Name: 키메라를 구축의 HSV-중재 형질 전환 유전자의 발현은 마우스의 GPCR Heteromers의 행동 기능을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 배우세요 마우스에서 HSV-매개 형질전환을 이용해 GPCR 헤테로머의 행동 기능을 연구하는 방법을. 이 기법은 정신질환 관련 행동의 분자 기전을 밝히는 데 활용됩니다.

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NIH R01MH084894이 연구의 자금 조달에 참여했다. 우리는 박사에게 감사의 말씀을 전합니다. 마우스의 기부금이 작품의 촬영 기간 동안 자신의 수술과 행동 시설의 사용에 대한 의학의 마운트 시나이 학교에서 야스민 허드와 스콧 루소.

참고 : 동물 사육과 염려에 관한 모든 절차는 마운트 시나이 의과 아이칸 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 규정에 따라 실시 하였다. 절차를 통해 멸균 장갑을 사용하십시오. 1. 약물 및 바이러스 준비 <ol><li> 의약품 제조 <ol><li> 12.9 ml의 % 0.9의 식염수 용액에 100 ㎎ / ㎖ 케타민 1.35 ㎖의 20 ㎎ / ㎖ 자일 라진 0.75 ml에 용해하여 15.0 ml의 케타민 / 자일 라진의 마취제를 준비합니다. 철저하게 솔루션을 섞는다. </li></ol></li><li> 바이러스 준비 <ol><li> mGlu2를 복제하고 mGlu2ΔTM4N는 표준 프로토콜 이전 6 설명 따르는 bicistronic 단순 포진 바이러스 (HSV) 벡터로 구성한다. 이전 6,13,14 설명 된대로 바이러스 입자를 패키지로 제공된다. 잔류 교체 알라-677 4.40, mGlu2에서의 Ala-681 4.44 및 Ala685 4.48 Ser686 4.40, 박사에 대한e690 4.44와의 Gly-694 4.48 mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) 이전에 6 설명 하였다. 주 : 이전에 키메라 구조 HA-mGlu2ΔTM4N 그대로 G 단백질에 의존 6 신호와 함께 세포막에서 발현되는 것을 증명했다. </li><li> 에 바이러스 벡터를 저장 -80 ° C ~ 사용하지 않을 때입니다. 다음 해동 바이러스 얼음 벡터, 및 10 ㎕의 분취 량으로 나누어지는. 수술 절차는 얼음에 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 수술 <ol><li> 수술 준비 <ol><li> (1.1.1 참조 자세한 내용은) 마우스를 달아 케타민 / 자일 라진 칵테일의 적절한 투여 량으로 마우스를 주입. </li><li> 제대로 마취 경우, 참조 응답을 유도 할 수 없습니다, 마우스가 제대로 마취 경우, 통증 응답을 발과 꼬리를 짜내 마우스를 선택합니다. </li><li> 가위를 사용하여 코의 선단에 두개골의베이스에서 마우스 면도 헤드. 마우스 AF에 안과 젤을 적용마우스의 실명을 방지하기 위해 terward. </li><li> 정위 프레임에 각 주사기를로드합니다. 그들은 10도 떨어져 정상에서되도록 다음 정위 프레임의 각 암의 수직 부분을 기울이십시오. 바늘이 서로 마주되도록, 팔이 기울어되어 있는지 확인합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 바늘을 작성하여 각 주사기를 청소합니다. 