Name: HIV 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 학습하세요 이광자 현미경을 사용하여 마우스 뇌 혈관 구조를 정량화하는 방법을. HIV 바이러스 독소 노출 후 피질 모세혈관 네트워크 변화를 분석하여 신경인지 장애의 병인을 이해할 수 있습니다.

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이 프로토콜을 완료하는 동안 기술적 조언을 해주신 University of Rochester Multiphoton Core의 Maria Jepson, Paivi Jordan 박사, Linda Callahan 박사에게 감사드립니다. 또한 전문가의 통계적 조언을 해주신 Changyong Feng 박사님과 이 논문에 사용된 헤드플레이트 디자인에 대해 University of Rochester Medical Center의 Maiken Nedergaard 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 미국 국립보건원(NIH)의 보조금 T32GM007356 및 R01DA026325 부분적으로 지원되었습니다. 그리고 로체스터 대학교 에이즈 연구 센터 보조금 P30AI078498(NIH)에 의해.

동물 자원에 로체스터 대학위원회의 대학은이 논문에서 수행되는 모든 절차를 승인했다. 1. 수술 전 준비 (쥐) <ol><li> 필요한 모든 장비와 수술 영역을 준비합니다. 미리 70 % 에탄올을 사용하여 절차를 수행하는 동안 사용되는 모든 도구를 살균. 선택적으로, 유리 구슬 살균기를 사용하거나 도구를 소독하기 위해 압력솥. </li><li> 이소 플루 란 기화기에 연결 이소 플루 란 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 1 L / min의 속도로 4 %에 이소 플루 란 수준을 설정합니다. 주 : 성상 세포 특이 신경교 섬유 성 단백질 (GFAP) 프로모터 (HIV 두드리는의 Tg 생쥐)에 의해 구동 독시사이클린 (DOX) 유도 성 HIV-1 타트 트랜스와 여기에보고 된 실험 쥐 10 HIV의 효과를 조사하기 위해 사용 하였다 이전에 7,10 설명 된대로 -1, 뇌 혈관 구조에 신경 염증을 유도. </li><li> 부드럽게 및 마우스를 관찰 유도 챔버 팁# 39;의 복원 정 반사. 복원력 반사가 억제되면, 2 % 이소 플루 레벨을 설정하고 수술 벤치 노즈콘을 유도 챔버로부터 공기 흐름을 재. </li><li> 빨리 물을 주입 가열 패드로 유도 챔버에서 마우스를 이동합니다. 코 콘을 통해 이소 플루 란 (1.5 %)을 계속 적용. 호흡 수 (RR) 모니터링을 통해 평가 개별 마우스 허용 오차에 따라 마취를 조정합니다. 주 : RR의 우울증은 뇌 혈류 및 혈관 직경의 평가를 변경하는 가스 생리적 파라미터를 교란 할 수있다. 분당 55-65 숨 사이 RR을 유지하기 위해 시도합니다. 심장 박동수 (HR)도 마취 깊이를 평가할 수있다; 혈관 직경에 대한 생리 학적 변화를 방지하기 위해 분당 300-450 박동 사이에 인사를 유지한다. 일반적으로 마취는 주어진 마우스 1 L / 분에서 1.5-2.0 %의 이소 플루 란 사이에 충분한 것입니다. </li><li> 또한 마취의 깊이를 확인하는 발가락 핀치를 수행합니다. 마우스는, 통신을 응답하지 않으면수술을 줬어. </li></ol> 얇은 두개골 두개골 창 2. 준비 <ol><li> 마우스의 눈에 인공 눈물 젤을 적용합니다. 완전히 가위 전기 면도기를 사용하여 마우스의 두피에서 머리카락을 제거합니다. </li><li> 포비돈 요오드 용액을 도포하여 두피 살균; 건조 할 수 있습니다. 그 후, 광학 현미경 하에서 완전히 두정골 마킹, 꼬리 정면 뼈 및 브레 그마 노출 마우스의 두피로부터 피부를 제거한다. </li><li> 쉬운 제거를위한 멤브레인을 건조시키기 위해 두개골에 10 % 염화 제이철 용액의 소량을 적용한다. 부드럽게 두개골을 긁어 # 45분의 5 집게로 건조 된 세포막을 제거합니다. </li><li> headplate 창 주위에 접착제의 얇은 층을 적용합니다. 부드럽게 윈도우의 중심에있는 관심 영역을 유지하는 마우스의 두개골에 대하여 headplate를 누른다. 접착제를 중합 headplate에 치과 용 시멘트의 드롭을 적용합니다. </li><li> 얇은 층을 적용headplate 윈도우의 가장자리를 따라 접착제의 식염수를 개최하여 저수지를 만들 수 있습니다. 