Name: 모델링 화학 요법 내성 백혈병 체외 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 탐색하세요 골수 기질 세포와 공배양을 이용한 급성 림프모구 백혈병의 화학요법 내성 메커니즘. 이 모델은 내성 세포를 분리 분석하여 새로운 치료 전략을 평가할 수 있는 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

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National Institutes of Health(NHLBI) R01 HL056888(LFG), National Cancer Institute(NCI) RO1 CA134573NIH(LFG), P30 GM103488(LFG), WV CTR-IDEA NIH 1U54 GM104942, Alexander B. Osborn Hematopoietic Malignancy and Transplantation Program, WV Research Trust Fund의 지원을 받습니다. NIH S10-OD016165 및 NIH Institute of General Medical Sciences 산하 NIH Institute of General Medical Sciences(CoBRE P30GM103488 및 INBRE P20GM103434)의 Institutional Development Award(IDeA)의 지원을 받는 Kathy Brundage 박사와 West Virginia University 유세포 분석 핵심 시설의 지원에 감사드립니다.

1. 고급 준비 <ol><li> 덱스 트란 G10 입자를 준비합니다. <ol><li> 10g의 G10 입자로 1X PBS 50 ㎖를 첨가하여 G10 슬러리를 준비한다. 반전에 의해 믹스와 G10가 4 ° CO / N에서 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서 정착 할 수 있습니다. </li><li> G10 컬럼 분리의 날, 정착 G10 입자에서 흡인 PBS 및 50 ml의 신선한 PBS를 추가합니다. 반전으로 섞는다. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 정착 G10 입자와 저장소에 50 ml의 신선한 PBS를 추가, 두 번 반복합니다. </li></ol></li><li> BMSC와 OB를 배양. <ol><li> 90 % 컨 플루 언시에 도달 할 때까지 6 % CO 2 및 10cm 조직 배양 플레이트에서 성장하고 37 ° C에서 BMSC 또는 OB를 모두 유지한다. </li><li> 새로운 10cm 플레이트에 2를 Trypsinize BMSC 또는 OB 세포와 1 분할. 백혈병 공동 배양에 필요한 때까지 세포는 이러한 표준으로 성장하고 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. 구축 및 공동 문화를 유지 <ol><li> 5 ~ 20 × 10 (6) 백혈병 세포를 추가하기 전n은 80 % -90 %의 합류 BMSC 또는 OB 판 상에 종양 특이 적 배양 배지 10 ㎖. 참고 : 우리의 실험실 더 나은 1 %에서 7 % 16 ~ 18의 범위 것으로 나타났다 골수 미세 환경을 요점을 되풀이하는 5 % O 2에서 37 ° C에서 공동 문화를 유지한다. 그러나,이 산소 장력 공동 배양을 유지하는 세 백혈병 개체군의 확립에 중요하지 않으며 실의 재량이다. </li><li> 매 4 번째 날 (정지에서 백혈병 세포를 포함) 미디어의 1ml를 제외하고 모두 제거하고 9 ml의 신선한 백혈병 배양 배지로 교체. 