주사기가 깨끗한 지 확인하기 위해 바늘을 적어도 세 번 입력합니다. </li><li> 바늘이 세정 된 후, 이중 증류수 H 2 O로 바늘을 작성하여 바늘 플러시 일단 플러시, 두 번 증류수 H 2 O의 1.3 μl를 각 바늘을 채우기 두 번 증류 H 2 O의 0.3 μl를 해제하기 위해 주사기의 플런저를 트위스트 바늘의 끝에서 물이 구슬은 신중하게 물을 닦아합니다. 아무것도 주사기에서 제공하지 않는 경우, 완전히 플런저를 눌러 다음 주사기의 청소를 반복합니다. </li><li> 물을 충전 한 후, 다음 주사기를 충전 주사기를 올려공기의 0.5 μL. </li><li> 공기와 물이 주사기되면 신중 바이러스 용액 1.3 μL로 주사기를 채우기. 이때 주사기 전량 2.8 μL인지 확인. 다시 바이러스의 0.3 μl를 해제 주사기의 끝을 비틀어. 바늘의 끝에서 액체 구슬, 조심스럽게 액체를 닦아합니다. 아무것도 주사기에서 제공하지 않는 경우, 완전히 플런저를 눌러 다음 주사기의 청소를 반복합니다. </li></ol></li><li> 외과 <ol><li> 두개골 레벨과 평면이되도록 정위 프레임을 조정해야합니다 만드는 정위 프레임에 마우스를 연결합니다. 노출 된 두피에 povodine 요오드 적용합니다. 메스를 사용하여 노광 면도 지역 두개골의 정중선을 따라 시상 절개를 만든다. 그리고 두개골이 노출 남아 있는지 확인하기 위해 절개 부위에 피부에 뷰렛 클램프를 연결합니다. </li><li> 의 봉합을 노출 골막을 멀리 용해 H 2 O 2를 사용하여두개골. 지금 브레 그마 및 봉합이 볼 수 있도록, 두개골 레벨이 있는지 확인하기 위해 정위 프레임을 조정해야합니다. </li><li> 브레 그마와 주사기의 바늘 끝을 맞추고 브레 그마의 좌표를 기록합니다. 바늘이 삽입 될 예정의 좌표를 계산합니다. <ol><li> 주동이-Cauldal (RC)면의 경우, 기록 RC의 브레 그마 좌표 (브레 그마로부터 1.6)에 1.6 mm를 추가합니다. 지느러미 - 복부 (DV)면의 경우, 기록 DV의 브레 그마 좌표 (브레 그마에서 -2.4)에서 2.4 mm를 뺍니다. </li><li> 마지막으로, 내측 측면 (ML)면에 대해 기록 된 ML의 브레 그마 좌표 (브레 그마로부터 2.6)에 2.6 mm를 추가합니다. 이것은 양자 주입입니다 모든 좌표를 들어, 모두 왼쪽과 오른쪽 좌표를 기록해야합니다. </li></ol></li><li> 원하는 좌표에 바늘을 가져옵니다. 바늘이 삽입되어 드릴, 표시된 영역을 드릴 될 것 곳의 장소를 표시합니다. </li><li> 코튼 팁 어플리케이터 위스콘신과초과 혈액이나 뼈 조각을 멀리 퍼가기. </li><li> 바늘의 끝은 뇌의 표면을 터치하는 두개골에 바늘을 가져옵니다. 그런 다음 천천히 저하 원하는 좌표에 바늘을 낮 춥니 다. </li><li> 바늘 원하는 좌표되면 천천히 (총 0.5 μL)에 5 분에 걸쳐 분당 바늘 0.1 μL의 플런저 꼬아 주사기의 내용물을 주입. </li><li> 주입이 완료되면 또 다른 5 분 동안 피질 주사기를 떠난다. </li></ol></li><li> 최대 닫기 / 관리 <ol><li> 꾸준히 천천히 마우스 피질에서 바늘을 제거합니다. 그런 다음 정위 프레임에서 마우스를 제거합니다. </li><li> 집게는 피부의 플랩을 잡고 함께 배치와 다음 절개 부위에서 피부의 기본 플랩에 시아 노 아크릴 레이트 (피부 접착제)를 적용합니다. </li><li> 시아 노 아크릴 레이트가 건조하도록 허용합니다. 