접착제가 건조되면, 마우스 headplate 하네스에 headplate 나사. 참고 :이 절차에 사용되는 마우스 headplate 하네스는 금속베이스와 2 개의 금속 열이있는 구조입니다. 각 열에서 하나의 봄과 하나의 날개 너트가있다. headplate는 스프링의 위쪽에 배치되고, 헤드 레벨이며 움직이지 않을 때까지 날개 너트가 체결된다. </li><li> 6,000 rpm으로 설정 microtorque 드릴에 부착 된 드릴 비트를 사용하여 headplate 창에서 어떤 접착제를 제거합니다. 선박의 구조가 손상 될 수 있습니다 마우스 두개골의 과열을 방지하기 위해 모든 10 ~ 15 초를 중지합니다. <ol><li> 새로운 드릴 비트를 사용하여, 중간 선 (headplate 윈도우의 지름의 3 분의 1)에서 측면 microtorque 드릴 1.5 mm를 놓습니다. 4,000 rpm에서 얇은에이 위치 주변의 두개골을 시작합니다. 직접적인 하락 압력으로 두개골을 부드럽게 드릴을 이동합니다. </li><li> 중지의 DRIL링 모든 10 ~ 15 초 마우스 두개골의 과열을 방지합니다. 이 시간 동안 압축 공기 용기를 사용하여 축적 된 두개골 먼지를 제거합니다. </li><li> 5 ~ 10 초 동안 두개의 온도를 실온 식염수 방울을 사용합니다. 부드럽게 두개골의 숱을 계속 부드러운 티슈로 모든 유체를 제거합니다. </li></ol></li><li> 두개골의 최종 박형화를 들어, 저장소 내에 headplate 식염수 소량을 넣고 가볍게 작은 혈관을 명확하게 보일 때까지 관심 영역 위에 치과 microblade 스윕. </li></ol> 생리 학적 매개 변수 3. 모니터링 <ol><li> 두개골이 완전히 희석되면, 홀더에서 마우스를 분리하고 다시에 놓습니다. 부드럽게 명확하게 내측 허벅지를 노출 모두 뒷다리를 테이프. </li><li> 가위 전기 면도기와 모두 중간 허벅지 위에 머리를 제거합니다. 포비돈 - 요오드와 허벅지를 커버하여 수술 부위를 소독. </li><li> 대퇴 정맥 위의 중간 오른쪽 허벅지에 피부를 꼬집어및 동맥 # 5 집게를 사용. 부드럽게 위쪽으로 피부를 당겨 잘라 피부를 제거하기 위해 가위를 사용합니다. 참고 : 왼쪽 허벅지가 수술 합병증 (혈관 기형, 파열 된 선박)의 경우에 예약되어 있습니다. </li><li> 수술 부위에 0.9 %의 식염수를 약 3 ~ 5 방울을 적용합니다. 이것은 혈관의 큰 확대율뿐 아니라 혈관의 수분 사이트를 유지하고 건조 방지 가능하다. 퉁명스럽게 두 #에게 45분의 5 집게를 사용하여 대퇴 신경 혈관 다발로 해부에 의해 동맥에서 대퇴 정맥을 분리합니다. </li><li> 약 1cm 간격 대퇴 동맥 아래 수술 봉합의 두 3cm 조각을 놓습니다. 카테터 삽입시 과도한 혈액 손실을 방지하는 데 도움이됩니다 혈관 지혈대를 만들 수있는 상부 봉합 시계 방향으로 돌립니다. </li><li> 봄 가위를 사용하여 대퇴 동맥에 작은 절개를합니다. 카테터는 동맥 내에서 안전하게 될 때까지 절개 사전을 통해 동맥에 카테터를 놓습니다. </li><l난&gt; 누출 적절한 카테터 배치를 평가하기 위해 상부 봉합 (지혈대를) 꼬인 것이 풀리다. 봉합사를 이용하여 혈관 내 카테터 주위에 두 개의 매듭을 묶는하여 대퇴 동맥에 카테터를 고정합니다. </li><li> 혈액 응고를 방지하기 위해 카테터를 통해 헤파린 10 μL (100 IU / ㎖)을 주입한다. 그런 다음, 수술 간단한 중단 패턴에서 4-0 봉합과 함께 피부를 바느질로 오른쪽 허벅지를 닫습니다. </li><li> 복강 오른쪽 하복부에 우레탄을 50 μL (1.2 밀리그램 / g)을 주입한다. 5 분 후 복강 우레탄 100 ㎕의 총 왼쪽 하단 사분면에 다른 50 μL 주입으로 반복합니다. 병용 마취의 깊이을 위해 마우스를 다시 검사하는 동안 천천히 약 0.25 %로 이소 플루 란 수준을 줄일 수 있습니다. 참고 :이 장을 관통하지 않도록 후방 복부 벽을 따라 복강 내 표면 바늘을 유지합니다. 이것은 복부 직근 (μ)를 협지함으로써 달성 될 수있다멀리 내장에서 다음 주입 scles. </li><li> 모세관을 사용하여 카테터의 동맥 혈액 40 μL 샘플을 수집한다. 염수로 채워진 네 방향 스톱 콕과 헤파린 채워진 주사기 장착 혈압 변환기에 카테터를 연결. </li><li> 카테터의 의도하지 않은 제거를 방지하기 위해 수술 장치 혈압 변환기를 테이프. 평균 동맥압의 모니터링을 시작합니다. </li><li> 혈액 가스 분석기 입력 포트에 혈액 채워진 모세관 튜브를 삽입합니다. 