건강 및 부상 Zebrafish의 두뇌의 대규모 스캐닝 투과 전자 현미경 (Nanotomy)

이 대규모 전자 현미경 또는 나노토미 실험의 전반적인 목표는 퇴화하는 제브라피시 뇌에서 거대분자 수준에서 조직 수준으로의 교대를 정의하는 것입니다. 나노토미는 생명 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 신경 퇴행 및 제1형 당뇨병 연구

나노토미의 주요 장점은 거대분자, 세포 기관, 세포에서 조직에 이르기까지 편향되지 않은 정보를 획득할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 정량 분석 및 nanotomy.org 를 통한 오픈 액세스 데이터 공유가 가능합니다. 나노토미는 제브라피시 신경퇴행성 뇌의 면역 유지 및 미세아교세포에 대한 통찰력을 제공하지만 세포 배양, 마우스 및 인간 조직을 포함한 다른 질병 모델에도 적용됩니다.

일반적으로 이 기술을 처음 접하는 과학자들은 데이터의 양이 압도적이기 때문에 어려움을 겪습니다. 이는 기존 EM으로 얻을 수 있는 것보다 천 배 더 많을 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 제브라피시 유충을 고정한 후, 오스뮴의 침투를 용이하게 하기 위해 유충 머리를 뒷뇌로 자릅니다. 유충을 1%의 사산화오스뮴, 1.5%페로시아나이드칼륨, 0.1몰의 카코딜레이트 나트륨에 넣고 얼음 위에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 이중 증류수를 사용하여 매번 5분씩 배아를 세 번 헹굽니다. 포매팅하기 전에 샘플을 일련의 에탄올에서 탈수해야 합니다. 배아를 삽입하려면 텍스트 프로토콜에 따라 희석된 에폭시 수지에서 하룻밤 동안 배양한 후 희석된 수지를 제거하고 순수한 수지를 사용하여 교체합니다.

30분 동안 배양한 다음 레진을 두 번째로 교체하고 30분 더 배양합니다. 수지를 세 번째로 상쾌하게 한 후 실온에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 섭씨 58도에서 15분 동안 배양합니다.

마지막으로, 실온에서 저압으로 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 해부 현미경 아래에서 바늘이나 이쑤시개를 사용하여 시중에서 판매되는 실리콘 플랫 임베딩 몰드에서 헤드의 방향을 지정합니다. 그런 다음 에폭시 수지를 섭씨 58도에서 밤새 중합합니다.

시편이 완전히 굳으면 면도날을 사용하여 스텁에서 과도한 수지를 잘라냅니다. 올바른 위치를 감지하려면 초박 절편기에 유리 칼 또는 다이아몬드 히스토나이프를 사용하여 톨루이딘 블루/베이직 푸시신의 반박형 유충 절편을 자릅니다. 반박형 부분을 화염에 녹여 끝이 닫힌 유리 파스퇴르 피펫으로 집어 올려 미세한 슬라이드로 옮깁니다.

물이 남지 않을 때까지 열판에서 말리십시오. 다음으로, 샘플을 1%톨루이딘 블루에 물에 넣고 핫 플레이트에서 10초 동안 절편을 배양하여 염색합니다. 그런 다음 물을 사용하여 섹션을 헹군 후 05% 사붕산나트륨에 05% 기본 푸시신을 사용하여 샘플을 추가로 10초 동안 염색합니다.

10X - 40X의 일반 광학 현미경으로 샘플을 검사합니다. 적절한 부위 또는 방향에 도달하면 후각 구덩이, 눈 또는 회백질 경계를 포함하여 쉽게 식별할 수 있는 해부학적 구조를 사용하여 초박형 절편 중에 관심 있는 뇌 영역을 식별하고 샘플이 기울어질 때 절편 각도를 조정합니다. 다이아몬드 나이프로 에폭시 수지 블록을 계속 절단하여 초박형 70나노미터 절편을 절단합니다.

각 섹션을 단일 슬롯 L2 x 1 형태 바코드 구리 그리드에 장착하여 그리드 바에 의해 중단 없이 획득할 수 있습니다. 제곱 밀리미터는 작아 보일 수 있습니다. 개구부에 딱 맞을 것입니다.

이러한 방식으로 그리드 막대가 샘플을 차단하는 것을 방지합니다. 샘플에 도입된 모든 아티팩트가 기존 EM과 비교하여 기록된다는 것을 깨달으십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 중금속과 대조하고 그리드 상자에 보관하십시오. 주사 전자 현미경 또는 SEM에 샘플을 장착하려면 전송 상자의 그리드를 다중 그리드 샘플 홀더의 섹션과 함께 놓고 SEM의 챔버로 전송합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 검출기를 정렬한 후 스캔할 전체 영역이 이미지 창에 맞도록 축소하여 샘플을 사전 조사합니다. 조리개를 120마이크로미터로 변경하고 이미지의 초점이 흐려지면 축소된 영역 스캔 옵션을 사용하여 스캔된 영역을 최대한 좁게 만듭니다. 그런 다음 약 1-2초 안에 프레임을 스캔하도록 프레임 속도를 설정합니다.

