Name: 건강 및 부상 Zebrafish의 두뇌의 대규모 스캐닝 투과 전자 현미경 (Nanotomy) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 학습하세요 제브라피시 뇌의 대규모 투과 전자 현미경법(Nanotomy)을 통해 신경퇴행성 질환에서 거대분자에서 조직 수준까지의 변화를 정의하는 방법을. 이 기술은 뇌 구조와 기능 연구에 강력한 도구를 제공합니다.

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작품의 대부분은 NWO 175-010-2009-023 및 ZonMW 91111006 후원하는 UMCG 현미경 및 이미징 센터 (UMIC)에서 수행되었다; BNGG에 STW &quot;현미경 밸리 12718&quot;. 이 작품은하는 마리 퀴리 경력 통합 보조금 (신경 세포 죽어 저장)를 ZonMW VENI 부여 및 TJvH에 알츠하이머 네덜란드의 교제에 의해 후원

제브라 피쉬 애벌레 모든 실험은 국가 및 EU 지침에 따라 흐로 닝언 대학의 동물 실험위원회에 의해 승인되었다. 1. 샘플 준비 <ol><li> 고정 및 포함 <ol><li> 정착 <ol><li> tricaine (0.003 %) 물고기 애벌레를 마취 부드럽게 파고에 의해 E3 (5 mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 CaCl2를, 0.33 mM의 황산, 10 mM의 HEPES, pH를 7.6) 마취의 깊이 제브라 피쉬의 물과 테스트에 추가 해부 현미경 하에서 200 μL 피펫 팁의 움직임이 더 이상 (도 1a)을 검출되지 않을 때까지. </li><li> 기술 된 바와 같이 아가 1.8 %에 촛점 2 광자 영상화를 이용하여 생체 내 이미징 데이터를 획득 한 후 상호 EM 용 샘플을 처리하는 경우, 아가로 오스 5,15 수정 유충 트리톤 X-100 (0.05 %)을 함유하는 PBS로 4 % PFA를 사용. </li><li> 아가로 오스와 프로세스에서 유충을 잘라대규모 EM 5. </li><li> 플라스틱 튜브를 실온에서 2 시간 동안 트리톤 X-100 (0.05 %)를 함유하는 PBS에 신선한 4 % 파라 포름 알데히드에서 유충을 수정. 주 : 배양에서 배양 세포를 다음 단계 (1.1.1.5)에서 설명한 바와 같이 (시험 관내)가 직접, 글루 타르 알데히드로 고정 될 수있다. </li><li> 솔루션을 제거하고 100 μl를 0.5 % PFA, 2 % 글루 타르 알데히드 (GA), 0.1 M 나트륨 cacodylate (산도 7.4)를 추가합니다. 4 ℃에서 하룻밤 저장합니다. 린스 샘플을 두 번 0.1 M 나트륨 cacodylate있다. </li><li> 오스뮴의 침투를 용이하게하기 위해 후뇌에 rostrally 애벌레 머리를 잘라. 미세 주사기 / 집게를 사용합니다. </li><li> 1 % 산화 오스뮴의 후위 유충 (OSO 4) 2 시간 동안 페로 시안화 칼륨 (K 4의 Fe (CN) 6]) 얼음에 0.1 M 나트륨 cacodylate의를 /1.5% 두 번 증류수 H 2 O 3 × 5 분을 씻어 </li><li> 에탄올 농도가 증가하는 20 분간 인큐베이션 (50 %, 70 %, 3 회, 100 %), 에탄올로 탈수. </li></ol></li><li>퍼가기 <ol><li> EM 실험실에서 사용되는 표준 조리법에 따라 에폭시 수지를 준비합니다. 주 : 우리는 다음과 같은 에폭시 수지를 사용 믹스 19.8 g glycid 에테르 (100), 자석 교반기를 사용하여 9.6 g 2- 도데 세닐 산 무수물 11.4 g, 무수 메틸 나. 0.5 g DMP-30 (트리스 (디메틸 아미노 메틸) 페놀)를 추가하고 다시 섞는다. </li><li> 에탄올 중의 50 % 에폭시 수지 유충 밤새 인큐베이션 (V / V) (RT)으로 회전시키면서. </li><li> 순수한 수지와 희석 된 에폭시 수지를 교체합니다. 30 분 동안 인큐베이션 다시 신선한 수지를 추가로 30 분 동안 배양한다. 다시 수지를 새로 고침 한 후 58 ° C에서 15 분 및 저압 (200 밀리바)에서 RT 또 다른 1 시간 뒤에 실온에서 3 시간을 품어. </li><li> 바늘을 사용하여 해부 현미경으로 시판되는 실리콘 평탄한 매립 몰드의 헤드의 방향이나 금형의 필요에 따라 측면에 대향하는 전방으로 이쑤시개 (그림 1B). </li><li> 에폭시 입술을 중합58 ° C에서 하룻밤한다. 에폭시 수지 인 경우에는 여전히 너무 부드러운 하루가 중합하고 58 ℃에서 경화 할 수있다. 집게를 사용하여 압력을가함으로써 테스트 강성. 이것은 쉽게 들여 쓰기가 다른 날은 중합 및 58 ° C에서 경화 할 수 있도록 나뭇잎합니다. 시료가 완전히 경화 될 때 트리밍 및 단면 처리를 진행합니다. </li><li> 스텁 사용하여 면도날 (그림 1B)에서 초과 수지를 얻어 낸다. </li></ol></li></ol></li><li> , 단면 대조 및 설치 <ol><li> 단면 <ol><li> 을 Ultramicrotome를 사용하여 섹션 에폭시 수지 블록. </li><li> 유리 칼 또는 톨루이딘 블루 / 기본 푹신에 대한 semithin 섹션 (500 나노 미터)를 절단하는 다이아몬드 histoknife를 사용하여 (그림 1D) 오른쪽 위치를 감지하는 염색. </li><li> 선단 화염에 녹아에 의해 폐쇄 된 유리 파스퇴르 피펫으로 그들을 데리러하여 현미경 슬라이드에 전송 세미 얇은 부분. 핫 플레이트 U에 드라이ntil 물이 남아 있지 않습니다. 핫 플레이트에 물에 1 % 톨루이딘 블루 10 초 동안 1 %의 붕산 나트륨 0.05 % 기본 푹신으로 10 초 동안 물 얼룩 세척 한 후 얼룩. 40 배 10 배에서 일반 광학 현미경으로 검사합니다. </li><li> 뇌 내의 적절한 위치 / 방향에 도달하면, 얇은 부분을 절단하는 다이아몬드 칼 에폭시 수지 블록을 계속 절편 (~ 70 내지도 1E) </li><li> 절편 초박형 동안 관심의 영역을 확인하고 샘플을 기울 때 단면 각도를 조정, 후각 피트, 눈, 회색 - 흰색 물질의 경계를 포함, 및 뇌 주위에 쉽게 식별 해부학 적 구조를 사용합니다. </li><li> 단일 슬롯 L2 × 1 구리 그리드 (그림 1 층)에 마운트 부분은 그리드 막대에 의해 방해받지 인수를 허용합니다. 