모든 혈액이 추출되면, 진입 포트로부터 모세관을 제거한다. O 2, CO 2 혈액 가스 농도는 혈액 가스 분석 장치에서 인쇄 용지에 나타날 것이다. </li></ol> 형광 염료 4. 주입 <ol><li> # 5 집게를 사용하여 중간 왼쪽 허벅지에 피부를 꼬집어. 부드럽게 위쪽으로 피부를 당겨 잘라 피부를 제거하기 위해 가위를 사용합니다. 덱스 트란 복합 빨간색 발광 로다 민 염료를 준비(70 kDa의) (생리 식염수에 녹인 10 ㎎ / ㎏). </li><li> 대퇴가 부착 된 30 G 바늘 1 ML의 주사기를 vein.Using 찾아 주사기의 130 μL 라인에 영상에 적합한 형광 염료의 이전에 제조 된 솔루션을 그립니다. 주사기에 완전히 염료를 그리기 단단히 주사기 벽을 쓸어 넘겨 모든 기포를 제거합니다. <ol><li> 벤드 딱딱한 표면 베벨면이 위로에 대해 그것을 누르면 약 30도 각도로 30 G 바늘. 염료와 바늘을 작성하고 100 μL 샘플을 떠나, 초과 액체를 폐기합니다. </li></ol></li><li> 천천히 대퇴 정맥 내로 염료의 100 μL 샘플을 주입한다. 바늘을 제거한 후, 어떤 출혈을 멈추게하는 주사 부위에 안정적으로 부드럽게 압력을 적용합니다. 염료가 5 분 동안 순환하도록 허용합니다. 주 : 대안 적으로, 오른쪽 대퇴부 정맥 다른 수술 부위의 생성을 통해 상기 혈액 손실을 방지하기 위해, 형광 염료의 주입 대신에 사용될 수있다. 또한, 만약동물은 수술 부위에서 미친 듯이 출혈이 너무 많은 헤파린이 카테터를 세척하기 위해 주어진 것을 표시 할 수있다. 이 10-15 분 내에 응고가없는 마우스가 여전히 출혈의 경우, 새로운 마우스로 실험을 재시작 고려한다. </li><li> 조심스럽게 그 위에 마우스를 뒤집어 4-0 봉합과 함께 피부를 바느질하여 왼쪽 허벅지를 닫고 마우스 headplate 하네스에 배치합니다. </li></ol> 생체 내 두 광자 이미징 5. <ol><li> 연속 마취 수준을 유지 확인한 이광자 현미경 수술기구를 이동. headplate 저장조에 0.9 % 식염수의 소량을 배치하고 식염수에 접촉되도록 현미경 대물 저하. 브라이트 감상 목표를 사용하여 관심 영역을 찾습니다 </li><li> 형광 염료에 적합한 파장에 두 광자 레이저 여기를 설정합니다. 25X O를 사용하여 두 개의 광자 영상화를 시작bjective. 이 실험에서 우리는 780 nm의 파장에서 흥분했다 적색 발광 로다 민 염료에 접합 된 덱스 트란을 사용합니다. 발광 36분의 607 대역 통과 필터는 염료로부터의 형광을 검출하고, 발광 대역 통과 필터를 20분의 480 동맥자가 형광을 검출하기 위해 사용 된 </li><li> 보기 화면 베드 모세관을 찾은 두 광자 이미징 소프트웨어를 사용하여 모세관 광학 줌 2. 획득 된 이미지를 사용하여이 영역을 확대. </li><li> 이미지가 완료되면, 참수 하였다 경추 탈구하여 마우스를 희생. </li></ol> 6. 예 생체 내 두 광자 이미징 <ol><li> 극세 가위를 사용하여, 마우스의 정면 뼈 interparietal 뼈 두피 절개를. 포인터 손가락과 엄지 손가락으로 두개골의 측면에 피부를 보호합니다. </li><li> 중간 interparietal 뼈 아래에있는 여분의 미세 가위를 놓고 시상 봉합 따라 두개골을 잘라. 브레 그마 마킹 후 약 3 mm의 두개골을 절단 중지합니다. 참고 : 뇌를 절단 방지하기 위해 두개골을 절단 할 때 상승 압력을 적용합니다. </li><li> # 5 포셉 사용하여 뇌에서 두개골을 분리하고 조심스럽게 뇌의 표면에서 모든 수막을 제거합니다. 남은 수막 실수로 뇌를 가르기 수 있습니다 극도의주의는 이러한 문제를 방지하기 위해주의해야한다. 뇌가 두개골에서 분리 될 때까지 조심스럽게 천천히 앞으로 전진 뇌에서 # 5 집게를 밀어 넣습니다. 주 : 하향 압력이 뇌 천공 피하기 위하여 사용되어야한다는 것을. </li><li> 생쥐의 특정 뇌 절편 도구에서 뇌를 놓습니다. 뇌를 통해 인공 뇌척수액의 방울을 적용하여 뇌를 씻으십시오. </li><li> 브레 그마에 브레 그마 0에서 뇌의 2mm 코로나 부분을 제거 -2. 위쪽으로 향하게 0 브레 그마 인공 뇌척수액을 포함하는 오목 유리 슬라이드에 관상 섹션 (섹션의 가장 두개골 부분)을 놓습니다. 조심스럽게 뇌 SL을 커버유리 커버 슬립 얼음. 참고 :이 혈관 구조를 변형 수 있으므로 한 번 뇌 섹션에 배치 된 유리를 눌러 피하십시오. </li><li> 현미경 스테이지를 이동시켜 슬라이드 및 커버 슬립에 0.9 % 식염수의 소량을 배치. 