Name: 결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: 배우세요 SNARE 매개 엑소시토시스를 이용한 축삭 분기 메커니즘 연구 방법을. 생체 영상과 생화학 분석을 결합하여 신경 발달 과정에서 소포 융합의 시공간 역할을 정량적으로 관찰할 수 있습니다.

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RO1 - GM108970 (SLG)와 F31-NS087837 (CW) :이 작품은 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

연구 윤리의 진술 : 여기에 설명 된 동물을 포함한 모든 실험은 규칙과 동물 관리에 UNC위원회의 규정과 관리 및 실험 동물의 사용을위한 NIH 기준이 적용됩니다. 1. 준비 및 해리 두피 뉴런의 도금 <ol><li> CO에 의해 자궁 경부 전위 다음 2 흡입을 초과 임신 여성을 안락사. 각 반구에서 배아 일 15.5 (E15.5) 마우스 및 microdissect 피질의 두개골에서 전체 뇌를 제거합니다. Viesselmann 등의 알 (8)를 참조하십시오 배아 마우스 피질의 미세 절제에 관한 자세한 지침. </li><li> 멸균 1.6 ml의 마이크로 튜브에 해부 미디어 1 ㎖에는 4 개 이상의 피질을 배치합니다. 10 배 트립신의 120 μl를 추가하고 관 3 반전 - 혼합 5 회. </li><li> 혈구를 사용하여, 세포는 세포 배양 접시를 시드 계산합니다. 주 : 1 피질 반구가 제공하는 approximately 삼백만 세포. <ol><li> SDS 방지 SNARE 복잡한 생화학 분석의 경우, 35mm 접시 당 육백만 세포를 판과 상태에 따라 두 가지 요리를 이용한다. 주 :이 여러 조건을 비교하면 6 웰 플레이트를 사용함으로써 단순화된다. </li><li> 분지 분석 들어 질산 접시 뉴런 150,000의 밀도로 축삭 분지 판 DIC 이미징, 35mm 접시 당 250,000 세포의 밀도로 순환 된 커버 세척 하였다. 이 밀도는 인구 과잉을 방지하고 분석을 단순화합니다. </li></ol></li><li> 라이브 셀 TIRF 현미경의 경우, 실온에서 nucleofection 솔루션에 형질 전환 당 이백 만 신경을 재현 탁. <ol><li> 제조 업체 프로토콜 (9)에 따라 nucleofector와 VAMP2 - pHlourin 발현 플라스미드 및 electroporate 10 μg의 포함 된 마이크로 튜브에 세포 현탁액 100 μl를 추가합니다. </li><li> 형질 즉시 트립신 담금질 매체의 500 μl를 추가 한 후, 서재에서 큐벳 및 플레이트 세포 현탁액을 제거35mm PDL 코팅 유리 바닥 접시 당 400,000 세포의 SITY. </li></ol></li><li> 플레이트 혈청이없는 배지 2 ㎖의 모든 대뇌 피질의 뉴런. </li></ol> 2. SNARE 복합체 형성의 분석 참고 : SDS 방지 SNARE 복합체 처리 원래 아래에 자세히 설명 수정과 (10)를 기술 된 바와 같이 분석 하였다. 여기에 사용 된 것과 검증 된 대안 항체를 들어, 자료 섹션을 참조하십시오. <ol><li> 이전의 용해에 1 시간 동안 250 NG / ㎖ netrin-1 또는 가짜 제어 시험 관내 (DIV)에 E15.5 대뇌 피질의 뉴런 2 일 자극한다. </li><li> 처리 샘플, 37 ° C 4 ° C로 냉각 원심 분리기 및 설정 수조 온도 100 ° C의 열 블록에 이전. </li><li> 인큐베이터에서 세포 요리를 제거하고 얼음에 배치합니다. <ol><li> 세척 당 2 분 - 세포에서 대기음 매체는 2 ~와 ml의 얼음 추위 인산염 완충 식염수 (PBS) 1 부드럽게 2 번 교체합니다. </li><li> 이 분석을 위해, 콘드 당이 우물을 사용ition. </li><li> 조건의 첫 번째 우물에서 대기음 PBS와 250 μl의 균질화 버퍼로 교체합니다. 얼음에 세포를 균질화, 5 분간 얼음에두고, 다음 셀 리프터를 사용. </li><li> 동일한 조건의 다음 잘에서 PBS를 기음과 우물에 최근 균질 혼합물을 추가합니다. 이 단백질의 농도를 증가시킬 것이다. 