섹션을 지원하기 위해 Formvar에게 코팅 그리드를 사용합니다. </li></ol></li><li> 대조 <ol><li> 그리드에 얼룩 얇은 섹션레이놀즈 다음 메탄올 2 % 우라 닐 아세테이트 2 분의 또 다른 2 분 16 구연산을지도한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 이미지 인식 <ol><li> 대규모 STEM 참고 : 우리는 STEM 감지를 사용하여 높은 해상도 3,5,7,17에서보기의 여러 큰 분야를 획득 할 수있는 외부 스캔 발생기 스캔 EM을 사용합니다. 통상적으로, 하나의 이미지는 이러한 방식으로 크게 접의 양을 감소 ~ 100 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지 뷰 필드에 해당 생성. <ol><li> 현미경에서 샘플을 장착 <ol><li> 여러 그리드 샘플 홀더에 섹션 그리드를 놓고 SEM의 챔버로 전송합니다. </li></ol></li><li> 줄기 감지기의 정렬 <ol><li> 빔 아래 샘플 그리드를 넣고이 약 수 있도록 그것을 이동합니다. 렌즈 극에서 5mm. 사용하여 20 kV로에서 화상을 취득인 - 렌즈 검출기. </li><li> 그리드 가장자리에 초점 및 4.0 mm 거리에 작업을 조정합니다. </li><li> 안전한 위치로 샘플 홀더를 이동하고 STEM 검출기에 가져. </li><li> 인 - 렌즈 검출기를 최대 속도로 조정 나사 동안 영상을 돌려 이미지 필드에서 STEM 검출기의 구멍을 중앙에. </li><li> 조심스럽게 바로 렌즈 극과 검출기 사이에 맞는 샘플 홀더를 다시 가져. </li><li> 섹션 영역에있을해야하는 인 - 렌즈 검출기로 이미지를 획득. </li><li> 스위치 검출 (이득 매체와 &#39;마이너스&#39;에 설정된 모든 사분면)를 줄기와 이미지를 획득하고 스캔 할 영역을 선택합니다. </li><li> 21 kV의에 가속 전압을 올리고 (다시 안정된 이미지) 빔의 안정화 기다린 후 2 kV의 단계에서 29 kV로 이동합니다. </li></ol></li><li> 이미지 획득 <ol><li> 샘플을 미리 조사하여 줌 (전자 빔에 의한 휘도 변화를 방지하기 위해)스캔의 전체 영역 밖이므로 이미지 창을 맞는다. </li><li> 120 μm의 개구 수를 변경 (검출기 이득이 한 단계 감소 할 수있는 적절한 동적 범위를 유지하기 위해). </li><li> 데 초점 이미지가 흐려되도록. </li><li> 감소 된 지역 검색 옵션을 사용하여 가능한 한 꽉 스캔 영역을 확인합니다. </li><li> 프레임이 약으로 주사되도록 설정 스캔 속도. 1-2 초. 참고 : 크기와 조직에 따라이 일반적으로 소요 ½ 시간 (100 × 100 μm의의 FOV)를 3 시간 (1000 X 500 μm의) 최대로. </li><li> 적어도 100 배에 확대하고 10 초 동안 작은 영역을 스캔합니다. 참고 :이 지역은 그 주변, 사전 조사가 충분에 비해 밝기를 변경하지 않는 경우. </li><li> 30 μm의 구멍을 다시 가져 오기 (중간에 이득을 STEM) </li><li> 샘플을 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 비틀 비틀 (~ 40,000의 배율)를 사용하여 조리개를 맞 춥니 다. </li><li> 초점 가장 밝은 영역 / 기능을 선택하는 동안, 스캔 속도를 설정 같은 세부 사항이볼 수 있습니다. </li><li> 현미경 소프트웨어에서 조심스럽게 동적 범위 내의 모든 픽셀을 유지하기 위해 히스토그램을 보면서 밝기와 대비를 조정합니다. 가장 어두운 영역 / 기능에 대해 동일한 작업을 수행합니다. </li><li> 다시 밝은 영역으로 이동하고 다시 확인합니다. 히스토그램의 양쪽에 약간의 공간이 있으므로 안전면에 올려. </li><li> 스캔의 전체 영역이 촬상 창 맞도록 축소하고, 대 면적의 수집 프로그램을 시작한다. </li><li> 화면에서 영역을 선택하여 모자이크를 설정 마법사 옵션을 사용합니다. 사용 픽셀 크기는 2 - 세부 사항이 필요한 내용에 따라 5 나노 미터. STEM에 대한 체류 시간 3 μs의를 사용합니다. </li><li> 옵션을 선택 &quot;이전 타일에 자동 초점은&quot;확인란을 기본 회사 설정으로 대규모 수집 소프트웨어 자동 초점을 사용하여 &quot;실행 전에 설정을 확인&quot;어디에 데이터를 저장하는 방법을 정의합니다. </li><li> 를 눌러 현미경 설정을 확인하기 위해 &quot;최적화&quot;. 참고 : 이제 필요한 시간이 쉬 될 것입니다개인적인. 이것은 최대 1 × 0.5 mm 영역에 대한 72 시간에 수 있습니다. </li><li> 창 &quot;최대 타일 해상도&quot;유형에서 20,000 그래서 각각의 타일은 무딘 가장자리 효과를 방지보다 더 큰 20K X 20K되지 않습니다. 보도는 &quot;실행&quot;. </li><li> 초점과 밝기 / 명암 ​​대비 (의 b / C)를 확인하기 위해 물었을 때, 외부 검사 발전기의 전원을 끄고 조심스럽게 현미경 소프트웨어에 초점과 난시를 조정합니다. B / C를 변경하지 마십시오. 주 : 스테이지 이동 배율 변경되었지만 배율 다시 원하는 픽셀 크기로 설정되어야 할 수있다. </li><li> 다시 외부 스캔 발전기에 스위치를 누르십시오 &quot;계속&quot;. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 데이터 분석 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 대규모 EM 파일 뷰어 프로그램을 열고 파일을 &quot;모자이크 정보&quot;를 엽니 다. 이 모든 타일 TIF-파일을 엽니 다. 이것은 바람직 새 인수를 막지 다른 워크 스테이션에서 실행된다. </li><li> 옵션 &#39;노소를 선택전체 모자이크 스티치 (매개 변수가 임계 값 0.90, 자동 노이즈 감소 바느질, 절반 모드를 중복. 경우 스티치 기준으로는에, 줌을 충족 수동 위치에 타일을 배치하고 &#39;그대로 계속&#39;을 클릭 할 수 없습니다). </li><li> HTML 파일로 내보내기, 또는 다른 하나의 TIF있다. TIF의 다운 스케일링이 필요할 수 있습니다 내보낼 수 있습니다. 이후의 측정을 가능하게하는 파일 이름의 마지막 픽셀 크기를 포함한다. </li><li> 이미지 편집 프로그램을 열어서 TIF 파일에 주석을 수행한다. 병행하여, 최적 해상도 관찰하는 웹 브라우저의 줌 가능한 HTML 파일을 연다. </li></ol>