판에서 미디어의 9 ml의를 제거 할 때, BMSC 또는 OB 접착층을 방해하지 않도록주의. <ol><li> 플레이트의 모서리에있는 측과 대기음 미디어에 판을 기울여 용지를 제거합니다. 신선한 매체를 추가 할 때 또한, BMSC 또는 OB 접착 층의 중단을 최소화 할 수 있도록 측벽에 대한 플레이트의 모서리에 적가를 추가해야합니다. </li></ol></li><li> 공동 문화의 12 일 하루를 보낸 후, 약 5 ~ 10 배를 요리부터 문화 미디어를 피펫 팅 아래로 부드럽게 접시 위에 의해 BMSC 또는 OB 층에서 백혈병 세포를 씻어 다음 15 ML 원뿔 튜브에 수집합니다. 단계 2.1에 설명 된대로 새 80 % -90 %의 합류 BMSC 또는 OB 판에 시드. 참고 : BMSC 또는 OB 단층을 방해하지 않고 S 및 PB 백혈병 세포를 제거 단계 2.3에 설명 된대로 공동 문화의 부드러운 세정. 이것은 종양 세포는 다음 공동 배양 플레이트로 전달 될 수있다. 시간 12 일주기는 사용자의 필요에 따라 필요한만큼 여러 번 반복 될 수있다. </li></ol> 3. 준비 G10 구슬 열 주 : 멸균 하류 분석 또는 배양이 G10 컬럼 분리 한 다음 필요한 경우 다음 단계 멸균 기법을 이용하여 수행되어야하고, G10 컬럼 멸균 생물학적 후드에 설치되어야한다. <ol><li> 사전 WARM은 세포 배양 미디어 수조에서 37 ° C까지 (~ 30 ml의 컬럼 당). 10 ㎖의 일회용 주사기를 사용하여 제거하고 플런저를 폐기합니다. 주사기에 유리 섬유를 추가합니다. </li><li> 핀셋을 사용하여, 얇은 느슨한 가닥에 유리 섬유를 따로 빼냅니다. 주사기의 2/3이 유리 털실로 가득 채운 때까지 주사기로 가볍게 포장 유리 섬유의 여러 레이어를 추가합니다. 주 : 유리솜은 백혈병 세포 콜렉션을 오염시키는 이른바 G10 입자를 방지하는 것이 중요하다. 확실히 유리 섬유는 G10 입자를 지원하기에 충분 포장,하지만 너무 조밀하게 열을 통해 미디어의 흐름을 차단하는 포장되지되어 있는지 확인합니다. </li><li> 폐쇄 위치에서 주사기의 끝 부분에 1 방향 스톱 콕을 부착합니다. </li><li> 링 클램프 주사기 열 때문에 50 ML 원뿔 튜브 (포집 관)는 꼭지 아래에 배치 할 수 있습니다 충분 서있다. 주사기 열에서 수집 튜브를 놓습니다. </li><li> 10 ML의 피펫의 상단에 열을 PBS에 재현 탁, G10 입자를 추가 드롭 현명한 사용유리솜. 유리면 위에 G10 입자 형태 (주사기 눈금으로 측정) ~ 2 mL의 펠렛까지 G10 입자를 계속 추가. </li><li> 미리 예열 미디어와 G10의 열 평형. <ol><li> 열을 미리 예열 미디어 2 ML을 추가합니다. 그래서 오픈 스톱 콕 밸브는 천천히 미디어 드롭 현명한 열 밖으로 흐른다. </li><li> 미리 예열 미디어 10 ㎖의 총 때까지 단계를 반복 3.6.1은 열 가로 질러왔다. 참고 : G10 입자 포집 관에서를 통해 흐름에서 볼, 중 1)보다 G10 입자를 추가하는 경우 추가 G10 입자가 열에서 탈출하지 확인한 ~ 2 ml의 펠렛을 유지하거나 2)하지 않는 한 반복과 열을 교체 3.4-3.6.1 단계를 반복합니다. </li><li> 열에서 미리 예열 미디어 빼낸 후, 꼭지를 닫고 통해 흐름을 수집 튜브를 폐기합니다. 열에서 새 컬렉션 튜브를 추가합니다. 열 매체 + 세포 혼합액로드 될 준비가되어있다. 참고 : 열즉시 사용 및 건조 허용되지해야합니다. </li></ol></li></ol> 4. 공동 문화 내에서 3 부분 집단을 분리 <ol><li> 서스펜션 (S) 종양 모집단의 컬렉션입니다. <ol><li> 공동 배양 접시에서 대기음 미디어 피펫 부드럽게 플레이트를 씻어 15 ML 원뿔 튜브에 백혈병 세포를 포함하는 미디어를 수집하기 위해 같은 미디어를 신청 다시. 