모든 조건에 대해 반복합니다. </li><li> 완료되면, 피펫 얼음에 미리 냉각 된 1.6 ml의 마이크로 튜브에 균질 액을 1 % 트리톤-100의 최종 농도에 도달하기 위해 20 % 트리톤-100을 추가한다. 거품을 최소화하면서 1000 μL 피펫으로 10 시간 혼합 씹다. </li></ol></li><li> 2 분 단백질을 가용화하는 얼음 튜브 부화. 4 ° C에서 6010 RCF에서 10 분 동안 배양, 원심 분리기에 이어 비 가용성 물질을 펠렛합니다. 얼음에 새로운 냉장 1.6 ML 튜브에 해물 뜨는 이동합니다. </li><li> 브래드 포드 분석 (11)를 사용하여 단백질 농도 분석을 수행하고 FINA에 샘플을 희석B-Mercaptethanol (BME)으로 보충 된 1 % 트리톤 -100 5 배 샘플 버퍼가 보충 균질화 완충액 남은가 5mg / ml - 3 L의 단백질 농도. </li><li> 이 튜브에 균등하게 각 실험 샘플을 나눈다. 30 분 (SNARE 복합체), 30 분 (SNARE 단량체) 100 ° C에서 다른 37 ° C에서 하나의 샘플을 인큐베이션. 용액의 샘플을 유지하기 위해 간헐적 튜브 전환. </li><li> SDS-PAGE로 분리 할 준비가 될 때까지 -20 ℃에서 동결 된 샘플. 100 ° C에서 5 분 동안 끓인 이전 샘플 재비 표준 기술을 사용하여 전기 영동을 통해 샘플을 실행하지만, RT에서 37 ° C 샘플을 해동 종래. </li><li> 샘플의 실행 중복 (30 - 샘플 당 단백질 40 μg의) 8 %와 15 % 겔 모두; 15 %의 SNARE 단백질 단량체 (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, 신택-1 ~ 35kDa)을 정량화하는 데 사용되는 반면, 8 %는 단지의 이상적인 분리를 제공합니다. 염료 라인이 STAC 통해까지 70 V에서 전원을 유지90V에 왕 젤 증가 전압. 염료 전원이 소모 될 때까지 젤을 실행합니다. </li><li> 단량체을 유지하려면 45 분 70 V에서 20 % 메탄올 (메탄올)을 첨가하여 차가운 전송 버퍼를 사용하여 얼음에 0.2 μm의 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 전송합니다. </li><li> O 2 시간 동안 덮여 접시에 건조 막 / RT에서 N (O / N이 최상의 결과를 제공한다). </li><li> 블록은 RT에서 1 시간 동안 10 %의 소 혈청 알부민 (BSA)의 복합 막을 스네어. </li><li> 회전 진탕 기에서 4 ° C에서 1,000 프로브 O / N : 1의 희석 (특정 SNARE 복합체 구성 요소 인식) 일차 항체를 준비합니다. <ol><li> 트리스 완충 식염수 플러스 0.1 % 트윈 20 (TBS-T) 5 분마다 3 번에 말을 씻어. </li></ol></li><li> 1의 희석에 형광 차 항체 솔루션을 준비 : 20,000 1 %의 TBS-T에서 BSA와 프로브를 RT로 덮여 1 시간에 대해. 1 시간 후 단계를 반복 2.12.1. </li><li> 형광 스캐닝 시스템의 이미지도 말은 소프트웨어 스위트를 장착하고 SNARE 단백질의 공동 모두 정량화직사각형의 ROI를 그리기위한 제조업체의 지침을 사용하여 (각각 25 kDa의 18 kDa의, SNAP-25, VAMP2 35 kDa의에서 면역 밴드와 신택-1) mplex (40kDa 위의 면역 밴드)와 단량체 밴드. </li></ol> TIRF 현미경을 통해 3 이미징 Exocytic 이벤트 이 프로토콜은 온도, 습도, CO (2), epifluorescent 조명하는 고배율 / 높은 개구 수 (NA) TIRF 목적 자동화 된 XYZ 스테이지를 구비 한 반전 TIRF 현미경을 유지하는 환경 챔버를 포함 특수 현미경 장비를 필요로하고, 참고 민감한 전하 결합 소자 (CCD) 검출기. 이 프로토콜은 100 배 1.49NA TIRF 목표 고체 491 nm의 레이저 및 전자 배가 CCD (EM-CCD)를 장착 한 완전 자동화 된 거꾸로 현미경을 사용합니다. 모든 장비는 이미징과 레이저 제어 소프트웨어에 의해 제어된다. envir 이전에 처음으로 촬상 프로토콜 전력onmental 실, 무대, 조명, 컴퓨터, 카메라. <ol><li> 이미징 소프트웨어 내에서 선택의 목적. 