HIV 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량

본 절차의 전반적인 목표는 HIV 바이러스 독소인 tat에 장기간 노출된 후의 피질 모세혈관 네트워크 변화를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 HIV 관련 신경인지 장애의 병인에 기여할 수 있는 피질 모세혈관 형태의 주요 변화를 조사하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 모세혈관 형태학적 파라미터를 생리학적으로 정확하게 정량화할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 HIV 관련 신경인지 장애의 발병 기전에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 알츠하이머병과 같이 혈관 변화가 일어나는 다른 질환에도 적용될 수 있습니다. 마취된 마우스의 눈에 인공눈물 겔을 도포하여 이 절차를 시작하십시오.

다음으로, 전기 면도기를 사용하여 머리 부분을 삭모합니다. 그 다음, 포비돈 요오드 용액을 도포하여 두피를 소독하고 건조시킵니다. 광학 현미경 하에서 동물의 두피를 제거하여 두정골, 전두골의 후단 및 브레그마 지점이 완전히 노출되도록 합니다.

제거하기 쉽도록 막을 건조시키기 위해 10% 염화철 용액을 소량 두개골에 도포합니다. 그 후, 포셉으로 두개골을 부드럽게 긁어내어 건조된 막을 제거합니다. 그런 다음, 헤드 플레이트 윈도우 주변에 접착제를 얇게 바릅니다.

관심 영역이 윈도우 중앙에 위치하도록 헤드 플레이트를 마우스의 두개골에 부드럽게 누릅니다. 그 후, 헤드 플레이트에 치과용 시멘트를 한 방울 떨어뜨려 접착제를 중합시킵니다. 다음으로, 헤드 플레이트 윈도우 가장자리를 따라 접착제를 얇게 도포하여 식염수를 유지할 수 있는 저장소를 만듭니다.

접착제가 마르면 헤드 플레이트를 마우스 헤드 플레이트 하네스에 나사로 고정합니다. 6,000 rpm으로 설정한 마이크로-토프(micro-torp) 드릴에 드릴 비트를 장착하여 헤드 플레이트 윈도우에 묻은 접착제를 제거합니다. 마우스 두개골의 과열을 방지하기 위해 10~15초마다 한 번씩 작업을 멈춥니다.

그 후, 새로운 드릴 비트를 사용하여 4,000 rpm으로 설정된 micro-torp 드릴로 두개골을 얇게 깎기 시작합니다. 아래 방향으로 직접적인 압력을 가하지 말고 드릴을 두개골 전체에 걸쳐 부드럽게 움직입니다. 두개골이 완전히 얇아지면, 마우스를 홀더에서 분리하여 등으로 눕힙니다.

양측 뒷다리를 부드럽게 테이프로 고정하여 내측 허벅지가 명확하게 드러나도록 합니다. 그런 다음 양측 내측 허벅지의 털을 제거하고, 허벅지를 포비돈 요오드로 덮어 수술 부위를 소독합니다. 이어서 대퇴정맥과 대퇴동맥 상부의 오른쪽 내측 허벅지 피부를 부드럽게 제거합니다.

수술 부위에 0.9% saline을 약 3~5방울 떨어뜨립니다. 그 다음, 대퇴 신경혈관 다발을 둔성 박리하여 대퇴정맥을 동맥으로부터 분리합니다. 이제 약 1cm 간격으로 대퇴동맥 아래에 3cm 길이의 외과용 봉합사 두 조각을 배치합니다.

상단 봉합사를 시계 방향으로 꼬아 혈관 지혈대를 만들어 카테터 삽입 중 과도한 출혈이 발생하는 것을 방지합니다. 이어서 스프링 가위를 사용하여 대퇴동맥에 작은 절개를 내며, 이곳을 통해 나중에 카테터를 삽입하여 마우스의 생리학적 파라미터를 모니터링합니다. 이 과정에서 마우스 왼쪽 허벅지 내측의 피부를 제거합니다.

다음으로 대퇴정맥의 위치를 찾습니다. 1 mL 주사기와 30 gauge 바늘을 사용하여 형광 염료 용액 130 µL를 흡입합니다. 대퇴정맥에 염료 100 µL를 천천히 주입합니다.

바늘을 제거한 후, 주사 부위에 일정하고 가벼운 압력을 가해 출혈을 멈추게 하고 염료가 순환될 때까지 5분 동안 기다립니다. 그 후, 봉합사로 수술 부위를 폐쇄합니다. 마우스를 조심스럽게 복와위로 뒤집어 마우스 헤드 플레이트 하네스에 고정합니다.

in vivo 이광자 이미징을 위해, 수술 장치를 이광자 현미경으로 옮기고 동물의 마취 수준이 유지되고 있는지 확인하십시오. 다음으로, 헤드 플레이트 리저버에 소량의 0.9% saline을 넣고 현미경 대물렌즈를 내려 saline과 접촉하도록 합니다. 그런 다음, 명시야 관찰 대물렌즈를 사용하여 관심 영역을 찾으십시오.