이 식염수와 접촉 할 때까지 현미경 목표를 낮 춥니 다. 시야 목표를 사용하여 뇌의 중간 선을 찾습니다. </li><li> 이광자 촬상을 시작하고 다시 25X 대물를 사용 정중선을 찾아. 관상 부분의 피질 표면에서의 종 방향 균열에 대해보고이 작업을 수행. 중간 선에 영상 화면의 오른쪽 가장자리를 놓고 옆으로 세 개의 완전한 프레임 (중간 선에서 약 1.5 mm)를 뷰어 화면을 통해 이동합니다. 이 실험에서, 촬상 파라미터 단계 5.2 주에 언급 된 것과 동일 하였다 참고. </li><li> 모세 혈관이보기 화면에서 거의 볼 수있는 깊이를 찾습니다. 초점 추가 (20)의 평면을 낮 춥니 다μm의 Z는 스택의 탑을 결정한다. </li><li> 1 μm의 이미지 두께를 설정합니다. 100 ㎛에 대한보기 화면을 내리고 화소의 1 % 미만이되도록 과포화 걸쳐 레이저 파워를 조정한다. 참고 : Z - 스택 이미지가 100 연속 500x500x1 μm의 일련의 이미지에서 컴파일됩니다. 보다 정확한 후 처리 계산 될 것이다 Z 스택 크다. 일반적으로 100 ㎛ 이상의 Z - 스택을 수집하기 위해 시도합니다. </li><li> 인접 XY 아이콘 다음 XY 반복 아이콘을 누릅니다. Z-스택이 완료되면, 완료 아이콘 시리즈를 눌러 파일을 저장한다. </li></ol> 7. 데이터 처리 <ol><li> ImageJ에 소프트웨어에서 생체 모세관 이미지를 엽니 다. 수동 이광자 소프트웨어로부터 얻어지는 값에 기초하여 거리 비율에 픽셀을 설정한다. <ol><li> 도구 메뉴에서 * 바로 * 아이콘을 선택합니다. OPPO 한 모세관 벽으로부터 연장되는 선을 그립니다사이트 모세관 벽과 ImageJ에 의해 제공되는 길이를 기록한다. 명확 모세관 벽의 모서리를 시각화하기 위해 이미지를 확대 할 필요가있을 수 있으므로주의. </li><li> 모세관을 따라 다른 위치에서 단계를 반복 7.1.1뿐만 아니라에 대한 이미지에 여러 개의 모세 혈관. </li></ol></li><li> 이러한 아미라으로 분석 소프트웨어에 Z-스택 파일을 엽니 다. 하위 응용 프로그램 도구 모음에서 필라멘트 편집기 아이콘을 선택 <ol><li> 상단 또는 Z-스택의 하단을 약 20 이동할 수있는 뷰어를 시청 두께를 설정합니다. </li><li> 추적 아이콘을 선택하고로드 된 이미지 위로 커서를 이동합니다. 도 2c에 설명 된 위치에서 모세 혈관에 배치 노드; 세그먼트는 자동으로 인접한 노드 사이에 나타납니다. 전체 Z - 스택을 통해 모세 혈관을 추적합니다. 주 : THR 모세관을 추적하기 위해 엔드 포인트와 분기점 사이의 노드를 배치 할 필요가있다Z-스택 oughout. </li><li> 이러한 노드를 제거하려면, 중급 제거 아이콘을 클릭합니다. 참고 :이 제거 선택한 아이콘을 선택하고 선택 단일 아이콘을 사용하여 루프를 선택하고 수동으로 제거해야합니다 잘못된 루프 세그먼트를 만들 수 있습니다. 루프를 추적하는 동안, 같은 지역에 계속 표시하면, 노드가 다른 모세 혈관에 배치했다 가능성이 높습니다. </li><li> 추적이 완료되면, 자동적으로 추출 된 파라미터를 포함한 혈관 스프레드 시트를 열 그래프 정보 아이콘을 선택한다. 노드와 세그먼트의 수는 기본보기 화면에서 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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여기에 기재된 방법은 실험 모델 / 설정 광범위한 뇌 미세 혈관 구조를 분석에 적용 할 수있다. 이 방법의 성공을 위해, 세 가지 중요한 단계를 마스터해야합니다. 첫째, 얇은 두개골 창은 두개골 또는 기본 뇌에 손상을주지해야합니다. 그것은 숱이 중 두개골에 구멍을 내거나, 또는 열 유도 혈관 누설의 원인이 쉽다. 형광 염료의 초점이 비행기로 누출과 모세 혈관을 모호하므로이 영상을 방해 할 수 있습니다. 두개골 자주 얇은 두개골 준비하는 동안 휴식 경우, 가장 가능성이 너무 큰 하향 압력에 의해 발생합니다. 버에 최대한 가깝게 microtorque 드릴을 잡고 두개골에 하향 압력을 감소 더 촉각 제어 할 수 있습니다. 둘째, 동맥 카테터 최대한 빨리 동맥이 절단 된 후 발생한다. 빨리 카테터를 삽입하지 않으면 COMP 것이다 과도한 혈액 손실이 발생할 수 있습니다마우스의 생리 무결성 romise. 카테터를 삽입하는 어려움으로 인해 대퇴 동맥 카테터에 비해 상대적으로 큰 크기로 ...