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</ol>

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EM은 생물 학적 맥락에서 거대 분자의 고해상도 이미지와 휴대 맥락의 분석을 할 수 있습니다. 그러나, 이것은 통상적으로 시야를 제한한다. 대규모 3D EM 복잡한 데이터 처리를 요구하는 10 나노 스케일 해상도 3 차원 재구성을 만들어 매핑 신경 연결에 특히 적합하다. 대조적으로, 2D 대규모 EM는 촬상 데이터의 하나의 부분과 스티치를 요구하고, 상기 데이터의 평가는 인터넷 브라우저에 대한 액세스를 누구라도 가능하다. 우리와 다른 이전에 조직과 전체 동물을 분석하기 위해 대규모 EM을 사용했다. 가장 접근, TEM 및 SEM 기반 바느질에 관해서는 자신의 장점을 가지고 않습니다. 여기서, 스캔 전송 EM (STEM)은 높은 해상도로 넓은 시야의 생성을 허용하는 사용되었다. 큰 한 느낌을 묘화 할 때 일반적으로 하나의 STEM 이미지는 대략 100 TEM 이미지를 크게 스티치의 양을 감소시키는 관점 분야에 해당높은 해상도에서보기 DS. 높은 해상도가 필요한 경우, TEM 유리할 수있다. STEM 비 대조 샘플이 좋은 미세 콘트라스트 6 사용될 수 TEM 이상의 장점을 갖는다. 또한, 여기에 기재된 방법은 단순히 여러 섹션 현미경 시스템의 사용을 확대 실리카 웨이퍼 상에 장착 다시 산란 전자 검출 (BSD)에 사용하기 위해 조정될 수있다. HTML-줌 가능 조직 EM 파일은 환자 데이터를 분석, 과학 연구 LM 및 EM 데이터 (클레멘 타인) 8, 프리젠 테이션 목적을 결합, 그 전체 내용 분석되지 않았을 수 있습니다 데이터를 공유하고, 교육, 정량 매우 유용하다. BSD가 사용될 수 있고, 더 일반적으로 검출 줄기보다 사형 전자 현미경에 사용 가능하다 : 대안 적으로, SEM 대규모 EM에 있지만 아닌 TEM에 실리카 웨이퍼는 두 가지 장점을 갖고 이용 될 수있다. 둘째, 대형 섹션 (&gt;의 1mm 2 영역으로 설치관심이) 간단합니다. 하나의 슬롯 그리드에 설치하는 것은 노동 집약적 기술적 도전이다. TEM, SEM 및 STEM 사이의 상세 비교는 다른 곳에서 6 자세히 설명되어 있습니다. BSD 영상의 단점은 이미지 잡음 증가 줄기 비교한다는 것이다. 이것은 부분적으로 더 긴 획득 시간의 결과, 화소 체류 시간을 증가시킴으로써 보상 될 수있다. 샘플 준비 상대적으로 표준 EM 처리 (고정, 삽입 및 절편)에 대한 5-7을 필요로하지만,이 유물의 완전히없는 큰 얇은 부분을 잘라 기술적 도전이다. 섹션은 쉽게 깰 매우 연약 접거나 일반적으로 데이터 세트에 따라 여러 시간이 소요 영상 중에 파괴된다. 그러나, 원시 바이어스 데이터의 온라인 공유, 그것은 문서 데이터를 쉽게 비교하고, 컨트롤과 같은 개방 도메인 문서 셋을 사용하는 것이 가능해질 것이다. 현재 할 수있는 라 몇 EM 장치RGE 규모 분석을 사용하고, 대부분의 이미징 센터가 공동 노력을 환영하지만, 따라서이 기술에 대한 접근성은 다소 제한됩니다. 대규모 섹션의 조직이 제대로 샘플은 고정되어야한다. 즉 빠르지 만 적당한 정착 PFA의 혼합물이 느리지 만 강한 정착액 GA와 병용되는 이유이다. 절단과 유물없이 큰 부분을 따기 것은 어려운 일이다. BSD와 함께 웨이퍼 작업은 하나의 구멍 격자에 섹션을 수집에 비해 쉽다. 중금속 후 염색 고전 EM에 비해 더 중요하다. 전체 부분이 몇 군데 있기 때문에 모든 이슈가 표시됩니다. TEM 사용자가 일반적으로 어려운 때문에 현미경 동작의 차이 중, SEM으로 전환 발견. 정량 및 데이터 공유 - 세포 내 기능을 정량화하는 단일 EM 이미지에 어렵다. 가능성과 대규모의 축소이미지는 쉽게 세포 내부의 나노 측정에 의해 올 수 있습니다 관심의 세포를 식별 할 수 있습니다. 이 데이터 세트는 특정 세포 유형이 빠르게 다른 규모에서 검출 기능에 따라, 식별하고 이러한 큰 조직 섹션에 공정한 방식으로 정량화 될 수 있음을 나타냅니다. 예를 들어, 미세 아교 세포들은 형태와 치밀한 세포질에 기초하여 식별 될 수있다. 우리는 이전에 대규모 EM 조직 배양 데이터 세트 (2) 내에 ER의 폭 켰을 때, 계속해서, 각 셀의 확대에 따라, 이들 세포의 세포 내 분자 나노 기능은 동일한 세트 내에서 측정 할 수있다. nanotomy의 또 다른 장점은 온라인 대규모 데이터 세트의 호스팅하는 다른 사람이 어쩌면 다른 기능에 대한 데이터를 검사 할 수 있도록, 새로운 가설에 자신의 결론을 도출하는 것입니다. 클레멘 타인은 - 정량적 EM 촉진뿐만 아니라, 대규모 EM보다 쉽게 광 microsco를 상관하게EM 레벨 8 그림 라벨링. 본 예에서 제브라 절제 모델 식세포 미세 아교 세포의 존재를 나타낸다. 신경 과학에서 중요한 문제는 각각의 기능과 기여가 미세 아교 세포와 대 식세포와 면역 세포의 잠재적 인 다른 소스의 무엇이다. 초기 EM 연구는 질병 (18)에 미세 아교 세포의 독특한 세포 내 기능을 보여 주었다. 그들은 유전자 발현 형태와 기능의 다른 면역 세포와 큰 오버랩을 나타낸다 불행히도, 선택적으로 병리 적 환경에서 특히 미세 아교 라벨 어렵다. 따라서, 불분명 여부와 미세 수준에서 미세 아교 세포는 대 식세포에 침투 유래 단핵구를 포함하여 다른 소스에서 면역 세포와 다를 경우. 기능 차이의 분석을위한 시작점을 제공 이러한 미세 셀 사이의 차이가 있는지 이해. 선택적 형질 전환 또는 식 마커를 조합과 클레멘 타인은 DET 수 있습니다미세 기능 ection 특정 집단에 선택적. 진단 및 프리젠 테이션과 교육 - 하나의 데이터 세트 EM 데이터 내에서 마이크로에 나노를 시각화함으로써 크게 폭 넓은 관객들에게 용이하게된다. 상관 대규모 EM의 증가 가능성과 도구를 우리는 기본 및 의학 연구에 EM의 부흥을 기대하고 있습니다. 여기에 표시되는 우리의 방법은 제브라 뇌 손상 모델 (5)에인가되지만, 당뇨병 4 및 세포 배양 2의 쥐 모델에서 인체 조직 7, 래트 뇌 (3)에 사용되고, 또한 TEM과 조합하여 사용될 수있다 이 방법의 다양성을 보여주는 기반 접근 방식 1. 현미경 연산자는 더 이상 높은 선택하지, 따라서 바이어스 이미지,하지만 모든 다수의 미세 기능은 기록 및 전 세계 분석을위한 오픈되어 녹음됩니다.