가열 패드가 surg 경우 선택 사항입니다 (가열 패드에 케이지에서 마우스를 놓습니다iCal의 스위트 룸은 37 ° C의 RT에서 유지 - 그렇지 않으면 필요가 없습니다). 침구는 수술 부위에 부착하지 않도록하기 위해 종이 타월에 마우스를 배치해야합니다. </li><li> 수술 후 60 분 - 수술의 길이에 따라 마우스 (30) 내 마취 상태임을 보장한다. 수술 후, 동물은 자신의 새장에 배치하고 복구 할 수있는 그 방에 반환하기 전에 의식이 될 때까지 모니터링된다. 이들은 뇌 생화학 적 경로의 일부를 변경하여 실험 한 결과를 변경할 수 없기 때문에 진통제, 수술 후 사용되지 않는다. 그러나 그들은 수술 당일 마취에서 회복 될 때까지 동물을 모니터링하고, 감염과 통증 / 고통의 평가의 징후 일 후 작업. </li></ol></li></ol> 3. 머리 트 위치 응답 실험 <ol><li> 설정 <ol><li> 삼일 stereota 후 - 2 오전 10시 2:00 PM, 사이의 모든 행동 시험을 수행바이러스 입자의 CTIC 주입입니다. </li><li> 디졸브 (±) -1- (2,5- 디메 톡시 -4- 요오도 페닐) 2.0 ㎎ / ㎏에 0.9 % 생리 식염수로 -2- 아미노 프로판 염산염 (DOI). 또한 0.9 % 식염수 용액을 제조 하였다. </li><li> 어떤 침구 않고 홈 케이지 (28 X 18 X 15cm)를 준비하여 비디오 카메라의 뷰 바로 위에 홈 케이지되도록 트라이 포드를 사용하여 카메라를 조정한다. </li><li> 실험을 시작하기 전에 적어도 4 시간 동안 방에 생쥐 길들. </li><li> 헤드 트를 기록하는 캠코더를 설정합니다. </li></ol></li><li> 실험 <ol><li> 이 홈 케이지 바로 위에 오도록 카메라를 배치합니다. 전체 홈 케이지 시야에 있도록 카메라 보정. </li><li> 마우스를 달아 0.9 % 식염수 또는 DOI 하나의 적절한 투여 량 (0.01 ㎖ / g)를 복강 마우스를 주입. 주 : 마우스 25g 무게 경우 0.25 ml의 총 부피로 투여 량을 투여. </li><li> FO 자신의 홈 케이지 다시 각 마우스를 놓습니다R 10 분. 빈 홈 케이지의 중심으로 10 분, 대신 마우스 후 카메라의 시야 내에 맹점이 없는지 확인. 캠코더를 눌러 기록. 방을 둡니다. 참고 : 마우스 움직임과 그 안에 다양한 행동 반응 (... 머리 트, 귀 스크래치 등이 DOI에 의해 유도 된 행동 반응의 전체 목록의 곤잘레스 - Maeso 등 2,007 보충 데이터 표 1을 참조하십시오) 3, 기록한다 30 분. 따라서, 기록 시야에는 사각이없는 것이 중요하다. </li><li> 30 분은 원래의 홈 케이지에 다시 캠코더 및 장소 마우스 녹화를 중지 한 후. 각 마우스에 대해이 과정을 반복합니다. </li></ol></li><li> 리뷰 <ol><li> 테이프 마우스의 실험 조건에 장님 각 심판 검토가) (예., 머리 동안 사용 된 약물은 실험 또는 두개 내 주입시 사용되는 바이러스를 트). 수동으로 모든 머리를 통해 서 트 기록심 비디오. 참고 : 머리 트가 마우스 (부가 영상)에 의해 수행 빠른 흔들림의 머리의 움직임으로 정의된다. </li><li> 각 마우스의 경우, 블라인드 심판의 세 합계에서 최종 HTR 응답을 평균. 그런 그룹이 실험 조건에 의한 값 및 통계 분석 (예., t-테스트 또는 ANOVA)을 실시합니다. </li></ol></li></ol>