그런 다음 100배 이상 확대하고 10초 동안 작은 영역을 스캔합니다. 해당 영역의 밝기가 여전히 변하면 사전 조사를 계속하십시오. 이 영역이 주변과 비교하여 밝기가 변하지 않는 경우 사전 조사로 충분합니다.

초점이 맞춰진 상태에서 가장 밝은 영역이나 기능을 선택하고 세부 사항이 표시되도록 스캔 속도를 설정합니다. 현미경 소프트웨어에서 히스토그램을 주의 깊게 관찰하여 밝기와 대비를 조정하여 모든 픽셀을 동적 범위로 유지하십시오. 가장 어두운 영역과 기능에 대해서도 동일한 작업을 수행합니다.

밝은 영역으로 돌아가서 히스토그램의 양쪽에 약간의 공간이 있는지 다시 확인하십시오. 4단계, 6단계부터 4단계, 8단계까지 밝기와 대비를 매우 신중하게 조정하여 전체 영역이 다이내믹 레인지 내에 있도록 해야 합니다. 스캔할 전체 영역이 상상 창에 맞도록 축소하고 넓은 영역 획득 프로그램을 시작합니다.

그런 다음 마법사 옵션을 사용하여 화면에서 영역을 선택하여 모자이크를 설정합니다. 필요한 세부 사항에 따라 2-5나노미터의 픽셀 크기를 사용하고 주사 투과 전자 현미경(STEM)에 대해 3마이크로초의 체류 시간을 설정합니다. 최적화를 눌러 현미경 설정을 확인하면 필요한 시간이 표시됩니다.

그런 다음 외부 스캔 생성기를 다시 켜고 계속을 누릅니다. STEM 데이터를 분석하려면 대규모 EM 파일 뷰어 프로그램을 열고 mosaic info라는 파일을 열면 타일식 tif 파일이 열립니다. Auto Stitch Entire Mosaic 옵션을 선택하고 다음 매개변수를 선택합니다. 오버랩 모드는 절반, 스티칭 임계값은 0.90, 노이즈 감소는 자동과 같습니다.

스티칭 기준을 충족할 수 없는 경우 타일을 확대하고 수동으로 해당 위치에 배치한 다음 그대로 계속을 클릭합니다. 데이터를 HTML 파일 또는 단일 tif로 내보냅니다. 나중에 측정할 수 있도록 최종 픽셀 크기와 파일 이름을 포함시킨 다음 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 대조 뇌 절편의 나노 절제술은 후각 섬유 다발, 신경 핵 및 시냅스를 포함한 신경 세포 하위 구획을 포함하는 상부 전뇌의 신경 조직의 전형적인 초미세 구조적 특징을 보여줍니다.

여기서 세포 내 구조는 골지체, 소포체, 미토콘드리아, 시냅스 소포 및 시냅스 후 밀도를 포함한 다양한 세포 유형 및 소기관에서 다양한 핵 형태와 병소를 포함합니다. 뜻밖에도, 심실 내벽의 세포핵은 뇌에서 더 측면으로 분산되어 있는 다른 세포에 비해 매우 전자 밀도가 높습니다. 미세아교세포(microglia)에서 핵은 또한 뇌의 다른 세포에는 없는 어두운 초점(아마도 이염색질)을 보여줍니다.

신경 세포 절제를 받는 제브라피시 유충의 코로나 단면을 대규모로 촬영한 이 이미지는 식세포 미세아교세포를 보여줍니다. 포유류 세포에서 미세아교세포의 특징은 두드러진 골지체(Golgi apparatus) 및 리소좀(lysosome)과 같은 수많은 내포물을 포함하여 이 세포에서도 발견되었습니다. 일단 마스터하면 하루 안에 획득을 완료할 수 있으며, 기존 EM은 최소 일주일 이상 소요됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 현미경 작업자가 고품질 이미지를 얻는 데 중요한 역할을 하는 것이 중요합니다. 이것은 단순히 버튼을 누르는 기술이 아닙니다. 우리는 이제 신경 퇴행의 제브라피시 모델뿐만 아니라 세포의 면역 표지와 파리, 인간 조직 등의 조직을 연구하는 데에도 나노토미를 적용했습니다.

이 기술은 모든 분야의 모든 연구자를 위한 길을 열어줍니다. nanotomy.org 에서 온라인으로 데이터 세트를 다시 방문할 수 있습니다. 그런 다음 나노미터에서 밀리미터 단위에 이르는 추정 변경 사항과 연구된 모든 모델을 탐색할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 연구 질문과 조사 중인 세포 또는 조직 시스템에 나노절개술을 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 독성 시약과 윤리적 고려 사항 때문에 전문가만이 샘플 준비를 해야 하지만 누구나 웹사이트 나노토미를 시도할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. org를 집에서 사용할 수 있습니다.