최근의 기술 개발은 미세 구조 분석의 부흥을 선도, EM의 다양성, 적용 및 양적 특성을 개선했다. 진보는 직접 EM 레벨 8-10에 현미경 분석의 다른 모드를 비교하는 3D EM, 대규모 2D EM과 상관 광학 현미경과 전자 현미경 (클레멘 타인)에 대한 개선 된 방법 및 시약을 포함한다. 대규모 2D EM은 계량 또는 인간의 병리에 대한 (소설) 질병 기능을 식별, 질병 및 조직 배양 모델 동물 모델을 연구하기에 적합하다. 때문에보기의 통상적 작은 필드는 조직 대규모로 높은 배율 변화의 상관 관계뿐만 아니라 unbiasedly 정량적 미세 특징을 분석하는 것이 어렵다. 인체 조직 또는 동물 모델에서 병리학의 평가, 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 컬러 포함 된 포름 알데히드 고정 파라핀 섹션 (FFPE) TIS의 병리학 적 분석을 위해고소는 표준입니다. 간단한 외에 H &amp; E 염색 immunolabeling는 병리학 적 이상을 식별하기 위해 수행된다. 이러한 조직은 EM 수준, 특정 세포 유형에서 분석 될 수 있다면 세포 내 변화가 확인 될 수있다. 대규모 EM의 편견 특성은 질병의 예상치 못한 새로운 특징을 발견 할 수 있습니다. 대규모으로 평방 밀리미터 EM 영역까지를 시각화 할 수 있습니다. 우리와 다른 이전에 췌장 섬 4 쥐 위해 nanotomy, 세포 배양 2, 쥐의 뇌 (3), 피부 및 점막 7 및 전체 제브라 피쉬 애벌레 1.5을 (www.nanotomy.org) 적용. 제브라 피쉬의 뇌 면역 세포 (11)을 포함한 포유 동물 조직에서 접근하기 어려운 세포 유형을 시각화 특히에서, 생체 내 이미징에 매우 적합하다. 여기 nanotomy 절차에 의한 신경 메트로니다졸 변환하여 조건부 신경 절제술을받은 제브라 헤드의 관상 부에인가 상세히 설명표현 nitroreductase (www.nanotomy.org) 5,12-14. 모든 원시 데이터는 조직의 규모 변화에 분자 시각화, 줌 가능 HTML 파일로 제공됩니다. 원시 데이터의 발표는 전 세계적으로 전문가에 의해 다른 각도에서 데이터 세트의 편견 분석을 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td><강>화학</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>VWR</td><td>444152G</td><td></td></tr><tr><td>트리카인</td><td>시그마</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>트리톤-X-100</td><td>시그마</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>Polysciences</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>소듐 카코딜레이트</td><td>시그마</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19114</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 페로시아나이드 (K4[Fe(CN)]6)</td><td>Merck</td><td>4984</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트&nbsp;</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>소듐 테트라보레이트</td><td>Merck</td><td>1063808</td><td></td></tr><tr><td>톨루이덴 블루</td><td>Merck</td><td>1273</td><td></td></tr><tr><td>기본 푹신</td><td>BDH</td><td>340324</td><td></td></tr><tr><td>납 시트레이트</td><td>BDH</td><td>단종<</td><td></td></tr><tr><td>strong>EPON</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-dodecenylsuccinicacid anhydride&nbsp;</td><td>Serva</td><td>20755</td><td></td></tr><tr><td>메틸나딕 무수물</td><td>Serva</td><td>29452</td><td></td></tr><tr><td>글리시드 에테르 100</td><td>Serva</td><td>21045</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>553</td><td></td></tr><tr><td>표준 평면 임베딩 금형</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프</td><td>Diatome Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>구리 그리드&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>양면 탄소 테이프&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스캐닝 EM Zeiss Supra55</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초박 절기 Leica EM UC7</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>atlas 외부 스캔 발생기&nbsp;</td><td>피빅스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

