에 삽입하십시오.단일 형광 단백질을 사용하는 GEVI를 이미징할 때는 이 두 번째 필터 큐브를 제거하십시오. 실험을 시작하려면, 내부 형광에 비해 강하고 국소화된 막 형광을 보이는 건강한 HEK293 세포를 찾고, 분열 중이거나 사멸 중인 원형 세포는 패칭하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 테스트 펄스를 가하여 전류 응답을 확인하십시오.그 후, 패치 클램프 피펫을 세포 표면 바로 위까지 내립니다. 그런 다음, 피펫이 세포막에 살짝 닿을 때까지 천천히 내립니다. 이때 막 저항은 1~2 MΩ으로 증가해야 합니다.그 후, 피펫을 통해 음압을 서서히 가하여 기가옴 밀봉(gigaohm seal)을 형성합니다. 기가옴 밀봉이 이루어지면, 피펫 전위를 원하는 유지 전위로 설정합니다. 다음으로, 고속 CCD 카메라의 초점을 세포체에 맞춥니다.FRET 기반 GEVI 기록을 위해, 이미지 분할기의 노브를 사용하여 각 방출 파장의 뷰가 균일한 간격으로 배치되도록 분할 이미지의 크기를 조정합니다. 그 다음, 음압을 가하여 세포막을 파열시킴으로써 전세포 구성(whole cell configuration)을 형성합니다. 이제 이미징 소프트웨어를 실행합니다.그런 다음 SciMeasure 카메라 메뉴의 acquire를 클릭하여 CCD 획

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

외부 전기장은 세포의 막에 전압을 유도, 유도 멤브레인 전압 (ΔΦ) 칭했다. potentiometric 염색 DI - 8 - ANEPPS을 사용하여, 그것은 noninvasively ΔΦ를 측정할 수 있습니다. 이 비디오는 측정을위한 프로토콜을 보여줍니다 ΔΦ DI - 8 - ANEPPS를 사용합니다.

디 - 8 - ANEPPS으로 유도된 막 전압 측정

서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

여기에 설명된 프로토콜은 관심 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 유전자 인코딩 전압 지시기(GEVI)와 함께 생체 내 시스템에서 제브라피시 배아를 사용하여 가장 비침습적인 생리학적 조건에서 흥분성 세포의 전기적 특성을 연구할 수 있도록 합니다.

살아있는 Zebrafish 배아에서의 바이오 센스 모터 뉴런 멤브레인 잠재력

여기 우리는 특히 심 실 같은 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes에에서 광학 이미지 활동 전위, 하는 방법을 제시. 메서드를 사용 하면 전압에 민감한 형광 단백질의 발기인 기반 식을 기반으로 합니다.

하위 형식 관련 광학 활동 전위 녹음 인간의 유도 만능 줄기 세포 유래 심 실 Cardiomyocytes

여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

이 프로토콜은 막 전위의 변화를 측정하여 전기적 막 단백질을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 상피 세포주에서 내인성으로 발현되는 여러 이온 채널의 기능적 판독을 위한 플랫폼을 제공합니다.

두 개의 상피 세포주에서 두 개의 내인성 이온 채널에 대한 고처리량 기능 연구를 위한 막 전위의 형광 기반 분석

체외에서 흥분성 세포의 반응을 연구하기 위해 이 프로토콜은 유전적으로 조작된 tet-on 스파이킹 HEK 세포의 간단한 흥분성 세포 모델에 대한 전기천공으로 인한 활동 전위 생성의 변화와 관련 매개변수의 자동 추출을 통한 막관통 전압의 변화에 대한 광학 모니터링을 설명합니다.

유전자 조작 Tet-On 스파이킹 HEK 세포에서 전기천공법으로 유도된 작용 전위 생성 변화 모니터링

배우세요 유전자 인코딩 형광 전압 센서를 이용한 막 전위 변화 실시간 이미징 방법을. HEK293 세포와 뉴런에서 신경 활동을 시각화하고 FRET 기반 프로브의 비율 측정 장점을 활용하세요.

유전자 인코딩 된 형광 전압 센서의 두 가지 유형의 잠재적 이미징 막

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