인간 면역 결핍 바이러스 1 (HIV-1) 바이러스 감염의 급성 단계에서 뇌를 침범하고, 생산적으로 자신의 활성화로 이어지는, 미세 아교 세포 및 뇌 상주 식세포 모두 감염 - 두 호스트 유래 염증 매개과 가용성 HIV-1 출시 이러한 문신과 (1,2 검토) gp120의 같은 virotoxins. 그 결과, 만성 신경 염증성 상태는 HIV-1 관련 신경인지 장애 (HAND) 3-5의 발병에 기여하는 것으로 생각된다 CNS에서 설립된다. HIV-1 문신 또는 마우스의 중추 신경계 내에서 인터루킨 (IL) -17A의 만성 과발현은 미세 혈관 진공 6,7 발생하는 것으로 나타났다. 이것은 만성 신경 염증은 뇌 혈관계에 영향을 HAND의 병인에 기여할 수있는 가능성을 제기한다. 또한이 문제를 조사하기 위해, 우리는 뇌 혈관의 struc을 정량화하는 방법을 개발했다투 레스. 이 논문은, 세그먼트 길이, 총 세그먼트 길이를 의미 모세관 직경 및 얇은 스컬 피질 창을 통해 모세관 네트워크의 생체 내 이미징에 사용한 총 모세관 체적 평균 모세관 노드 모세관 세그먼트 수를 정량하는 방법을 설명한다 (전술로부터 개질 프로토콜) -8,9-뿐만 아니라 이광자 현미경을 사용하여 뇌 부분의 생체 촬상. 생체 얇은 스컬 피질 창이 대뇌 환경의 보존을 가능하게 때문에 뇌 조각 모세관 네트워크의 생체 촬상의 재구성을 가능하게하면서,이 결합 방법은, 뇌 혈관 파라미터 론적 정량 제공 입체 완료 모세관 네트워크 - 후 상용 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>라이카 현미경</td><td>Leica Inc.</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>고강도 조명기</td><td>Dolan-Jenner</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>히팅 패드</td><td>스트라이커&nbsp;</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>T/펌프</td><td>Gaymar 산업, Inc.</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>TEC-4 이소플루란 기화기</td><td>Datex Ohmeda</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>인공 눈물 젤</td><td>버틀러 AHS</td><td>7312</td><td></td></tr><tr><td>포비돈-요오드 용액&nbsp;</td><td>Aplicare</td><td>52380-1855-9</td><td></td></tr><tr><td>엑스트라 파인 본 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumot #5 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>염화철 용액</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-16</td><td></td></tr><tr><td>록타이트 454 프리즘 인스턴트 접착 젤</td><td>Henkel</td><td>45404</td><td></td></tr><tr><td>치과 시멘트</td><td>스톨팅</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Microtoruqe II 핸드피스 키트</td><td>Pearson Dental</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>005 Burr for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Norland Blade (Dental Microblade)</td><td>Salvin Dental</td><td>6900</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td>그룹 2B 발암 물질</td></tr><tr><td>꼰 봉합</td><td>사 Ethicon</td><td>735G</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 동맥 카테터</td><td>SAI 주입 기술</td><td>MAC-01</td><td>카테터의 끝부분은 직경을 줄이기 위해 수동으로 늘렸습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>혈압 모니터</td><td>세계 정밀 계측기</td><td>SYS-BP1</td><td></td></tr><tr><td>혈압 변환기 및 케이블</td><td>세계 정밀 계측기</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>RAPIDLab 혈액 가스 분석기&nbsp;</td><td>지멘스&nbsp;</td><td>248</td><td></td></tr><tr><td>40 &뮤; l 모세관</td><td>VWR</td><td>15401-413</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg 식염수에 용해)</td><td>Invitrogen</td><td>D-1830</td><td></td></tr><tr><td>성인 마우스 뇌 슬라이서 매트릭스</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM 다광자 현미경</td><td>Olypmus</td><td>FV-1000 MPE</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee Ti:Sa 레이저</td><td>스펙트럼 물리학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td> http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html <td></td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>Visage Imaging에서 사용 가능&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hiv 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) 감염은 종종 HIV-1 관련 신경인지 장애(HAND)를 유발하며, 중추신경계(CNS) 내의 만성 신경염증 상태를 특징으로 하며, 주로 미세아교세포와 뇌 상주 대식세포의 바이러스 매개 활성화에 의해 주도되는 것으로 생각됩니다. HIV-1 감염은 또한 뇌혈관 혈류(CBF)의 변화를 동반하며, HIV 관련 만성 신경염증이 CBF 및/또는 대뇌 혈관 구조의 변화를 유발할 수 있는 가능성을 높입니다. 이 질문에 답하기 위해 HIV 유발 신경염증에 대한 마우스 모델을 사용했으며, 이러한 염증성 환경에 장기간 노출되면 뇌 혈관 구조가 손상되어 모세혈관 네트워크가 희박해질 수 있는지 여부를 테스트했습니다. 이 논문에서는 신경염증성 질환(HIV-1 Tat 형질전환 마우스)의 마우스 모델에서 피질 모세혈관 밀도의 변화를 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 일반화 가능한 접근 방식은 얇은 두개골 피질 창을 통한 피질 모세혈관의 생체 내 이광자 이미징과 마우스 뇌 절편의 피질 모세혈관에 대한 생체 외 이광자 이미징을 사용합니다. 이러한 절차는 각각 모세혈관 네트워크의 이미지와 z-stack 파일을 생성한 다음 대뇌 혈관 구조의 변화를 평가하기 위해 정량적 분석을 수행할 수 있습니다.