건강 및 부상 zebrafish의 두뇌의 대규모 스캐닝 투과 전자 현미경 (nanotomy)

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

대형 2 차원 전자 현미경 (EM) 또는 nanotomy 나노 스케일 해상도 전자 현미경의 조직 전반의 애플리케이션이다. 기타 우리는 이전에 인간의 피부 췌장 섬, 조직 배양 및 전체 제브라 피쉬 애벌레 1-7로 대규모 EM을 적용했다. 여기에서 우리는 서브 세포 및 분자 기능의 편견 검출을위한 조직 규모 주사 EM에 대해 보편적으로 적용 할 수있는 방법을 설명합니다. Nanotomy는 건강하고 신경 퇴행성 제브라 피쉬의 뇌를 조사하기 위해 적용되었다. 우리의 방법은 표준화 된 EM 샘플 준비 프로토콜을 기반으로합니다 : 고정 글루 타르 알데히드와 오스뮴와, 에폭시 수지 삽입 한 다음 절편과 우라 닐 리드 포스트 염색 한 다음 하나의 홀 그리드에 얇은 섹션, 장착 초박형. 대규모 2D EM 모자이크 이미지 EM 스캔 전송 EM (STEM)를 이용하여 외부의 큰 영역 스캔 발생기에 접속 된 주사를 이용하여 취득한다. 50 G 화소 난 - 대규모 EM 이미지는 일반적으로 5 ~이다n 개의 크기, 최고의 온라인 지리적 HTML지도와 유사한 웹 브라우저에서 열 수있는 줌 가능 HTML 파일을 사용하여 볼. 이 방법은 (인간)의 조직, 간 전체 동물의 부분뿐만 아니라, 조직 배양 1-5에 적용될 수있다. 여기서, 피쉬 뇌 비 침습적 신경 절제 모델에서 분석 하였다. 우리는 신경 세포와 미세 아교 세포, 뇌의 대식 세포 등 다양한 세포 유형으로 정량화 할 수있는 세포 하나의 데이터 집합 조직 및 세포 내 변화에서 시각화. 큰 표면 영역은 이전에 이미징으로 또한 nanotomy 형광 현미경을 사용하여 동일한 조직의 광학 현미경 (클레멘 타인)와 EM의 상관 8 용이이어서 나노 해부학 (nanotomy)의 결과, 대 면적 EM을 실시 할 수있다 조직. 모두에서는, nanotomy는 조직 전체의 정량화 방식으로 EM 수준에서 기능의 편견 검출 할 수있다.