수집 백혈병 세포 S 아군이다. </li></ol></li><li> 단계 밝은 (PB) 종양 모집단의 컬렉션입니다. <ol><li> 공동 배양 접시에 다시 10 ml의에게 신선한 매체를 추가합니다. 부착 백혈병 세포 만 부착 BMSC / OB 성분을 제거하기 어려운 충분하지를 제거하기 위해 위 아래로 약 5 시간을 추가 한 미디어를 피펫 팅에 의해 적극적으로 씻어. </li><li> 피펫 기음과 15 ML 원뿔 튜브 미디어를 수집합니다. 수집 된 세포는 PB 아군이다. </li></ol></li><li> 단계 어둡게 (PD) 종양 모집단의 컬렉션입니다. <ol><li> 렘 1 ml의 PBS와 린스 판비켜 남은 용지. 5 분 동안 37 ° C 배양기에 3 ㎖ 트립신과 장소를 Trypsinize 공동 문화 판. </li><li> 부착 BMSC / OB을 제거하기 위해 플레이트의 측면을 누릅니다 부드럽게 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 떨어져 큰 세포 집합체을 깰 1 ml의 소 태아 혈청 (FBS) 및 피펫 위아래로 3-5 시간을 추가합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 세포와 미디어를 수집합니다. 이러한 세포뿐만 BMSC / OB로 미정 PD 아군이다. </li></ol></li><li> 원심 분리기 3 7 분 동안 400 XG에서 소집단을입니다. 기음과 폐기 뜨는는 개별적으로 1 ml의 사전 예열 매체에 펠렛을 재현 탁. 세포는 G10 컬럼에로드 할 준비가 된 것입니다. </li></ol> G10 열 상 (5)로드 공동 배양 세포 참고 : 확인 꼭지를 확인 완전히 G10 컬럼 미디어 포함하는 셀을 추가하기 전에 폐쇄된다. 또한, 각각의 하위 집단은부터 소개하기 위해 그렇게하지 ​​별도의 G10 컬럼을 통해 실행해야합니다다운 스트림 분석 인구 사이의 바이어스를 전자. <ol><li> 1,000 μL 피펫을 사용하여, 드롭 현명한 별도의 G10 컬럼에 미리 예열 미디어에서 각 셀의 모집단 1 ㎖를 추가합니다. 세포를 포함하는 미디어가 상단이나 G10 펠릿 내에 남아 있는지 확인합니다. 세포가 실온에서 20 분 동안 G10 펠릿에 품어 할 수 있습니다. 참고 : 조절판은 배양 기간 동안 폐쇄 남아있다. </li></ol> 6. G10 열에서 백혈병 세포를 수집 <ol><li> 각 G10 컬럼에 1-3 ml의 사전 예열 매체를 추가합니다. 오픈 스톱 콕 밸브와 미디어 천천히 열을 적가 종료 할 수 있습니다. 참고 : 열 또는 열에서 씻고 고립 된 백혈병 세포를 오염시킬 수 BMSC / OB를 포함하는 G10 펠릿에서 느린 유속을 유지하는 것이 중요하다. </li><li> 15 ~ 20 ML의 총까지 G10 컬럼 작은 단위 (1-2 ml)에 미리 예열 미디어를 계속 추가 칼럼을 통해 실행하고 수집하고 있습니다. 닫기 스톱 콕 버지니아LVE와 모자 포집 관. 참고 : G10 입자 펠릿 수집 튜브의 하단에 볼 경우, 부드럽게 G10 입자 펠릿 그대로 새로운 튜브로 전송 떠나는 튜브에서 용지를 제거합니다. </li><li> 원심 분리기는 실온에서 7 분 동안 400 XG에 미디어를 모았다. 상층 액을 제거하고 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 적절한 버퍼에 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 셀은 BMSC 또는 OB 오염없는 백혈병 세포의 순수 인구이며 사용자 재량 하류 어플리케이션에 적용 할 준비가되어있다. 참고 : G10 컬럼을 통해 세포를 통과 할 때 백혈병 세포 생존 능력은 변경되지 않은 상태로 유지해야합니다. </li></ol>