대물가 제자리에 있으면, 칼라 주위 대물 히터를 고정. </li><li> 그 목적은 단 슬롯에 무대 인큐베이터을 확보하기 전에 완전히 내려 확인합니다. 유출을 방지하기 위해 균등 단계 인큐베이터 입구에 증류수를 붓는다. </li><li> 배양 시스템을 켭니다. 이산화탄소 탱크 밸브를 열어 압력이 제조업체의 지침에 따라 시스템에 적합한 확인합니다. 실을 5 % CO 2, 37 °의 C에 도달하는 시간을 허용합니다. 촬상 접시를 첨가하기 전에, 대물 물 응축을 피하기 위해 인큐베이터에서 빈 접시를 배치했다. </li><li> 레이저 소스의 전원을 켭니다. </li><li> 오픈 스테이지 인큐베이터와 렌즈에 침지 기름을 추가 할 수 있습니다. 인큐베이터에서 샘플을 놓고 안정성 무기 또는 접시의 무게와 안정. 오일 샘플의 바닥에 닿을 때까지 대물을 올린다. Switc투과광 조명에 시간과 접안를 통해 신경 세포의 초점면을 찾을 수 있습니다. </li><li> 레이저 소프트웨어를 시작하고 레이저 제어 소프트웨어에 연결합니다. 위드와 목적이 사용되는 선택 조명을 설정 (100X 1.49 NA TIRF 권장). 샘플의 설정 굴절률 (셀 ~ 1.38). 491 nm의 레이저에 대해 &quot;TTL&quot;를 취소하여 레이저 강도를 조정합니다. 40 % - 다음 20 사이의 값으로 다시 아래로 가져 (100) 슬라이더를 조정합니다. &quot;TTL&quot;을 다시 확인. </li><li> 투과광 조명에 다시 샘플에 초점을 맞 춥니 다. 이미징 소프트웨어로 이동하여 491 nm의 레이저 조명 및 오픈 셔터를 선택합니다. 미세 천장에 레이저의 초점을 조절하고 제거 응축기와 닫힌 필드 다이어프램의 중앙 지점을 중심. 그래서하지 스크래치 렌즈에 거꾸로 광학 벤치에 콘덴서를 배치합니다. </li><li> 콘덴서를 교체하고 110 nm의 TIRF 소프트웨어 및 설정 침투 깊이 (PD)로 이동합니다. TIRF의 ILLUM에 위드 조명에서 전환이미징을위한 ination 모드. </li><li> epifluorescent 광원으로 위드 표면 형광을 사용하여 접안을 통해 발현 세포 VAMP2-phluorin를 찾을 수 있습니다. <ol><li> 촬상 파라미터 (노출 시간, 게인 및 레이저 파워) (예 photobleaching에 및 광독성 줄이는 최소 노출 시간 및 레이저의 강도를 사용하여 노이즈 비율과 동적 범위의 신호를 최대화하도록 조정 : 50 ~ 노광 - 100 밀리 초, 15로 - 30 30 % 최대 레이저 파워)에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 셀 당 설정 연속 자동 초점. 인수는 5 분 동안 매 0.5 초마다 발생으로 설정 timelapse에 이미지를 획득. netrin 1 자극 조건, 층류 후드에서 세포의 접시-1 NG netrin 500 / ㎖를 추가로 촬상 전에 1 시간 동안 인큐베이터에 접시를 반환한다. </li></ol></li><li> , ImageJ에 오픈 이미지 스택&gt; 열기&gt; 파일 이름 (그림 창에 파일을 드래그하거나 파일로 이동하여 셀 영역 및 시간 당 정상화 exocytic 이벤트의 빈도를 정량화하기0; 2A 인셋 1). <ol><li> 평균 강도 : 소포 융합 이벤트를 나타내지 않는 안정된 형광 신호를 제거하려면 이미지&gt; 스택&gt; Z-프로젝트&gt; 프로젝션 유형을 사용하여 전체 스택의 평균 Z 투영을 만듭니다. &gt; 프로세스를 사용하여 timelapse에&gt; 이미지 계산기 각 이미지에서 이미지 1을이 평균 이미지를 빼기 : 스택 작업 : 이미지 2를 새롭게 생성 된 평균 Z 투영을 뺍니다. 이 exocytic 이벤트 (- 3 그림 2A 삽입 된 2)를 강조한다. </li><li> 눈으로 exocytic 융합 이벤트를 계산합니다. Exocytic 이벤트 급속 VAMP2-phluorin 플라즈마 막 (도 2A 인셋 6) 내에 확산으로 확산 회절 제한된 형광 신호의 모양으로서 정의된다. </li><li> &gt; 이미지를 사용하여 첫 번째 이미지를 강조 조정&gt; 임계 값&gt; 전체 셀이 임계 값 (- 8 그림 2A 삽입 된 7)를 강조 표시 될 때까지 슬라이더를 조정 임계 값 명령을 사용하십시오. </li><li> 아나에서lyze, SetMeasurements을 선택하고 영역 표시 라벨을 확인합니다. (- 8 그림 2A 삽입 된 7)을 측정하기 위해 지팡이 추적 도구를 눌러 &#39;m&#39;을 사용하여 역치 휴대 영역을 선택합니다. </li><li> 모두 exocytic 융합 이벤트 카운트 환승, 스프레드 시트 셀 면적을 측정하고, 경과 촬상 시간 exocytic 이벤트 / 2 mm / 시간의 수 (도 2A 인셋 9)를 산출한다. </li></ol></li></ol> 4. 