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함께 mGlu2-KO 마우스 (5) 이전의 결과와 함께 배양 된 세포에서의 5-HT 2A의 -mGlu2 수용체 복합체를 형성하지 않는 mGlu2 및 mGlu2 / mGlu3 키메라 구조와 결과가 제안하는 5-HT의 2A -mGlu2에서 이종 체 수용체 복합체 마우스 전두엽 피질 LSD 같은 환각 5-HT 2A 수용체 작용제에 의해 헤드 트 동작을 유도하는데 필요하다. 이 방법의 한계는 기본 조직의 세포 내 수준에 가까운 분자 근접을 측정하지 않습니다. 또한, 주목해야 다양한 한계점이있다. 주 사후 4 일 - 생쥐는 HSV 바이러스 벡터를 주입하기 때문에, 실험이 수행 될 수있는 시간 프레임 (2)이다. 바이러스 벡터의 위치와 표현은 더 이상 4 일 이내 초기 주입 후 단면 한 뇌의 면역 형광 염색 확인해야합니다. 마우스되는 좌표가 일치하지 않거나 바이러스 벡터를 표현한다하지그들은 mGlu2 또는 mGlu2ΔTM4N을 표현하지 않는 실험 데이터에서 제...

이러한 LSD, 실로시 빈과 메스와 같은 환각제는 인간의 의식,인지와 감정 7-9에 상당한 변화를 일으킬. 유전 또는 약리학 중 접근 방식에 의해 세로토닌 5-HT 2A 수용체 신호의 불 활성화는 크게 두 설치류 모델 3,10에서 환각제에 대한 행동 반응을 감쇠 11을 인간 원인. 환각제 다른 수용체 아형 8 바인딩 있지만, 5-HT의 2A 수용체는 이러한 화학 물질의 고유 한 행동 활동에 필요로 간주됩니다. 그룹 II 대사성 글루타메이트 수용체 (예., mGlu2 및 mGlu3)는 환각제의 분자 메커니즘과 정신병 (12)의 기초가 자신의 필수적인 역할에 대해 상당한 관심의 대상이되고있다. 이전에는 mGlu2 단백질 (mGlu2-KO 마우스)없이 식을 마우스 복도의 셀룰러 및 행동 효과에 영향을받지 것으로 입증되었다lucinogens 5. 또한, 5-HT (2a)와 mGlu2 수용체와 세로토닌 글루타메이트 리간드 1,2- 살아있는 세포에서 G 단백질 커플 링 패턴을 변조되는 특정 이종 복합체를 형성하는 것이 제안되었다. 구조적으로, 횡단 (TM) 영역 (4) 및 mGlu2 5는 5-HT의 2A 수용체 (5)과 이종 체 형성에 중요한 역할을한다. 또한, 추가 조사는 mGlu2의 TM4의 세포 내 끝에있는 세 가지 잔류 물이 세포 6 살아있는에서 5-HT (2A)의 -mGlu2 수용체 헤테로을 형성 할 필요가 있음을 보여 주었다. 이종 발현 시스템에서 관찰 이러한 연구 결과를 바탕으로, 우리가 있는지 여부를 테스트하기 위해 야생 형 mGlu2 및 mGlu2-KO 마우스의 전두엽 피질에서 mGlu2 / mGlu3 키메라 구조의 HSV-매개 표현의 사용을 설명하는 5-HT (2A) 사이의 이종 형성 및 mGlu2가 필요하다환각 5-HT 2A 수용체 작용제에 의해 유도 머리 트 행동.

<table><tbody><tr><td>mGlu2 bicitronic 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 및 mGlu2DTM4N을 CMV 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 bicistronic HSV-GFP 바이러스 벡터 p1005+ HSV에 subclone하였다. 바이러스 입자는 MIT (McGovern Institute)의 Viral Core Facility에서 생산되었습니다. 자세한 내용은 이사인 Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>mGlu2&Delta에게 문의하십시오. TM4N 바이시트로닉 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 및 mGlu2DTM4N을 CMV 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 bicistronic HSV-GFP 바이러스 벡터 p1005+ HSV에 subclone하였다. 바이러스 입자는 MIT (McGovern Institute)의 Viral Core Facility에서 생산되었습니다. 자세한 내용은 디렉터인 Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>GFP bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 및 mGlu2DTM4N을 CMV 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 bicistronic HSV-GFP 바이러스 벡터 p1005+ HSV에 subclone하였다. 바이러스 입자는 MIT (McGovern Institute)의 Viral Core Facility에서 생산되었습니다. 자세한 내용은 이사인 Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp;</td>에게 문의하십시오.<td>Lloyd</td><td>List no. 4811-20ml, NADA #139-236, NDC 코드: 61311-481-10</td><td>1.35 ml의 케타민 (100 mg/ml) + 0.75 ml의 자일라진 (20 mg/ml)을 0.9% 식염수 케타민 12.0 ml에 희석;</td></tr><tr><td></td><td>Vedco</td><td>KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC 코드: 50989-161-06</td><td>케타민 1.35ml(100mg/ml) + 자일라진 0.75ml(20mg/ml) 12.0ml에 희석 0.9% 식염수 안</td></tr><tr><td>과 젤</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0550805</td><td></td></tr><tr><td>Burret 클립</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9268369</td><td></td></tr><tr><td>Feather 수술용 칼날</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9032736</td><td></td></tr><tr><td>수소 과산화물</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>19-898-919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14815203</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&trade; 스몰 허브 탈착식 바늘 (33 Ga)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14816206</td><td></td></tr><tr><td>무선 마이크로 드릴</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9089241</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond 피부 접착제</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0690470</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-1-(2,5-디메톡시-4-요오도페닐)-2-아미노프로판 염산염(DOI)</td><td>시그마-알드리치</td><td>42203-78-1</td><td>0.9% 식염수에 2.0mg/kg의 농도로 용해</td></tr></tbody></table>