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저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

질병의 재발에 기여 최소 잔존 질환 (MRD)는 모든 공격 내화물의 치료에서 주요 임상 과제이며, 또한, 다른 혈액 학적 악성 종양의 호스트로 계속된다. 골수 미세 환경 모두에서 재발 -3,8-의 일반적인 위치이다. 이와 같이, 골수 미세 환경을 모델링 모델 요법 노광 중에 백혈병 종양 세포 생존 및 MRD의 유지에 관한 가설을 테스트하기 위해 중요한 도구이다. 마우스 모델은 약물 효능에 관한 시험 질문에 대한 황금 표준을 정의하는 동안, 2D 공동 문화는 백혈병 세포 생존의 뼈 내일의 미세 환경 지원과 관련 테스트 가설 및 약물 전략에 대한 비용 효과적인 방법되고 있습니다. 많은 그룹은 BMSC와 백혈병 세포의 공동 문화를 보여 주었다 또는 화학 요법 제 9,10,12-14,19-21에 도전 할 때 OB는 생존 이점을 제공한다. 작업 모델링 일반 미숙 한 CD34 + HEMA중간 엽 줄기 세포 (MSC)와 공동으로 문화 topoietic 세포는 조혈 세포는 조혈 세포 (22, ...

설명된 방법의 전반적인 목표는 화학 요법에 노출되는 동안 백혈병 세포의 생존을 지원하는 골수 지원 메커니즘의 기초가 되는 메커니즘의 조사를 지원하는 효율적이고 비용 효율적인 체외 접근 방식을 제공하는 것입니다. 치료 후에도 잔존하는 잔여 종양 세포가 재발에 기여한다는 것은 잘 알려진 사실이며, 이러한 질환은 진단 당시보다 더 공격적이며 치료의 효과가 떨어지는 경우가 많다1-8. 치료 접근법을 테스트하기 위해 배지 내 세포 배양에만 국한되는 것과 같이 백혈병 세포를 단독으로 포함하는 모델은 이러한 중요한 신호 또는 틈새 세포와 매우 특이적인 상호 작용을 하는 종양 세포 하위 집단이 향상된 보호를 유도하는 틈새 파생 단서의 가용성에 반응하여 발생하는 질병의 이질성을 고려하지 않습니다. 골수 유래 기질 세포와 백혈병 세포를 공동 배양하는 표준 2D 공동 배양 모델은 골수 틈새의 기여도를 어느 정도 다루었으며 골수 미세환경 세포와의 상호 작용이 화학 요법에 대한 저항력을 증가시키고 성장 특성을 변화시킨다는 것을 보여주었습니다9-14. 그러나 이러한 모델은 종양 세포의 장기 생존을 요약하지 못하는 경우가 많으며 MRD에 기여하는 가장 내성이 강한 백혈병 세포 집단과 관련된 결과를 정확하게 알려주지 않습니다. 생체 내 모델은 여전히 중요하며 임상 시험 전에 혁신적인 치료법을 조사하기 위한 "황금 표준"을 정의하지만, 내성 종양 및 질병 재발과 관련된 가설을 테스트하는 데 필요한 시간과 비용으로 인해 종종 어려움을 겪습니다. 따라서 보다 유익한 2D 모델의 개발은 후속 쥐 기반 전임상 설계의 설계에 더 나은 정보를 제공하기 위한 파일럿 조사에 도움이 될 것입니다. 
이 보고서에 제시된 2D 체외 모델은 실제 생체 내 미세환경의 복잡성은 부족하지만, 종양 세포의 화학내성 하위 집단을 풍부하게 하는 데 특히 적합한 미세환경과의 종양 상호 작용을 조사할 수 있는 비용 효율적이고 재현 가능한 수단을 제공합니다. 이러한 구분은 전체 종양 세포 집단에 대한 평가가 가장 중요한 표적을 구성하는 소그룹의 치료 저항성 종양 세포의 표현형을 가릴 수 있기 때문에 가치가 있습니다. 또 다른 장점은 관심 있는 분석에 맞게 모델을 확장할 수 있다는 것입니다. 종양 세포의 상당한 회수가 필요한 분석을 위해 벌크 배양을 설정할 수 있으며, PCR 기반 분석 또는 현미경 기반 평가에는 다중 웰 플레이트의 소규모 공동 배양을 활용할 수 있습니다. 
이러한 필요에 따라 우리는 B-계통 급성 림프구 백혈병(ALL)의 특징인 질병의 이질성을 해결하기 위해 체외 모델을 개발했습니다. 우리는 건강한 세포와 많은 공통점을 공유하는 모든 세포가 BMSC 또는 OB 공동 배양의 별개의 구획에 국한되어 있음을 보여줍니다. 치료 반응 조사에 유용한 뚜렷한 표현형을 가진 3개의 종양 세포 집단이 생성됩니다. 구체적으로, 우리는 공동 배양의 "위상 딤"(PD) 집단에서 회복된 (모든) 세포가 세포독성 물질에 노출되지 않은 종양 세포와 유사한 생존 요법에 일관되게 불응성을 보인다는 것을 입증합니다. 확립된 세포주 또는 1차 환자 샘플에서 추출한 이러한 모든 세포는 부착 기질 세포 또는 조골세포층 아래로 이동하지만 배양물의 트립신화 및 겔 유형 10 가교 덱스트란(G10) 입자 컬럼15을 활용하여 세포 유형을 분리한 후 캡처할 수 있습니다. 
