키메라를 구축의 HSV-중재 형질 전환 유전자의 발현은 마우스의 GPCR Heteromers의 행동 기능을 연구하는

이 방법의 전반적인 목표는 바이러스 매개 유전자 전달이 마우스 모델에서 G-단백질 결합 수용체의 이종이합체화(heterodimerization)가 필요한 행동 표현형에 어떤 영향을 미치는지 관찰하는 것입니다. 이 방법은 신경 및 정신 약리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히 g 단백질 결합 수용체가 분자 수준에서 서로 상호 작용하는 방식.

이 방법을 사용함으로써 우리는 이러한 상호 작용이 정신 분열증 및 우울증과 같은 정신 장애 모델에서 행동에 어떤 영향을 미치는지 이해할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 세라토닌 2a와 대사성 글루타메이트 수용체 2를 구체적으로 살펴볼 것이며, 둘 다 정신 분열증 환자를 치료하는 데 사용되는 약물의 작용 메커니즘과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 승인된 방법에 따라 마우스를 적절하게 마취하는 것으로 시작하십시오.

발가락 꼬집기를 수행하고 반응이 없음을 기록하여 수술 평면의 마취가 이루어졌는지 확인합니다. 그런 다음 눈을 보호하기 위해 안과 젤을 바르십시오. 마우스를 정위 프레임에 부착하고 두개골이 평평하고 평평하도록 머리의 기울기를 조정해야 합니다.

노출된 두피에 포비돈 요오드를 바릅니다. 메스를 사용하여 노출된 면도 부위 내의 두개골 정중선을 따라 시상 절개를 만듭니다. 그런 다음 절개 부위의 피부에 pureit 클램프를 부착하여 두개골이 노출된 상태로 유지

과산화수소를 바르면 골막이 녹고 두개골의 봉합사가 노출됩니다. 이제 브레그마와 봉합사가 보였으므로 두개골이 수평이 되도록 정위 프레임을 조정해야 합니다. 주사기의 바늘 끝을 브레그마에 맞추고 브레그마의 좌표를 기록합니다.

전두엽 피질을 양측으로 주입하려면 기록된 상부 꼬리 브레그마 좌표에 1.6mm를 추가하고 기록된 내측 외측 브레그마 좌표에 2.6mm를 추가합니다. 두개골에 주입 부위를 표시한 다음 주입 부위에 작은 구멍을 뚫습니다. 화장솜 팁 어플리케이터로 여분의 혈액이나 뼈 조각을 닦아냅니다.

바늘을 뇌 표면으로 가져오고 등쪽 복부 좌표의 깊이까지 낮춥니다. 그런 다음 바늘의 플런저를 비틀어 주사기의 내용물을 천천히 주입하여 5분 동안 분당 0.1마이크로리터를 투여하고 0.5마이크로리터 주입합니다. 주사기를 5분 동안 제자리에 두십시오.

할당된 시간이 지나면 동물을 입체택시에서 제거하고 절개 부위를 봉합한 다음 보온 패드에 놓습니다. 승인된 동물 프로토콜에 따라 수술 후 진통제를 투여합니다. 바이러스 입자의 정위 주입 후 2-3일 후에 행동 테스트를 수행합니다.

실험을 시작하기 최소 4시간 전에 쥐를 방에 습관화합니다. DOI를 킬로그램당 2mg의 0.9% 식염수 용액에 용해시키는 것으로 시작합니다. 침구가 없는 가정용 케이지를 준비하고 삼각대를 사용하여 홈 케이지 바로 위에 오도록 카메라를 조정합니다.

전체 홈 케이지가 시야에 있도록 카메라를 보정합니다. 마우스의 무게를 측정하고 적절한 용량의 0.9% 식염수 또는 DOI를 복강내로 주입합니다. 마우스를 10분 동안 가정용 케이지에 다시 넣습니다.

10분 후 빈 가정용 케이지 중앙에 마우스를 놓고 카메라 시야에 사각 지대가 없는지 확인합니다. 캠코더에서 녹화를 누르고 방을 나갑니다. 30분 후 녹음을 중지하고 마우스를 원래 홈 케이지에 다시 넣습니다.

다음 마우스에서 동작 테스트를 반복합니다. 심판이 실험 조건을 알지 못하는 상태에서 비디오를 검토하도록 합니다. 비디오 전체에서 모든 머리 경련을 수동으로 기록합니다.

머리 경련은 마우스가 머리를 빠르게 흔드는 움직임으로 정의됩니다. 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 데이터를 처리합니다. 여기에 보이는 것은 전두엽 피질에서 HSV 매개 전이유전자 발현의 대표적인 이미지입니다.

HSV mGlu2 GFP를 전두엽 피질에 주입하고 GFP 발현을 면역세포화학에 의해 밝혔습니다. 이 축척 막대는 200미크론을 나타냅니다. 이 이미지는 mGlu2 녹아웃 마우스의 전두엽 피질에서 HSV 매개 전이유전자 발현과 항-mGlu2 반응성의 서쪽 얼룩을 보여줍니다.

여기서 우리는 단량체로서 mGlu2의 면역 활성을 측정했습니다. 이 히스토그램은 mGlu2 녹아웃 마우스의 전두엽 피질에서 키메라 mGlu2가 아닌 mGlu2의 바이러스 매개 발현이 환각성 세라토닌 2a 수용체 작용제 DOI에 의해 유도된 머리 경련 반응을 유의하게 구한다는 것을 보여줍니다. 이 실험에서 가장 중요한 단계는 바이러스 주사 사이의 타이밍, 머리 경련 반응 및 쥐가 희생되는 시점입니다.

지연이 발생하면 실험 결과가 변경되거나 데이터에 모호성이 생길 수 있습니다. 일단 숙달되면 마우스 수술은 바이러스를 주입하는 데 약 30분이 걸립니다. 머리 경련 실험도 쥐 한 마리당 약 35분이 소요됩니다.

시차를 두고 수술하거나 한 번에 두 개 이상의 마우스로 수술하는 것이 좋습니다. 이러한 방식으로 수술 후 3-4일 이내에 머리 경련 실험을 수행할 수 있는 타임라인을 유지할 수 있으며, 이는 바이러스 구조의 최대 발현 시간입니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.