키메라를 구축의 hsv-중재 형질 전환 유전자의 발현은 마우스의 gpcr heteromers의 행동 기능을 연구하는

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

5-HT2A와 mGlu2 사이의 이질체 수용체 복합체는 정신병1,2의 마우스 모델에서 일부 행동 표현형과 관련이 있습니다. 결과적으로, 조현병 관련 행동에 영향을 미치는 5-HT2A와 mGlu2 사이의 상호 작용에 대한 구조적 세부 사항을 조사하는 것은 강력한 번역 도구입니다. 앞서 살펴본 바와 같이, 마우스의 머리 경련 반응(HTR)은 환각제에 의해 유발되며 이러한 행동 반응은 5-HT2A 녹아웃(KO) 마우스에는 없습니다3,4. 또한, 5-HT2A 수용체를 피질에서만 조건부로 발현시킴으로써, 피질 피라미드 뉴런의 5-HT2A 수용체 의존성 신호전달 경로가 환각제에 대한 반응으로 머리 경련 행동을 유도하기에 충분하다는 것이 입증되었다3. 마지막으로, 환각제인 DOI와 리세르그산 디에틸아미드(lysergic acid diethylamide, LSD)에 의해 유발된 머리 경련 행동 반응이 mGlu2-KO 마우스에서 현저히 감소하는 것으로 나타났습니다5. 이러한 발견은 mGlu2가 LSD 유사 약물에 의해 유발되는 5-HT2A 수용체 의존성 정신병과 같은 행동 효과에 적어도 부분적으로 필요하다는 것을 시사합니다. 그러나 이것은 5-HT 2A-mGlu2 수용체 복합체가 이러한 행동 표현형에 필요한지 여부에 대한 증거를 제공하지 않습니다. 이 질문에 답하기 위해 mGlu2-KO 마우스의 전두엽 피질에서 mGlu2 또는 mGlu2ΔTM4N(5-HT2A-mGlu2 수용체 복합체를 형성하지 않는 mGlu2/mGlu3 키메라 구조체)을 발현하는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 구조체를 사용하여 이 GPCR 이질체 복합체가 LSD 유사 약물에 의해 유도된 행동 효과에 필요한지 여부를 조사했습니다6.

이전의 결과는 환각제 의해 확실하고 견고하게 유도되는 쥐의 행동 반응을 헤드 트 위치 함을 입증하고, 5-HT 2A -KO 마우스 3 부재. 또한, DOI 및 LSD 환각 5-HT 2A의 작용제에 의해 유발 헤드 트 반응이 크게 mGlu2-KO 마우스 5 감소되었음을 보였다. 그러나, 비록 이전의 연구 결과는 설득력 미해결 남아 살아있는 생쥐의 등이 구조적 배열의 동작 여부를 5-HT 2a 및 mGlu2가, 형질 감염된 세포 1,2,15 시험 관내에서 이종 복합체로 조립되어 있음을 보여줍니다. 완전히 본 manip 여부를 검사 mGlu2-KO 마우스의 전두엽 피질 mGlu2 또는 mGlu2ΔTM4N 하나의 환각 5-HT 2A 수용체 작용제, 식에 의해 유도 된 정신 같은 효과, 5-HT 2A의 -m...

이 문서는 GPCR 이종 형성을 요구하는 행동 분석을 테스트 할 마우스 정면 피질로 바이러스 벡터를 주입하는 방법을 설명합니다.