여기에서는 골수 미세환경 기질 세포(BMSC/OB)와 백혈병 세포 간의 상호 작용을 모델링하는 데 사용할 수 있는 2D 공동 배양 설정을 제시합니다. 특히 중요한 것은 백혈병 세포가 기질 세포 단층에 비해 3개의 공간적 하위 집단을 형성한다는 관찰과 PD 집단이 BMSC 또는 OB와의 상호 작용으로 인해 화학 요법 내성 종양 집단을 나타낸다는 관찰입니다. 또한, G10 컬럼으로 백혈병 세포 집단을 효과적으로 분리하는 방법을 보여줍니다. 주목할 점은 이러한 하위 집단을 분리하면 가장 내성이 강한 PD 집단의 다운스트림 분석을 통해 골수 미세환경 기질 세포 또는 조골세포와의 상호 작용으로 인해 이러한 세포에 부여되는 잠재적인 내성 모드를 결정할 수 있다는 것을 발견했습니다. 이 공동 배양 및 분리 모델의 다운스트림에서 활용한 기술에는 유세포 분석 평가, 단백질체 분석 및 표적 단백질 발현 평가뿐만 아니라 최근에 개발된 레이저 절제 전기 분무 이온화(LAESI) 및 대사 프로파일을 평가하기 위한 Seahorse 분석이 포함됩니다. 위의 기술과 함께 이 모델을 사용함으로써 우리는 백혈병 세포의 PD 집단이 배지에서 단독으로 배양된 백혈병 세포 또는 동일한 공동 배양에서 다른 하위 집단에서 회수된 백혈병 세포와 비교할 때 고유한 화학 요법 내성 표현형을 가지고 있음을 발견했습니다. 따라서 이 모델은 골수 미세환경과의 상호 작용을 통해 내성 표현형을 도출하는 가장 화학요법 저항성이 높은 백혈병 세포를 대상으로 하는 테스트 전략을 보다 엄격하게 평가하는 데 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>G10 세파 덱스 비즈</td><td>시그마</td><td>G10120</td><td>원고에서 젤 유형 10 가교 덱 스트란 입자</td></tr><tr><td>10ml 멸균 주사기</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>유리 양모</td><td>파이렉스</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>1 방향 스톱 콕</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14054-10</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>World Wide Medical Products</td><td>41021039</td><td>수집 튜브로 사용</td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>World Wide Medical Products</td><td>41021037</td><td>세포 수집에 사용</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>시그마</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin&nbsp;</td><td>미디어테크, Inc.</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm 세포 배양 접시</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Culture media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osteoblast culture media&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-27001</td><td>인간 조골세포 배지용&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 미디어</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>15-040</td><td>종양 매체 준비용&nbsp;</td></tr><tr><td>세포주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>부착 세포:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Osteoblasts</td><td>PromoCell</td><td>C-12720</td><td>Human osteoblast는 공급업체에 따라 배양되었습니다. s 권장 사항.&nbsp;</td></tr><tr><td>Human Bone Morrow Stromal Cells</td><td>WVU Biospecimen Core</td><td></td><td>비식별화된 원발성 인간 백혈병 및 골수 기질 세포(BMSC)는 Mary Babb Randolph Cancer Center(MBRCC) Biospecimen Processing Core 및 West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank에서 제공했습니다. BMSC 배양은 앞서 기술한 바와 같이 확립되었다 (*)</td></tr><tr><td>Leukemic Cells:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>REH</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CRL-8286</td><td>REH 세포는 공급자에 따라 배양하였다. 의 권장 사항 및 권장 미디어.&nbsp;</td></tr><tr><td>SD-1</td>, <td>DSMZ</td>, <td>ACC 366</td>, <td>SD-1을 공급자에 따라 배양하였다. 의 권장 사항 및 권장 미디어.&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. 에토포사이드에 의한 골수 기질 세포 기능의 붕괴. Biol 혈액 골수 이식 J am Soc 혈액 골수 이식. 1997년 8월; 3(3):122&ndash;32.</td></tr></tbody></table>