1 주 된 제브라 피쉬 유충의 머리의 관상 섹션의 대규모 EM 데이터 세트는 하나의 큰 스케일 이미지의 많은 조직과 세포의 기능을 보여줍니다 (www.nanotomy.org). 제어 뇌 부분의 Nanotomy는 후각 섬유 다발, 신경 세포의 핵 및 시냅스를 포함한 신경 하위 구획 (그림 2A, www.nanotomy.org)를 포함하여 주동이의 전뇌의 신경 조직의 전형적인 미세 특징을 보여준다. 구별 할 수있는 헤드의 세포 유형은 아래턱 큰 액포, 후각 신경 세포 osmiophilic 미엘린 작은 혈관 내피 세포 구조가 meninx (수막의 제브라 대응, 멤브레인 층 감싸는 포함와 연골을 포함 포유류의 뇌). 세포 내 구조는 다른 CEL의 표피의 글리코 칼 릭스, 다른 핵 형태학 및 초점을 포함<html> 골지체, 소포체 (ER), 미토콘드리아와 시냅스 소포 및 사후 시냅스 밀도를 포함한 리터 유형 및 세포 소기관. 예기치 않게 심실을 안감 세포의 핵은 뇌에 더 많은 측면으로 분산 다른 세포에 비해 매우 전자 밀도가 있습니다. 또한 이러한 심실 핵은 뇌의 다른 세포에 존재하며 식세포 미세 아교 세포 (그림 2)의 핵에서 발견되는 이질 염색질에서 크기와 구조가 다르게 나타날 어두운 초점을 보여줍니다. 제브라 피쉬를 개발 심실을 안감 세포들은 분화 세포보다 변경 염색질 상태를 반영 주로 방사형 신경 교세포 및 신경 전구 세포를 포함한다. 조직 줄기 세포는 일반적으로 매우 드물다 같이 nanotomy는 EM 그러므로 줄기 세포의 미세 구조의 기능을 식별하기 위해 사용될 수있는 조직 규모 줄기 세포 마커의 조직 표지를 상관한다. ve_content : 신경 절제를 겪는 제브라 피쉬 애벌레의 코로나 섹션의 &quot;FO 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; 대규모 EM은 (www.nanotomy.org) 찾을 수 없습니다 많은 특정 조직, 세포 및 분자 기능을 보여줍니다 셀룰러 기능 식세포 미세 아교 세포를 포함 할 가능성 죽어가는 세포 (도 2B, www.nanotomy.org)을 나타내는 세포의 크기를 액포 대조군이다.. 이전 EM 연구는 척추 (18, 19)의 미세 아교 세포를 확인 하였다. 미세 아교 세포의 특징적인 기능을 연장 핵 포함 다음 좁고 긴 cisternae, 상대적으로 어두운 / 밀도 세포질 및 phagosomes, 지질 방울과 리소좀 수많은 흠와 핵 봉투, 눈에 띄는 골지체, 무료 polyribosomes, 세분화 된 소포체 (ER)에 누덕 누덕 기운 염색질의 덩어리.이 모든 포유 동물 조직에서 미세 아교 세포에 의한 특징은 또한 이러한 제브라 뇌 세포 (도 2B, www.nanotomy.org)에서 발견되었다. &lt;유지-together.within 페이지 = &quot;1&quot;&gt; : FO P 클래스 = &quot;jove_content&quot; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig1.jpg" /> 그림 1 : Zebrafish의 두뇌에 큰 규모의 조직 전자 현미경의 워크 플로우. (A) 칠일 된 제브라 피쉬 애벌레. (B) 에폭시 수지에 나란히 임베디드 Zebrafish의 애벌레 머리. 반 절편과 시편을 배향를 엷게에 대한 (C) 유리 칼. (D) 두 가지를 보여주는 대표적인 semithin 톨루이딘 블루 스테인드 섹션 사이드 바이 사이드 (F).. 초박형 (70 ㎚) 섹션을 잘라 (E) 다이아몬드 칼을 제브라 피쉬 애벌레를 삽입 위치를 표시하기 위해 한 구멍 격자에 전체 제브라 피쉬 애벌레 뇌 섹션의 (D)에서 이미지를 편집. (G) 이 연구에서 대규모 2D EM에 사용되는 현미경 시스템. 이미지 처리 (H) 흐름. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig2.jpg" /> . 그림 2 : Nanotomy 결과 :. 고분자에서 조직에 처리 칠일 후 시비 제어 및 (B)의 뇌 (A) Nanotomy (신경 절제도 1), 신경에 특정 기능을 보여주는이 퇴행성 뇌를 절제 (B)이 세포 사멸 및 신경 조직 ((A)와 (B))의 해면 모양을 겪고 식세포 미세 아교 어두운 세포를 포함한다. (5 개조) 상단 패널 : 지역의 10X 확대보기 중간 패널에 표시. 중간 패널 : 지역의 10X 확대보기 낮은 패널에 표시. (A, 가운데 패널) (A, 낮은 패널)에서 neuropil 보여주는 시냅스의 높은 배율의 뷰, 시냅스 소포 (SV들)과시냅스 밀도 (PD). (B, 중앙 패널) 눈에 띄는 골지체 (G)를 포함하는 전형적인 아메바 소교 기능 (하단 패널) 표시 가능 아메바 미세 아교 세포 나 대 식세포 (가운데 패널, M)의 높은 배율의 뷰, 리소좀 액포 (L)를 포함 흠. 스케일 바 : 50 μm의 (위), 5 μm의 (중간)와 0.5 μm의 (아래). 이 그림 5에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> , 또는 전체 데이터를 온라인으로 방문 (nanotomy.org).

대규모 2D 전자 현미경(EM) 또는 나노토미는 나노 단위 해상도 EM의 조직 전체 응용 분야입니다. 여기에서는 제브라피시 유충의 뇌의 건강과 비침습적 뇌 손상을 조사하기 위해 적용되는 보편적인 나노절개술 방법을 설명합니다.

건강 및 부상 Zebrafish의 두뇌의 대규모 스캐닝 투과 전자 현미경 (Nanotomy)