얇은 두개골 대뇌 피질의 창은 대뇌 피질의 모세 혈관의 생체 내 두 광자 이미징 (그림 1)을 허용한다. 이미지에 적합한 지역은 수많은, 별개의 모세 혈관 (그림 1A)를 보여줍니다. 한 시야에서 더 동맥 세포벽 형광도 존재하지 않으며, 11 번째 고조파 발생량 (도 1b)에 의해 유도 된 이러한 콜라겐과 같은 다른 형광 형광 신호가있을 수있다. 뇌 슬라이스의 준비가 완료되면, 약 1.5mm의 정중선이 위치하고 이미징 영역 (도 2a). 100 ㎛ Z-스택 아미라 분석 소프트웨어 (도 2B)에서 분석에 사용되는 입체 화상을 생성한다. 모세관 네트워크는 수동으로 시작 및 모세관...

이 논문은 in vivo 및 ex vivo 이광자 현미경을 사용하여 뇌의 혈관 구조를 정량화할 수 있는 방법을 설명합니다.

HIV 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

본 절차의 전반적인 목표는 HIV 바이러스 독소인 tat에 장기간 노출된 후의 피질 모세혈관 네트워크 변화를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 HIV 관련 신경인지 장애의 병인에 기여할 수 있는 피질 모세혈관 형태의 주요 변화를 조사하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 모세혈관 형태학적 파라미터를 생리학적으로 정확하게 정량화할 수 있다는 점입니다.이 방법은 HIV 관련 신경인지 장애의 발병 기전에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 알츠하이머병과 같이 혈관 변화가 일어나는 다른 질환에도 적용될 수 있습니다. 마취된 마우스의 눈에 인공눈물 겔을 도포하여 이 절차를 시작하십시오.다음으로, 전기 면도기를 사용하여 머리 부분을 삭모합니다. 그 다음, 포비돈 요오드 용액을 도포하여 두피를 소독하고 건조시킵니다. 광학 현미경 하에서 동물의 두피를 제거하여 두정골, 전두골의 후단 및 브레그마 지점이 완전히 노출되도록 합니다.제거하기 쉽도록 막을 건조시키기 위해 10% 염화철 용액을 소량 두개골에 도포합니다. 그 후, 포셉으로 두개골을 부드럽게 긁어내어 건조된 막을 제거합니다. 그런 다음, 헤드 플레이트 윈도우 주변에 접착제를 얇게 바릅니다.관심 영역이 윈도우 중앙에 위치하도록 헤드 플레이트를 마우스의 두개골에 부드럽게 누릅니다. 그 후, 헤드 플레이트에 치과용 시멘트를 한 방울 떨어뜨려 접착제를 중합시킵니다. 다음으로, 헤드 플레이트 윈도우 가장자리를 따라 접착제를 얇게 도포하여 식염수를 유지할 수 있는 저장소를 만듭니다.접착제가 마르면 헤드 플레이트를 마우스 헤드 플레이트 하네스에 나사로 고정합니다. 6,000 rpm으로 설정한 마이크로-토프(micro-torp) 드릴에 드릴 비트를 장착하여 헤드 플레이트 윈도우에 묻은 접착제를 제거합니다. 마우스 두개골의 과열을 방지하기 위해 10~15초마다 한 번씩 작업을 멈춥니다.그 후, 새로운 드릴 비트를 사용하여 4,000 rpm으로 설정된 micro-torp 드릴로 두개골을 얇게 깎기 시작합니다. 아래 방향으로 직접적인 압력을 가하지 말고 드릴을 두개골 전체에 걸쳐 부드럽게 움직입니다. 두개골이 완전히 얇아지면, 마우스를 홀더에서 분리하여 등으로 눕힙니다.양측 뒷다리를 부드럽게 테이프로 고정하여 내측 허벅지가 명확하게 드러나도록 합니다. 그런 다음 양측 내측 허벅지의 털을 제거하고, 허벅지를 포비돈 요오드로 덮어 수술 부위를 소독합니다. 이어서 대퇴정맥과 대퇴동맥 상부의 오른쪽 내측 허벅지 피부를 부드럽게 제거합니다.수술 부위에 0.9% saline을 약 3~5방울 떨어뜨립니다. 그 다음, 대퇴 신경혈관 다발을 둔성 박리하여 대퇴정맥을 동맥으로부터 분리합니다. 이제 약 1cm 간격으로 대퇴동맥 아래에 3cm 길이의 외과용 봉합사 두 조각을 배치합니다.상단 봉합사를 시계 방향으로 꼬아 혈관 지혈대를 만들어 카테터 삽입 중 과도한 출혈이 발생하는 것을 방지합니다. 이어서 스프링 가위를 사용하여 대퇴동맥에 작은 절개를 내며, 이곳을 통해 나중에 카테터를 삽입하여 마우스의 생리학적 파라미터를 모니터링합니다. 이 과정에서 마우스 왼쪽 허벅지 내측의 피부를 제거합니다.다음으로 대퇴정맥의 위치를 찾습니다. 1 mL 주사기와 30 gauge 바늘을 사용하여 형광 염료 용액 130 µL를 흡입합니다. 대퇴정맥에 염료 100 µL를 천천히 주입합니다.