키메라를 구축의 HSV-중재 형질 전환 유전자의 발현은 마우스의 GPCR Heteromers의 행동 기능을 연구하는

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

이 방법의 전반적인 목표는 마우스 모델에서 바이러스 매개 유전자 전달이 G 단백질 결합 수용체의 이종 이량체화가 필요한 행동 표현형에 어떤 영향을 미치는지 관찰하는 것입니다. 이 방법은 신경 및 정신 약리학 분야의 핵심 질문, 특히 G 단백질 결합 수용체가 분자 수준에서 서로 어떻게 상호작용하는지에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법을 통해 조현병 및 우울증과 같은 정신 질환 모델에서 이러한 상호작용이 행동에 어떤 영향을 미치는지 이해할 수 있습니다. 본 실험에서는 특히 세로토닌 2a 및 대사성 글루타메이트 수용체 2를 살펴볼 예정이며, 이 두 수용체 모두 조현병 환자 치료에 사용되는 약물의 작용 기전에 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 승인된 방법에 따라 마우스에 적절히 마취를 실시하며 시작하십시오.발가락 꼬집기(toe pinch)를 수행하여 반응이 없는 것을 확인함으로써 수술 가능 수준의 마취 상태가 되었는지 확인하십시오. 그런 다음 안구 보호를 위해 안과용 젤을 도포하십시오. 마우스의 머리 기울기를 조절하여 두개골이 수평이고 평평하게 위치하도록 한 뒤, 정위 고정 장치(stereotactic frame)에 고정하십시오.노출된 두피에 포비돈 요오드를 도포합니다. 메스를 사용하여 삭모된 노출 부위 내의 두개골 정중선을 따라 시상 절개를 실시합니다. 그 후 절개 부위의 피부에 pureit 클램프를 부착하여 두개골이 계속 노출된 상태를 유지하도록 합니다.과산화수소를 도포하여 골막을 녹여내고 두개골의 봉합선을 노출시킵니다. 브레그마(bregma)와 봉합선이 보이면, 두개골이 수평이 되도록 정위 고정틀을 조정하십시오. 주사기의 바늘 끝을 브레그마에 맞추고 브레그마의 좌표를 기록합니다.전두엽 피질에 양측성으로 주입하려면, 기록된 Bregma 기준 전후(rostral caudal) 좌표에 1.6 mm를 더하고, 내외(medial lateral) 좌표에 2.6 mm를 더합니다. 두개골에 주입 부위를 표시한 후, 해당 부위에 작은 구멍을 뚫습니다. 면봉을 사용하여 과도한 혈액이나 뼈 파편을 닦아냅니다.바늘을 뇌 표면까지 가져온 후, 배측-복측 좌표(dorsal ventral coordinate)의 깊이까지 내립니다. 그다음 바늘의 플런저를 돌려 분당 0.1 µL씩 5분 동안 천천히 주입하여 총 0.5 µL를 주입합니다. 주입 후 시린지를 5분 동안 그대로 둡니다.지정된 시간이 지나면 동물을 정위 고정 장치에서 분리하고, 절개 부위를 봉합한 후 가온 패드 위에 둡니다. 승인된 동물 실험 프로토콜에 따라 수술 후 진통제를 투여하십시오. 바이러스 입자의 정위 주입 2~3일 후에 행동 테스트를 수행하십시오.실험 시작 전 최소 4시간 동안 마우스를 해당 실내 환경에 적응시킵니다. 먼저 DOI를 0.9% 식염수에 녹여 2 mg/kg 농도로 조제합니다. 베딩이 없는 홈 케이지를 준비하고, 삼각대를 사용하여 카메라가 홈 케이지 바로 위에 위치하도록 조정합니다.홈 케이지 전체가 시야에 들어오도록 카메라를 보정하십시오. 마우스의 무게를 측정하고, 0.9% 생리식염수 또는 DOI를 적절한 용량으로 복강 내 주사하십시오. 마우스를 다시 홈 케이지에 넣고 10분 동안 둡니다.10분 후에 마우스를 빈 홈 케이지 중앙에 배치하고, 카메라의 시야각에 사각지대가 없는지 확인하십시오. 캠코더의 녹화 버튼을 누르고 방을 나갑니다. 30분 후, 녹화를 중단하고 마우스를 원래의 홈 케이지로 다시 옮깁니다.다음 마우스에 대해 행동 테스트를 반복합니다. 심사위원이 실험 조건을 모르는 맹검 상태에서 비디오를 검토하도록 합니다. 비디오 전반에 걸쳐 모든 머리 떨림(head twitch)을 수동으로 기록합니다.머리 떨림(head twitch)은 마우스가 수행하는 빠른 머리 흔들기 동작으로 정의됩니다. 프로토콜의 서술된 부분에 기술된 대로 데이터를 처리하십시오. 여기 제시된 이미지는 전두엽 피질에서 HSV 매개 트랜스지 네 발현의 대표적인 예시입니다.HSV mGlu2 GFP를 전두엽 피질에 주입하였으며, 면역세포화학 염색을 통해 GFP 발현을 확인하였습니다. 이 스케일 바는 200 microns를 나타냅니다. 이 이미지는 mGlu2 녹아웃 마우스의 전두엽 피질에서 HSV 매개 트랜스진 발현 및 anti-mGlu2 반응성을 보여주는 웨스턴 블롯 결과입니다.여기서는 단량체로서의 mGlu2 면역반응성을 측정하였습니다. 이 히스토그램은 mGlu2 녹아웃 마우스의 전두엽 피질에서 mGlu2의 바이러스 매개 발현은 환각성 세로토닌 2a 수용체 작용제인 DOI에 의해 유도된 머리 떨림 반응을 유의미하게 회복시키지만, 키메라 mGlu2는 그렇지 않음을 보여줍니다. 이 실험에서 가장 중요한 단계는 바이러스 주입, 머리 떨림 반응 측정, 그리고 마우스 희생 사이의 타이밍입니다.어떠한 지연이라도 실험 결과에 영향을 주거나 데이터에 모호함을 유발할 수 있습니다. 숙련된 경우, 바이러스 주입을 위한 마우스 수술은 약 30분이 소요됩니다. 머리 떨림(head twitch) 실험 또한 마우스 한 마리당 약 35분이 소요됩니다.여러 마리의 마우스를 시차를 두고 수술하거나, 한 번에 여러 마리를 수술하는 것이 권장됩니다. 이렇게 하면 바이러스 구조체의 발현이 정점에 이르는 수술 후 3~4일 이내에 머리 떨림 실험을 수행할 수 있도록 일정을 유지할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