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

이 대규모 전자 현미경 관찰 또는 나노토미(nanotomy) 실험의 전반적인 목표는 거대분자 수준에서 조직 수준에 이르기까지의 변화를 정의하는 것이며, 본 사례에서는 퇴행성 제브라피시 뇌를 대상으로 합니다. 나노토미는 신경 퇴행 및 제1형 당뇨병 연구와 같이 생명 과학의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.나노토미(nanotomy)의 주요 장점은 거대 분자, 세포 소기관, 세포에서 조직에 이르기까지 편향되지 않은 정보를 획득할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 정량화가 가능하며 nanotomy.org를 통한 오픈 액세스 데이터 공유가 이루어집니다. 나노토미는 제브라피쉬의 신경퇴행성 뇌 내 면역 유지와 미세아교세포에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 세포 배양, 마우스, 그리고 인간 조직을 포함한 다른 질병 모델에도 적용됩니다.일반적으로 이 기술을 처음 접하는 과학자들은 데이터의 양이 압도적으로 많기 때문에 어려움을 겪습니다. 이는 전통적인 EM으로 얻은 데이터보다 수천 배 더 많을 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 제브라피쉬 치어를 고정한 후, 오스뮴의 침투를 용이하게 하기 위해 치어의 머리를 후뇌의 전방에서 절단하십시오. 치어를 0.1 M sodium cacodylate 내의 1% osmium tetroxide 및 1.5% potassium ferrocyanide 용액에 넣고 얼음 위에서 2시간 동안 배양하십시오.그 다음 2중 증류수를 사용하여 배아를 5분씩 3회 헹굽니다. 포매 전, 샘플은 일련의 에탄올 농도 구배를 통해 탈수시켜야 합니다. 배아를 포매하기 위해, 텍스트 프로토콜에 따라 희석된 에폭시 수지에서 하룻밤 동안 배양한 후, 희석된 수지를 제거하고 순수 수지로 교체합니다.30분 동안 배양한 후, 레진을 두 번째로 교체하고 다시 30분 동안 배양합니다. 레진을 세 번째로 교체한 후, 실온에서 3시간 동안 배양합니다. 그 다음, 58 °C에서 15분 동안 배양합니다.마지막으로, 상온의 저압 상태에서 1시간 동안 배양합니다. 그다음, 해부 현미경 하에서 바늘이나 이쑤시개를 사용하여 상용 실리콘 평면 매몰 몰드에 머리 부분을 정렬합니다. 그런 후 58 °C에서 에폭시 수지를 하룻밤 동안 중합시킵니다.시료가 완전히 경화되면, 면도날을 사용하여 스터브의 과잉 수지를 다듬습니다. 정확한 위치를 확인하기 위해, 울트라 마이크로톰(ultramicrotome)에서 유리 나이프 또는 다이아몬드 히스토나이프(histoknife)를 사용하여 톨루이딘 블루/염기성 푸신(toluidine blue/basic fuchsin) 염색용 반박절 유충 절편을 제작합니다. 화염으로 끝을 밀봉한 유리 파스퇴르 피펫으로 반박절 절편을 집어 올려 현미경 슬라이드로 옮깁니다.물이 남지 않을 때까지 핫플레이트 위에서 건조합니다. 다음으로, 샘플을 1% toluidine blue 수용액에 넣고 핫플레이트에서 10초 동안 배양하여 염색합니다. 그 후, 물로 절편을 세척하고, 1% sodium tetraborate에 희석된 0.5% basic fuchsin을 사용하여 샘플을 10초 동안 추가로 염색합니다.일반 광학 현미경의 10X에서 40X 배율로 시료를 관찰합니다. 적절한 부위나 방향에 도달하면 후각와(olfactory pits), 눈 또는 회백질 경계와 같이 쉽게 식별 가능한 해부학적 구조를 이용하여 초박절편 제작 중 관심 있는 뇌 영역을 식별하고, 시료가 기울어졌을 때 절단 각도를 조정합니다. 다이아몬드 칼을 사용하여 에폭시 수지 블록을 계속 절단하여 70 nanometer 두께의 초박절편을 제작합니다.그리드 바에 의한 방해 없이 데이터를 획득할 수 있도록, 각 섹션을 단일 슬롯 L2 by 1 형태의 바코드가 부착된 구리 그리드에 마운트하십시오. 1제곱밀리미터가 작게 느껴질 수 있으나, 개구부에 딱 맞게 들어갈 것입니다.이런 방식으로 샘플이 그리드 바에 의해 가려지는 것을 방지합니다. 전통적인 EM과 비교하여 샘플에 도입된 모든 아티팩트가 기록된다는 점을 유의하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 중금속으로 샘플을 대조 염색하고 그리드 박스에 보관합니다. 주사 전자 현미경(SEM)에 샘플을 장착하려면, 전송 박스에서 단면이 포함된 그리드를 꺼내 다중 그리드 샘플 홀더에 놓고 SEM 챔버로 이송합니다.텍스트 프로토콜에 따라 검출기를 정렬한 후, 스캔할 전체 영역이 이미지 창에 들어오도록 줌 아웃하여 샘플을 사전 조사합니다. 조리개를 120 micrometers로 변경하고 이미지를 디포커싱한 후, 축소 영역 스캔 옵션을 사용하여 스캔 영역을 최대한 좁게 설정하십시오. 다음으로, 프레임당 약 1~2초 내에 스캔되도록 프레임 속도를 설정하십시오.그 다음 최소 100배로 확대하여 좁은 영역을 10초 동안 스캔합니다. 해당 영역의 밝기가 여전히 변한다면 사전 조사를 계속하십시오. 이 영역의 밝기가 주변과 비교하여 변하지 않을 때 사전 조사가 충분히 이루어진 것입니다.초점이 맞은 상태에서 가장 밝은 영역이나 특징을 선택하고, 세부 사항이 보일 수 있도록 스캔 속도를 설정하십시오. 현미경 소프트웨어에서 히스토그램을 주의 깊게 관찰하며 밝기와 대비를 조정하여 모든 픽셀이 동적 범위 내에 유지되도록 하십시오. 가장 어두운 영역과 특징에 대해서도 동일하게 수행하십시오.다시 밝은 영역으로 돌아가 히스토그램의 양측에 어느 정도 여유 공간이 있는지 확인하십시오. 46단계부터 48단계까지는 전체 영역이 동적 범위(dynamic range) 내에 들어오도록 밝기와 대비를 매우 주의 깊게 조절해야 합니다. 스캔할 전체 영역이 이미징 창에 들어오도록 줌 아웃한 후, 광범위 영역 획득 프로그램을 시작하십시오.그런 다음 위저드(wizard) 옵션을 사용하여 화면에서 영역을 선택해 모자이크를 설정하십시오. 필요한 세부 수준에 따라 2~5 nm의 픽셀 크기를 사용하고, 주사 투과 전자 현미경(STEM)의 경우 체류 시간(dwell time)을 3 µs로 설정하십시오. 최적화(optimize)를 눌러 현미경 설정을 확인하면 필요한 시간이 표시됩니다.그런 다음 외부 스캔 제너레이터를 다시 켜고 continue를 누릅니다. STEM 데이터를 분석하려면 대형 스케일 EM 파일 뷰어 프로그램을 실행하고 mosaic info라는 파일을 열어 타일형 tif 파일들을 불러옵니다. Auto Stitch Entire Mosaic 옵션을 선택하고 overlap mode는 half, stitching threshold는 0.90, noise reduction은 automatic으로 파라미터를 설정합니다.스티칭 기준을 충족할 수 없는 경우, 확대하여 타일을 수동으로 배치한 후 Continue As Is를 클릭하십시오. 데이터를 HTML 파일 또는 단일 tif 파일로 내보냅니다. 추후 측정이 가능하도록 최종 픽셀 크기와 파일 이름을 포함한 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석하십시오. 여기에서 보는 바와 같이, 대조군 뇌 절편의 나노토미(nanotomy) 분석을 통해 후각 섬유 다발, 신경세포핵, 시냅스를 포함한 신경세포 하위 구획 등 전뇌 전측부 신경 조직의 전형적인 초미세 구조적 특징이 드러납니다.여기에서 세포내 구조에는 다양한 세포 유형의 서로 다른 핵 형태와 초점(foci), 그리고 골지체, 소포체, 미토콘드리아, 시냅스 소포 및 시냅스 후 밀도를 포함한 세포소기관들이 포함됩니다. 예상외로, 뇌실을 둘러싼 세포의 핵은 뇌의 더 외측으로 분산된 다른 세포들에 비해 전자 밀도가 매우 높습니다. 미세아교세포의 경우, 핵에서 다른 뇌 세포에서는 나타나지 않는 어두운 초점(아마도 헤테로크로마틴)이 관찰됩니다.신경세포 절제술을 받는 제브라피시 유생의 관상면을 촬영한 대규모 EM 이미지에서 포식 작용을 하는 미세아교세포가 확인됩니다. 두드러진 골지체와 리소좀과 같은 수많은 봉입체를 포함하여, 포유류 세포의 미세아교세포에서 나타나는 특징들이 이 세포들에서도 발견되었습니다. 이 기술을 숙달하면 획득에 하루면 충분하며, 이는 최소 일주일이 소요되는 전통적인 EM 방식과 대조적입니다.이 절차를 수행할 때, 고품질의 이미지를 얻기 위해서는 현미경 조작자의 역할이 매우 중요합니다. 이는 단순히 버튼만 누르면 되는 기술이 아닙니다. 현재 우리는 나노토미(nanotomy)를 신경 퇴행의 제브라피쉬 모델뿐만 아니라, 세포의 면역 표지 및 초파리 조직, 인간 조직 등을 연구하는 데에도 적용하고 있습니다.이 기술은 모든 분야의 연구자들에게 새로운 길을 열어줍니다. 연구자들은 nanotomy.org에서 온라인으로 데이터 세트를 다시 확인할 수 있습니다. 이를 통해 연구된 모든 모델에 대해 나노미터에서 밀리미터 규모에 이르는 추정 변형들을 탐색할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 귀하의 연구 질문과 조사 중인 세포 또는 조직 시스템에 나노토미(nanotomy)를 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 독성 시약과 윤리적 고려 사항으로 인해 샘플 준비는 전문가만 수행해야 한다는 점을 잊지 마십시오. 하지만 누구나 집에서 nanotomy.org 웹사이트를 이용해 볼 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