바늘을 제거한 후, 주사 부위에 일정하고 가벼운 압력을 가해 출혈을 멈추게 하고 염료가 순환될 때까지 5분 동안 기다립니다. 그 후, 봉합사로 수술 부위를 폐쇄합니다. 마우스를 조심스럽게 복와위로 뒤집어 마우스 헤드 플레이트 하네스에 고정합니다.in vivo 이광자 이미징을 위해, 수술 장치를 이광자 현미경으로 옮기고 동물의 마취 수준이 유지되고 있는지 확인하십시오. 다음으로, 헤드 플레이트 리저버에 소량의 0.9% saline을 넣고 현미경 대물렌즈를 내려 saline과 접촉하도록 합니다. 그런 다음, 명시야 관찰 대물렌즈를 사용하여 관심 영역을 찾으십시오.그 후, 이광자 이미징을 시작합니다. 뷰 스크린에서 모세혈관망을 찾아 광학 줌을 사용하여 해당 영역을 확대합니다. 이광자 이미징 소프트웨어를 사용하여 모세혈관 이미지를 획득합니다.ex vivo 이광자 이미징을 위해, 안락사시킨 마우스의 두개골 내 간골부터 전두골까지 두피를 절개합니다. 검지와 엄지로 피부를 두개골 측면으로 고정한 다음, 초미세 가위를 내측 간골 아래에 배치하고 브레그마(bregma) 지점에서 약 3mm 후까지 시상 봉합선을 따라 두개골을 절단합니다. 그런 다음 두개골을 뇌에서 분리하고, 핀셋을 사용하여 뇌 표면의 뇌수막을 조심스럽게 제거합니다.포셉을 뇌 아래로 조심스럽게 밀어 넣어 두개골에서 분리합니다. 그 후, 마우스 전용 뇌 매트릭스에 뇌를 고정하고 ACSF 방울로 세척합니다. 다음으로, 1mm 두께의 관상면 뇌 절편을 제거합니다.ACSF가 담긴 오목 유리 슬라이드 위에 뇌 절편의 가장 앞부분이 위를 향하도록 놓습니다. 그런 다음 유리 커버슬립으로 뇌 절편을 조심스럽게 덮습니다. 슬라이드를 현미경 스테이지로 옮기고 커버슬립 위에 0.9% saline을 소량 떨어뜨립니다.현미경 대물렌즈를 식염수와 접촉할 때까지 내립니다. 그 다음, 명시야 대물렌즈를 사용하여 뇌의 정중선을 찾습니다. 이제 이광자 이미징을 시작하고, 25x 대물렌즈를 사용하여 정중선을 다시 찾습니다.관상면 절단의 피질 표면에서 정중열을 찾아 이를 수행하십시오. 그런 다음, 이미징 화면의 오른쪽 가장자리를 중앙선에 맞추고 뷰어 화면을 외측으로 세 프레임 완전히 이동시키십시오. 뷰어 화면에서 모세혈관이 겨우 보일 정도의 깊이를 찾으십시오.그 후, 초점 평면을 20 µm 더 낮추어 z-stack의 상단을 결정합니다. 이미지 두께를 1 µm로 설정하십시오. 뷰 스크린을 100 µm 낮추고, 픽셀의 1% 미만이 과포화되도록 레이저 출력을 전체적으로 조정합니다.마지막으로, z-스택을 획득합니다. 이 그림에서는 뇌 절편이 준비된 후, 정중선에서 약 1.5 millimeters 떨어진 곳에 이미징 영역이 위치해 있습니다. 100 micrometer z-스택을 통해 생성된 3차원 이미지는 Amira 분석 소프트웨어에서 분석에 사용됩니다.그런 다음 모세혈관의 시작점과 끝점, 또는 하나의 모세혈관이 다른 혈관으로 분지되는 모든 지점에 노드를 배치하여 모세혈관 네트워크를 수동으로 추적합니다. 이를 통해 완전한 골격화(skeletonized) 이미지가 생성되며, 여기에서 형태학적 파라미터가 자동으로 추출됩니다. 생쥐 뇌 절편의 이광자 ex vivo 이미징을 사용하여 모세혈관 노드 수, 세그먼트 수, 평균 세그먼트 길이 및 총 세그먼트 길이를 추출할 수 있습니다.본 과정에서는 생체 내(in vivo) 이미징을 통해 모세혈관 네트워크의 2차원 이미지를 생성하며, 이를 통해 모세혈관 직경을 추출할 수 있습니다. 또한, 생체 외(ex vivo) 이미징에서 얻은 모세혈관 직경과 총 세그먼트 길이를 사용하여 총 모세혈관 부피를 계산할 수 있습니다. 숙련된 상태에서 적절히 수행한다면 이 절차는 3시간 30분 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안에는 빠르게 움직이면서 일정한 수준의 마취 상태를 유지하는 것이 중요한데, 이는 isoflurane이 피질 모세혈관의 혈관 확장을 유발하여 데이터를 왜곡시킬 수 있기 때문입니다.이 절차를 통해 적혈구 속도나 적혈구 플럭스와 같은 다른 모세혈관 파라미터를 얻을 수 있으며, 이는 HIV 관련 신경인지 장애 및 기타 신경퇴행성 질환에서 나타나는 병리적 변화에 대한 더 깊은 이해를 제공할 수 있습니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 반복 murine microglia를 시각화하고 monocytes 순환하는 방법을...