모델링 화학 요법 내성 백혈병<em&gt; 체외</em

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

골수 미세환경이 이 지역에서 시작되고 진행되는 조혈 질환에 대한 독특한 성역 장소를 제공한다는 것은 잘 확립되어 있습니다. 현재 보고서에 제시된 모델은 인간의 1차 골수 기질 세포와 조골세포를 종양 세포 표현형에 영향을 미치는 골수 틈새의 두 가지 대표 세포 유형으로 활용합니다. 이러한 주요 틈새 성분을 가진 인간 백혈병 세포에 대해 설명된 체외 공동 배양 조건은 다양한 기술에 의한 분석을 위해 배양에서 효율적으로 회수할 수 있는 종양 세포의 화학 저항성 하위 집단의 생성을 지원합니다. 영양 플럭스를 방지하기 위한 엄격한 섭식 일정에 이어 젤 유형 10 가교 덱스트란(G10) 입자 부착 골수 기질 세포(BMSC) 또는 조골세포(OB) 아래로 이동한 종양 세포 집단의 회수는 종양 세포의 "위상 딤"(PD) 집단을 생성함으로써 정제된 치료 저항성 백혈병 세포의 일관된 공급원을 제공합니다. 임상적으로 관련된 이 종양 세포 집단은 세포사멸, 대사 및 세포주기 조절 경로를 조사하기 위한 표준 방법으로 평가할 수 있을 뿐만 아니라 최소 잔류 질환을 대상으로 하는 전임상 조사 전에 새로운 치료 전략을 테스트할 수 있는 보다 엄격한 표적을 제공할 수 있습니다.

이 공동 문화 모델의 성공적인 설치 및 문화. 부착 BMSC 또는 OB 단층에 비해 백혈병 세포의 3 개체군의 설립 결과 1 BMSC 단일 층으로 시드 ALL 세포가 초기에 중단의 같은 단 하나의 인구를 표시하는 방법을 보여줍니다 것이다 백혈병 세포. 백혈병 세포는 백혈병 세포의 개체군 3 공간을 형성하도록 상호 작용 BMSC 사일의 과정 ((현탁 S) 상 밝은 (PB) 및 위상 딤 (PD)). 종양 세포의 3 소집단 일반적 BMSC 또는 OB와 공동 - 배양 후 24 시간 후에 볼 수 있지만, 우리는 백혈병 세포 및 BMSC / OB 셀 간의 전체 역학과 상호 작용이 일어날 수 있도록 4 일 동안 세포를 배양 된 공동 어떤 조작이나 실험을하기 전에 장소 (그림 1) 소요됩니다. 또한, 우리는 꿀벌이있는 골수 생리학 요점을 되풀이 5 %의 산소 장력에서 공동 배양을 유지 유의여기...

현재 보고서는 가장 화학저항성이 높은 하위 모집단의 농축에 중점을 두고 백혈병 세포에 대한 골수 미세환경 틈새의 영향을 모델링하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 요약합니다.

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 내성 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL)을 인비트로(in vitro)에서 더 잘 모델링하는 것입니다. 이 방법은 골수 미세환경이 ALL 세포의 화학요법 내성에 어떻게 영향을 미치는지에 대해, 불응성 ALL 치료의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 불응성 ALL 세포에 대한 약물 효능을 조사하기 위해 전통적인 동물 모델을 사용하는 것보다 비용이 훨씬 저렴하고 시간이 적게 소요된다는 점입니다.먼저 80~90% 합류(confluent) 상태의 골수 기질 세포 또는 조골세포가 배양된 100 mm 플레이트에 10 mL의 종양 특이 배양 배지가 포함된 5~20 × 10⁶개의 백혈병 세포를 분주합니다. 4일마다 플레이트를 옆으로 기울여 부착된 세포층이 손상되지 않도록 주의하며 배지 1 mL만 남기고 모두 흡입하여 제거합니다. 그 후, 부착 세포의 교란을 최소화하기 위해 9 mL의 신선한 백혈병 세포 배양 배지를 플레이트 가장자리 구석에 천천히 한 방울씩 첨가합니다.공동 배양 12일 후, 부유하는 백혈병 세포를 수집하기 위해 플레이트 위에서 배양액을 약 5~10회 천천히 파이펫팅합니다. 그 다음, 세포를 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음, 앞서 시연한 것과 같이 80~90% 정도 confluence가 형성된 골수 기질 세포 또는 조골세포가 있는 새 플레이트에 세포를 다시 분주합니다.4일 차가 되면 백혈병 세포의 세 가지 하위 집단이 형성되며, 부유 백혈병 세포는 배지 속에서 자유롭게 떠다니게 됩니다. Phase Bright 백혈병 세포는 부착 세포 단층의 표면에 부착되며, Phase Dim 백혈병 세포는 단층 아래로 이동합니다. G10 비드 컬럼을 준비하려면, 먼저 워터 배스에서 컬럼당 30 milliliters의 세포 배양 배지를 37 degrees Celsius로 데웁니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 유리솜을 얇고 느슨한 가닥으로 풉니다. 필요한 컬럼 수만큼 10 milliliter 주사기 하나당 가볍게 채워진 가닥을 여러 층으로 넣습니다. 주사기의 2/3가 채워지면, 팁에 일방향 스톱콕을 닫힘 상태로 부착하고, 스톱콕 아래에 50 milliliter 원추형 수집 튜브를 놓을 수 있을 만큼 충분한 높이의 링 스탠드에 주사기를 고정합니다.이제 주사기 컬럼 아래에 수집 튜브를 배치하

