모델링 화학 요법 내성 백혈병 체외

이 절차의 전반적인 목표는 시험관 내에서 저항성 급성 림프구 백혈병(ALL)을 더 잘 모델링하는 것입니다. 이 방법은 골수 미세환경이 ALL 세포 화학요법 내성에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 난치성 ALL 치료의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 불응성 모든 세포에 대한 약물 옹호를 조사하기 위해 기존 동물 모델을 사용하는 것보다 훨씬 저렴하고 시간이 덜 걸린다는 것입니다.

10ml의 종양 특이적 배양 배지에 있는 5-20배 10-6번째 백혈병 세포를 80-90%의 융합 골수 기질 세포 또는 조골세포로 구성된 100mm 플레이트에 파종하는 것으로 시작합니다. 4일마다 플레이트를 옆으로 기울이고 1ml를 제외한 모든 배지를 흡인하고 부착된 세포층을 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 9ml의 신선한 백혈병 세포 배양 배지를 측면을 따라 플레이트 모서리에 적가하여 부착 세포의 파괴를 최소화합니다.

공동 배양 12일째 후, 배양 배지를 플레이트 위로 약 5-10회 부드럽게 피펫팅하여 부유 백혈병 세포를 수집합니다. 그리고 세포를 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음, 방금 보여준 것처럼 80-90%가 합류하는 골수 기질 세포 또는 조골세포(osteoblast)로 구성된 새로운 플레이트에 세포를 다시 파종합니다.

4일째가 되면 백혈병 세포의 하위 집단 3개가 형성되고 부유한 백혈병 세포가 배지에서 자유롭게 떠다닐 것입니다. 위상 브라이트 백혈병 세포는 부착 세포 단층의 표면에 부착되고 위상 딤 백혈병 세포는 단층 아래로 이동했습니다. G10 비드 컬럼을 준비하려면 먼저 컬럼당 30ml의 세포 배양 배지를 수조에서 섭씨 37도로 재가열합니다.

그런 다음 핀셋을 사용하여 유리솜을 얇고 느슨한 가닥으로 당깁니다. 그리고 필요한 컬럼당 10ml 주사기 1개에 가볍게 채워진 가닥을 여러 겹으로 추가합니다. 주사기가 2/3 찼을 때 닫힌 위치에 있는 단방향 스톱콕을 팁에 부착하고 스톱콕 아래에 50ml 원추형 수집 튜브를 놓을 수 있을 만큼 충분히 높은 링 스탠드에 주사기를 고정합니다.

이제 주사기 컬럼 아래에 수집 튜브를 놓습니다. 그리고 10ml 피펫을 사용하여 PBS에 현탁된 G10 입자 방울을 유리솜 위에 추가합니다. 2밀리리터 펠릿이 형성될 때까지 G10 입자를 계속 첨가합니다.

그런 다음 예열된 배지의 부분 표본 2ml를 컬럼에 추가합니다. 그리고 매체가 기둥에서 떨어질 정도로 흘러나오도록 스톱콕 밸브를 천천히 엽니다. 10ml의 매체가 컬럼을 통해 완전히 배수되면 스톱콕을 닫습니다.

플로우 스루(flow through)를 버리고 컬럼 아래에 새 수집 튜브를 놓습니다. 부유 종양 하위 집단을 채취하려면 백혈병 세포 공동 배양 플레이트에서 배지를 흡인하고 동일한 배지를 사용하여 플레이트를 한 번 부드럽게 헹굽니다. 그런 다음 부유 현탁 백혈병 세포 하위 집단을 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

Phase Bright 종양 하위 집단을 수확하려면 10ml의 새로운 배지를 공동 배양 플레이트에 다시 추가합니다. 그리고 약 5회 정도 세게 헹구어 부착 세포 단층을 제거하지 않고 부착 백혈병 세포를 제거합니다. 그런 다음 Phase Bright 하위 개체군을 자체 15ml 원뿔형 튜브로 이동합니다.

Phase Dim tumor subpopulation을 수확하려면 1mL PBS 헹굼으로 나머지 배지를 제거합니다. 그리고 섭씨 37도에서 3밀리리터의 트립신으로 세포를 분리합니다. 5분 후 플레이트의 측면을 부드럽게 두드려 부착 세포를 제거한 다음 FBS 1ml를 첨가하여 효소 반응을 멈춥니다.

그런 다음 혈청을 3-5회 헹구어 큰 세포 응집체를 분해합니다. 그리고 정제되지 않은 Phase Dim 하위 집단을 새로운 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 모든 하위 모집단이 수집되면 세포를 스핀다운합니다.

그리고 각 펠릿을 1 밀리리터의 예열 된 매체에 다시 매달아 놓습니다. 마개를 완전히 닫은 상태에서 각 하위 모집단에 대해 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 1 밀리리터 부피의 전체 세포를 준비된 G10 컬럼 중 하나의 상단에 드롭 방식으로 추가하여 세포가 G10 펠릿 위 또는 내부에 남아 있는지 확인합니다. 세포가 실온에서 20분 동안 G10 펠릿에서 배양하도록 합니다.

그런 다음 1-3밀리리터의 새로운 예열 배지를 컬럼에 추가합니다. 그리고 매체가 천천히 기둥에서 떨어지도록 스톱콕을 엽니다. 예열된 매체를 1-2밀리리터 단위로 컬럼에 계속 추가합니다.

총 15-20ml의 백혈병 세포가 채취되면 마개를 닫고 채취 튜브를 닫습니다. 그런 다음 세포를 스핀다운하고 펠릿을 적절한 다운스트림 분석 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 부착 세포층의 트립신화(trypsinization) 후, 전방 산란 분석과 측면 산란 분석(side scatter analysis)을 통해 두 개의 뚜렷한 세포 집단이 관찰됩니다.

G10 분리 후 모든 세포의 순수한 집단이 회수됩니다. 특히 흥미로운 것은 골수 기질 세포 또는 조골세포 공동 배양에서 회수된 모든 위상 딤 세포는 세포독성 화학요법에 노출된 후 거의 또는 전혀 사멸을 나타내지 않는다는 것입니다. 이러한 절차를 시도하는 동안 백혈병 세포에서 발생할 수 있는 표현형 변화를 줄이기 위해 이러한 단계를 가능한 한 적절하게 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 기술은 백혈병 연구 분야의 연구자들이 골수 미세환경과 더 유사한 체외 모델에서 화학요법 내성 백혈병을 모델링할 수 있는 방법을 제공합니다.