이 비디오는 성인 제브라피시의 뇌를 미세 해부하는 기술을 설명합니다. 이 방법은 더 자세히 연구할 수 있는 전체 뇌 유래 중성구를 얻는 데 도움이 됩니다.

제브라피쉬 뇌 해부: 물고기 신경생물학 기법

이 비디오는 주사 전자 현미경(SEM)과 투과 전자 현미경(TEM)의 요소를 결합하여 고해상도 이미지를 생성하는 기술인 대규모 주사 투과 전자 현미경(STEM)을 사용하여 제브라피시 유충의 뇌 손상을 조사하는 방법을 보여줍니다. 뇌 손상을 식별하기 위해 샘플을 준비하고 고해상도 STEM 이미지를 획득하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

Investigating a a Zebrafish Larval Brain Injury Using Large-Scale Scanning Transmission Electron Microscopy(대규모 주사 투과 전자 현미경을 사용한 제브라피시 유충 뇌 손상 조사)

제브라피시 성체 신경 발생 및 재생의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히기 위해 우리는 제브라피시 성체 텔렌스팔론에서 기계적 손상을 일으키는 침습적 수술과 면역조직화학 또는 현장 교잡화에 의한 찌른 반구의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 개발했습니다.

Zebrafish의 성인 Telencephalon의 자상 부상 : 척추 동물의 뇌 신경 발생과 재생을 조사하는 방법

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

우리는 무딘 힘 외상성 뇌 손상 (TBI) 및 후속 신경 재생의 기초 메커니즘에 따라 병리학의 폭을 검사하기 위해 성인 얼룩말 물고기에 대한 Marmarou 체중 드롭 모델을 수정했습니다. 이 무딘 힘 TBI 모델은 확장 가능, 온화한 유도, 보통, 또는 심한 TBI, 인간의 TBI에서 관찰 부상 이질성을 다시 수상.

성인 얼룩말 피시의 무딘 힘 부상의 효과를 연구하는 확장 가능한 모델

성인 제브라피쉬의 기계적 뇌 손상 모델은 높은 재생 능력을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 설명됩니다. 이 방법은 형광 면역 염색을 사용하여 재생 반응을 평가하기 위해 여러 종의 작은 물고기의 시신경에 찔린 상처 손상을 만드는 것을 설명합니다.

재생 능력의 비교 분석을 위해 Zebrafish와 Medaka를 사용한 성인 시신경의 찔린 상처 부상 모델

삼광자 현미경 검사는 마우스와 제브라피쉬 뇌와 같은 살아있는 생물학적 조직 깊숙한 곳에서 높은 시공간 분해능으로 고대비 형광 이미징을 가능하게 합니다.

Deep-Tissue Three-Photon 형광 현미경 검사 in Intact Mouse and Zebrafish Brain

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

학습하세요 제브라피시 뇌의 대규모 투과 전자 현미경법(Nanotomy)을 통해 신경퇴행성 질환에서 거대분자에서 조직 수준까지의 변화를 정의하는 방법을. 이 기술은 뇌 구조와 기능 연구에 강력한 도구를 제공합니다.

건강 및 부상 Zebrafish의 두뇌의 대규모 스캐닝 투과 전자 현미경 (Nanotomy)

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