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 백혈병 세포와 골수 기질 세포의 장기 2D 공동 배양 기술을 설명하여 골수 미세환경과의 상호 작용을 연구합니다. 2D 공동 배양 모델은 종양 세포 표현형에 영향을 미치는 급성 림프모구 백혈병 세포와 골수 기질 또는 조골세포를 활용합니다. 이 연구는 화학 요법에 노출되는 동안 백혈병 세포의 생존을 지원하는 골수의 기초가 되는 메커니즘에 대한 조사를 지원할 것입니다.

백혈병 세포와 BMSC의 2D 공동 배양: 백혈병 세포의 하위 집단을 얻는 방법

이 비디오는 3개의 백혈병 세포 하위 집단, 즉 배지에서 자유롭게 떠다니는 부유 백혈병 세포, 중간엽 기질 세포 단층의 표면에 부착된 위상 밝은 백혈병 세포, 2D 공동 배양에서 중간엽 기질 세포 단층 아래로 이동한 위상 희미한 백혈병 세포의 공간 분리 방법을 설명합니다.

Leukemic Subpopulation Harvest: 2D 공동 배양에서 백혈병 세포 하위 집단의 공간적 분리 방법

수용체 티로신 키나아제는 ectopically 많은 암에서 발현되는 급성 백혈병의 치료 표적으로 확인되었습니다. 이 원고는 급성 백혈병의 치료를위한 티로신 키나제 억제제의 전 임상 평가를위한 효율적인 전략을 설명한다.

급성 백혈병의 치료에 대한 티로신 키나제 억제제의 전임상 평가

원발성 다발성 골수종 세포에 대한 고처리량 약물 감수성 분석을 설명합니다. 이는 멀티웰 플레이트에서 골수 미세환경(세포외 기질 및 기질 포함)을 재구성하는 것과 세포 생존율의 종적 정량화를 위한 비침습적 방법으로 구성됩니다.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델을 사용 하 여 백혈병에서 마약 대상으로 c Fos와 Dusp1의 유전과 화학 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 유전 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.

Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

렌티바이러스 shRNA의 풀을 이용한 고처리량 RNA 간섭(RNAi) 스크리닝은 악성종양에서 치료적으로 관련된 합성 치사적 표적을 검출하는 도구가 될 수 있다. 우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 후성 유전 학적 이펙터를 조사하기 위해 풀링 된 shRNA 스크리닝 접근법을 제공합니다.

약물 내성 표현형을 조절하는 인자를 식별하기 위한 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝

이 프로토콜은 유세포 분석을 사용한 약물 반응 평가 지침과 함께 일시적 면역 억제 제브라피시 배아의 세포주 및 신선한 환자 물질에서 인간 급성 림프구 백혈병(ALL) 이종이식편을 생성하고 문제를 해결하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 실험 파이프라인은 고형 종양에도 적용할 수 있습니다.

제브라피시 배아에서 백혈병 세포 이식을 사용한 신속한 생체 내 약물 반응 예측

이 프로토콜은 주사 후 4일 후에 발생하는 환자 유래 B- 및 T- 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 난자 이종이식을 설명합니다.

오보에 위치 환자 유래 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 이종이식 (PDX-ALL)

이 프로토콜은 유도 화학 요법에 대한 반응의 역학을 기반으로 급성 림프구성 백혈병의 재발을 생성하기 위한 마우스 모델을 설명하는 것을 목표로 합니다.

급성 림프구성 백혈병에 대한 유도 화학 요법에 대한 백혈병 재발의 쥐 모델

탐색하세요 골수 기질 세포와 공배양을 이용한 급성 림프모구 백혈병의 화학요법 내성 메커니즘. 이 모델은 내성 세포를 분리 분석하여 새로운 치료 전략을 평가할 수 있는 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

모델링 화학 요법 내성 백혈병

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