이진 유전 전략을 활용하여 Cre 매개 재조합 후 상보적 시냅스 경진 추적자를 발현하는 마우스의 신경 회로 추적을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세포 특이적 추적자 생산은 유전적으로 암호화되기 때문에 당사의 실험적 접근 방식은 단일 세포 해상도에서 쥐 배아 뇌 발달 중 신경 회로의 형성 및 성숙을 연구하는 데 적합합니다.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

장 신경계는 장에서 증식하고 이동하고 군체화하는 신경능선세포에 의해 형성됩니다. 신경능선세포(neural crest cell)는 신경전달물질 표현형에 특이적인 마커를 가진 뉴런으로 분화합니다. 이 프로토콜은 장 신경계 신경전달물질 발현을 시각화하기 위해 쥐 배아 위장관을 해부, 고정 및 면역 염색하는 기술을 설명합니다.

쥐 장내 신경 시스템 개발을 시각화하는 면역 염색

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

단일 셀 쌍 인간의 TCR 알파와 베타 체인 시퀀싱과 현재 프로토콜 결합 유선형 retroviral 벡터 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 식와 호환의 세대.

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

Intraspinal 주입 recombinase 종속 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV)의 척수에서 모든 유전자 이라는 셀 형식을 조작 하 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 transduce 요 추 척수의 등 쪽 뿔에 신경 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조작된 신경 하위의 기능 심문 수 있습니다.

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

Cas9 형질전환 마우스의 일차 T 세포로 가이드 RNA를 레트로바이러스 형질전환하기 위한 프로토콜을 제시하여 Th17 분화 연구에서 유전자 편집을 위한 효율적인 대안을 제공합니다.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

우리는 수용체 매개 장기 및 미세환경 특이적 림프구 위치를 연구하기 위해 트래픽 수용체의 레트로바이러스 전달과 경쟁적 귀환을 위한 개선된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 면역 세포 이동 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며 향후 기초 및 치료 연구에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

다양한 조직 미세환경에서 GPCR 매개 T 세포 국소화 연구를 위한 효율적인 레트로바이러스 형질도입 및 경쟁력 있는 호밍(Competitive Homing)

배우세요 마우스에서 HSV-매개 형질전환을 이용해 GPCR 헤테로머의 행동 기능을 연구하는 방법을. 이 기법은 정신질환 관련 행동의 분자 기전을 밝히는 데 활용됩니다.

키메라를 구축의 HSV-중재 형질 전환 유전자의 발현은 마우스의 GPCR Heteromers의 행동 기능을 연구하는

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