키메라를 구축의 HSV-중재 형질 전환 유전자의 발현은 마우스의 GPCR Heteromers의 행동 기능을 연구하는

이 방법의 전반적인 목표는 마우스 모델에서 바이러스 매개 유전자 전달이 G 단백질 결합 수용체의 이종 이량체화가 필요한 행동 표현형에 어떤 영향을 미치는지 관찰하는 것입니다. 이 방법은 신경 및 정신 약리학 분야의 핵심 질문, 특히 G 단백질 결합 수용체가 분자 수준에서 서로 어떻게 상호작용하는지에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법을 통해 조현병 및 우울증과 같은 정신 질환 모델에서 이러한 상호작용이 행동에 어떤 영향을 미치는지 이해할 수 있습니다. 본 실험에서는 특히 세로토닌 2a 및 대사성 글루타메이트 수용체 2를 살펴볼 예정이며, 이 두 수용체 모두 조현병 환자 치료에 사용되는 약물의 작용 기전에 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 승인된 방법에 따라 마우스에 적절히 마취를 실시하며 시작하십시오.

발가락 꼬집기(toe pinch)를 수행하여 반응이 없는 것을 확인함으로써 수술 가능 수준의 마취 상태가 되었는지 확인하십시오. 그런 다음 안구 보호를 위해 안과용 젤을 도포하십시오. 마우스의 머리 기울기를 조절하여 두개골이 수평이고 평평하게 위치하도록 한 뒤, 정위 고정 장치(stereotactic frame)에 고정하십시오.

노출된 두피에 포비돈 요오드를 도포합니다. 메스를 사용하여 삭모된 노출 부위 내의 두개골 정중선을 따라 시상 절개를 실시합니다. 그 후 절개 부위의 피부에 pureit 클램프를 부착하여 두개골이 계속 노출된 상태를 유지하도록 합니다.

과산화수소를 도포하여 골막을 녹여내고 두개골의 봉합선을 노출시킵니다. 브레그마(bregma)와 봉합선이 보이면, 두개골이 수평이 되도록 정위 고정틀을 조정하십시오. 주사기의 바늘 끝을 브레그마에 맞추고 브레그마의 좌표를 기록합니다.

전두엽 피질에 양측성으로 주입하려면, 기록된 Bregma 기준 전후(rostral caudal) 좌표에 1.6 mm를 더하고, 내외(medial lateral) 좌표에 2.6 mm를 더합니다. 두개골에 주입 부위를 표시한 후, 해당 부위에 작은 구멍을 뚫습니다. 면봉을 사용하여 과도한 혈액이나 뼈 파편을 닦아냅니다.

바늘을 뇌 표면까지 가져온 후, 배측-복측 좌표(dorsal ventral coordinate)의 깊이까지 내립니다. 그다음 바늘의 플런저를 돌려 분당 0.1 µL씩 5분 동안 천천히 주입하여 총 0.5 µL를 주입합니다. 주입 후 시린지를 5분 동안 그대로 둡니다.

지정된 시간이 지나면 동물을 정위 고정 장치에서 분리하고, 절개 부위를 봉합한 후 가온 패드 위에 둡니다. 승인된 동물 실험 프로토콜에 따라 수술 후 진통제를 투여하십시오. 바이러스 입자의 정위 주입 2~3일 후에 행동 테스트를 수행하십시오.

실험 시작 전 최소 4시간 동안 마우스를 해당 실내 환경에 적응시킵니다. 먼저 DOI를 0.9% 식염수에 녹여 2 mg/kg 농도로 조제합니다. 베딩이 없는 홈 케이지를 준비하고, 삼각대를 사용하여 카메라가 홈 케이지 바로 위에 위치하도록 조정합니다.

홈 케이지 전체가 시야에 들어오도록 카메라를 보정하십시오. 마우스의 무게를 측정하고, 0.9% 생리식염수 또는 DOI를 적절한 용량으로 복강 내 주사하십시오. 마우스를 다시 홈 케이지에 넣고 10분 동안 둡니다.

10분 후에 마우스를 빈 홈 케이지 중앙에 배치하고, 카메라의 시야각에 사각지대가 없는지 확인하십시오. 캠코더의 녹화 버튼을 누르고 방을 나갑니다. 30분 후, 녹화를 중단하고 마우스를 원래의 홈 케이지로 다시 옮깁니다.

다음 마우스에 대해 행동 테스트를 반복합니다. 심사위원이 실험 조건을 모르는 맹검 상태에서 비디오를 검토하도록 합니다. 비디오 전반에 걸쳐 모든 머리 떨림(head twitch)을 수동으로 기록합니다.

머리 떨림(head twitch)은 마우스가 수행하는 빠른 머리 흔들기 동작으로 정의됩니다. 프로토콜의 서술된 부분에 기술된 대로 데이터를 처리하십시오. 여기 제시된 이미지는 전두엽 피질에서 HSV 매개 트랜스지 네 발현의 대표적인 예시입니다.

HSV mGlu2 GFP를 전두엽 피질에 주입하였으며, 면역세포화학 염색을 통해 GFP 발현을 확인하였습니다. 이 스케일 바는 200 microns를 나타냅니다. 이 이미지는 mGlu2 녹아웃 마우스의 전두엽 피질에서 HSV 매개 트랜스진 발현 및 anti-mGlu2 반응성을 보여주는 웨스턴 블롯 결과입니다.

여기서는 단량체로서의 mGlu2 면역반응성을 측정하였습니다. 이 히스토그램은 mGlu2 녹아웃 마우스의 전두엽 피질에서 mGlu2의 바이러스 매개 발현은 환각성 세로토닌 2a 수용체 작용제인 DOI에 의해 유도된 머리 떨림 반응을 유의미하게 회복시키지만, 키메라 mGlu2는 그렇지 않음을 보여줍니다. 이 실험에서 가장 중요한 단계는 바이러스 주입, 머리 떨림 반응 측정, 그리고 마우스 희생 사이의 타이밍입니다.

어떠한 지연이라도 실험 결과에 영향을 주거나 데이터에 모호함을 유발할 수 있습니다. 숙련된 경우, 바이러스 주입을 위한 마우스 수술은 약 30분이 소요됩니다. 머리 떨림(head twitch) 실험 또한 마우스 한 마리당 약 35분이 소요됩니다.

여러 마리의 마우스를 시차를 두고 수술하거나, 한 번에 여러 마리를 수술하는 것이 권장됩니다. 이렇게 하면 바이러스 구조체의 발현이 정점에 이르는 수술 후 3~4일 이내에 머리 떨림 실험을 수행할 수 있도록 일정을 유지할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.