그 후, 이광자 이미징을 시작합니다. 뷰 스크린에서 모세혈관망을 찾아 광학 줌을 사용하여 해당 영역을 확대합니다. 이광자 이미징 소프트웨어를 사용하여 모세혈관 이미지를 획득합니다.

ex vivo 이광자 이미징을 위해, 안락사시킨 마우스의 두개골 내 간골부터 전두골까지 두피를 절개합니다. 검지와 엄지로 피부를 두개골 측면으로 고정한 다음, 초미세 가위를 내측 간골 아래에 배치하고 브레그마(bregma) 지점에서 약 3mm 후까지 시상 봉합선을 따라 두개골을 절단합니다. 그런 다음 두개골을 뇌에서 분리하고, 핀셋을 사용하여 뇌 표면의 뇌수막을 조심스럽게 제거합니다.

포셉을 뇌 아래로 조심스럽게 밀어 넣어 두개골에서 분리합니다. 그 후, 마우스 전용 뇌 매트릭스에 뇌를 고정하고 ACSF 방울로 세척합니다. 다음으로, 1mm 두께의 관상면 뇌 절편을 제거합니다.

ACSF가 담긴 오목 유리 슬라이드 위에 뇌 절편의 가장 앞부분이 위를 향하도록 놓습니다. 그런 다음 유리 커버슬립으로 뇌 절편을 조심스럽게 덮습니다. 슬라이드를 현미경 스테이지로 옮기고 커버슬립 위에 0.9% saline을 소량 떨어뜨립니다.

현미경 대물렌즈를 식염수와 접촉할 때까지 내립니다. 그 다음, 명시야 대물렌즈를 사용하여 뇌의 정중선을 찾습니다. 이제 이광자 이미징을 시작하고, 25x 대물렌즈를 사용하여 정중선을 다시 찾습니다.

관상면 절단의 피질 표면에서 정중열을 찾아 이를 수행하십시오. 그런 다음, 이미징 화면의 오른쪽 가장자리를 중앙선에 맞추고 뷰어 화면을 외측으로 세 프레임 완전히 이동시키십시오. 뷰어 화면에서 모세혈관이 겨우 보일 정도의 깊이를 찾으십시오.

그 후, 초점 평면을 20 µm 더 낮추어 z-stack의 상단을 결정합니다. 이미지 두께를 1 µm로 설정하십시오. 뷰 스크린을 100 µm 낮추고, 픽셀의 1% 미만이 과포화되도록 레이저 출력을 전체적으로 조정합니다.

마지막으로, z-스택을 획득합니다. 이 그림에서는 뇌 절편이 준비된 후, 정중선에서 약 1.5 millimeters 떨어진 곳에 이미징 영역이 위치해 있습니다. 100 micrometer z-스택을 통해 생성된 3차원 이미지는 Amira 분석 소프트웨어에서 분석에 사용됩니다.

그런 다음 모세혈관의 시작점과 끝점, 또는 하나의 모세혈관이 다른 혈관으로 분지되는 모든 지점에 노드를 배치하여 모세혈관 네트워크를 수동으로 추적합니다. 이를 통해 완전한 골격화(skeletonized) 이미지가 생성되며, 여기에서 형태학적 파라미터가 자동으로 추출됩니다. 생쥐 뇌 절편의 이광자 ex vivo 이미징을 사용하여 모세혈관 노드 수, 세그먼트 수, 평균 세그먼트 길이 및 총 세그먼트 길이를 추출할 수 있습니다.

본 과정에서는 생체 내(in vivo) 이미징을 통해 모세혈관 네트워크의 2차원 이미지를 생성하며, 이를 통해 모세혈관 직경을 추출할 수 있습니다. 또한, 생체 외(ex vivo) 이미징에서 얻은 모세혈관 직경과 총 세그먼트 길이를 사용하여 총 모세혈관 부피를 계산할 수 있습니다. 숙련된 상태에서 적절히 수행한다면 이 절차는 3시간 30분 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안에는 빠르게 움직이면서 일정한 수준의 마취 상태를 유지하는 것이 중요한데, 이는 isoflurane이 피질 모세혈관의 혈관 확장을 유발하여 데이터를 왜곡시킬 수 있기 때문입니다.

이 절차를 통해 적혈구 속도나 적혈구 플럭스와 같은 다른 모세혈관 파라미터를 얻을 수 있으며, 이는 HIV 관련 신경인지 장애 및 기타 신경퇴행성 질환에서 나타나는 병리적 변화에 대한 더 깊은 이해를 제공할 수 있습니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.