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

여기에 직접 마우스 피질의 microregional 조직 hypoxia을 시각화하는 방법을...

내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

Source: Nishimura, C.  외. HIV-induced Neuroinflammation의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 대뇌 혈관 건축의 정량화. J. Vis. 특급. (2016). 이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 마우스 뇌의 피질 모세혈관의 생체 내 시각화를 보여줍니다. 얇은 두개골 피질 창이 있는 마취된 마우스에 형광 염료를 주입하고, 이미징을 위한 설정을 준비하고, 분석을 위해 뇌 미세혈관 구조의 상세한 이미지를 획득하는 단계를 간략하게 설명합니다.

 마우스 뇌 미세혈관 구조의 생체 내 이미징을 위한 이광자 현미경 

출처: Arango-Lievano, M. et. al., 대뇌혈관 구조의 종단 생체 내 이미징: 중추신경계 질환과의 관련성. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 형광 표지된 아밀로이드 플라크와 대뇌 혈관 구조를 시각화하기 위한 생체 내 이광자 이미징을 보여줍니다. 파란색 형광은 플라크를 표시하고 녹색 형광은 뇌 혈관을 강조합니다. 관심 영역의 3D 지도와 고해상도 모자이크 이미징은 아밀로이드 플라크와 대뇌 혈관의 상세한 상호 작용을 보여줍니다.

알츠하이머병 마우스 모델에서 대뇌혈관 및 아밀로이드 플라크의 생체 내 이미징

이 프로토콜은 마우스의 일시적인 중대뇌동맥 폐색 후 경색 부피와 혈액-뇌 장벽 파괴를 감소시키는 반복적인 저산소증 전조건화 또는 전신 저산소증에 대한 짧은 노출을 설명합니다. 또한 신경혈관 보호의 효능을 평가하기 위해 뇌졸중 후 경색 용적과 혈액-뇌 장벽 파괴의 이중 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

마우스의 반복 저산소 전처리 및 과도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 신경 혈관 보호의 정량화

이 원고는 세로 두 광자 현미경을 사용하여 생체 내에서 아밀로이드 플라크 축적 동안 cerebrovasculature의 리모델링을 추적하는 절차를 설명합니다. 얇아진 두개골 제제는 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서 뇌 손상의 진행을 평가하기 위해, 형광 염료의 시각화를 가능하게한다.

종<em&gt; 생체</em&gt;은 Cerebrovasculature의 이미징 : CNS 질환에 관련성

여기 선물이 고해상도 이미징 및 마우스의 3 차원 재구성에 대 한 현미경 기반 프로토콜 neurovascular 단위와 혈액-뇌 장벽 뇌 부동성 섹션을 사용 하 여. 이 메서드는 시각화, 분석 및 BBB에서 세포내 세포의 정량화에 대 한 수 있습니다.

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

이 기사의 목적은 마이크로 계산 된 단층 촬영 및 전체 선박 세그먼트에 대뇌 vasospasm을 계량 하는 데 사용할 수 있는 볼륨의 결정 후 마우스에서 뇌혈관 나무의 3 차원 재구성을 허용 하는 방법을 제시 하는 것입니다. 거미 막 밑 출혈의 murine 모델입니다.

거미 막 밑 출혈의 Murine 모델에 대뇌 Vasospasm의 정량화에 대 한 체적 메서드

이 논문은 정밀하게 제어된 수술과 이광자 현미경을 사용하여 마우스 해마 CA1에서 휴식 미세아교세포를 만성적으로 생체 내에서 관찰하는 방법을 설명합니다.

생체 내 마우스 해마에서 미세아교세포의 만성 이광자 이미징

학습하세요 이광자 현미경을 사용하여 마우스 뇌 혈관 구조를 정량화하는 방법을. HIV 바이러스 독소 노출 후 피질 모세혈관 네트워크 변화를 분석하여 신경인지 장애의 병인을 이해할 수 있습니다.

HIV 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량

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