미분 간섭 대비 (DIC) 축삭 분기의 Timelapse입니다 현미경 참고 : DIC 이미징에 대한 일반적인 접근 방식에 대한 전체 프로토콜 및 데모 (12)을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 DIC를 이용하지만, 다른 투과광 현미경 법 (예 : 위상차)를 동일한 목적으로 사용될 수있다. <ol><li> 2 DIV에서, 사전 예열 환경 챔버에 형질 감염되지 않은 신경 세포를 포함하는 장소의 유리 바닥 이미징 요리는 습기 ENV를 유지하기 위해5 % CO 2, 37 ° C로 ironment. 최고의 이미지 품질과 해상도를 A A 60X 계획 - 고차 색지움 장착 현미경, 1.4 NA DIC 대물 렌즈와 높은 NA 콘덴서를 사용한다. </li><li> 투과광 조명을 사용하여 접안을 통해 신경 세포를 찾기 위해 초점면을 조정합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어의 다중 영역 취득 기능을 이용하여 검색 및 적어도 106 세포의 XYZ 위치를 저장한다. 무대를 위치 있도록 최상의 결과를 위해 시야 내에서이자 맞는 뉴런. <ol><li> 250 NG로 자극 / ㎖ netrin-1를 눌러 &#39;다중 영역 획득을 시작&#39;. 순차적으로 필요에 따라 수집 및 재 초점을 일시 중지, 24 시간 동안 각각의 위치에서 매 20 초 영상을 획득. </li></ol></li><li> 다중 차원 데이터&gt; 열린 파일 이름을 검토&gt; 앱을 사용하여 이미징 소프트웨어에서 이미지를 검토합니다. 안정적인 축삭 분기 (20 μm의 길이) 이미징 세션 동안 그 형태를 확인합니다. stableaxon의 branc을 측정하기 위해 선 그리기 도구를 사용하여끝으로 축삭의 기지에서 시간은 20 μm의 길이 자격이 충족되어 있는지 확인합니다. <ol><li> 막 돌기 초기 지점의 길이가 20 ㎛의 지점에 도달하면 이후뿐만 아니라 netrin 자극 후의 프레임 번호 형성 영역에서 시작할 때 스프레드 시트, netrin 자극 후에 프레임 번호를 기록한다. </li><li> 브랜치마다의 형성 시간을 계산하기 위해 20 초만큼 돌출 형성 분기 간의 프레임 수를 곱한다. </li></ol></li></ol> 5. 독소 노는 및 고정 세포 면역 형광 <ol><li> 2 DIV에서 250 NG와 실험 조건에서 신경 세포를 치료 / ㎖-netrin 1 및 / 또는 10 nM의 보툴리눔 효과적으로 / ㎖ netrin- ng를 SNARE 매개 세포 외 유출 (13), 플러스 (250)을 억제 절단 스네어 단백질 SNAP25 및 독소 (BoNTA) 1. 제어 조건으로 처리되지 않은 뉴런의 한 세트를 남겨주세요. 주의 : 준비하고 사용하는 경우 BoNTA는 눈과 호흡기 보호의 사용을 필요로솔루션을 제공합니다. 가능한 한 빨리 생물학적 물질 및 오토 클레이브 등 모든 오염 물질을 유지한다. </li><li> 3 DIV (24 시간 후 처리) 흡인 미디어, 즉시 PHEM 수정 (자세한 내용은 표 1 참조) 중 적어도 1 ml의 교체에서 37 ° C로 예열. 실온에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. </li><li> (4 ° C에서 파​​라 필름 및 저장과 향후 사용 인감을위한) PBS로 3 배를 씻어. </li><li> 장소 어두운, 가습 염색 실 커버 슬립과 (10 % 트리톤-100 재고에서 만든) PBS에서 갓 희석 0.2 % 트리톤-100에서 10 분 동안 세포막을 Permeabilize 하시려면. </li><li> permeabilization 솔루션을 제거하고 PBS와 1X의 50 μl를 씻어. 30 분 동안 블록 ~ PBS (BSA-PBS)에 10 % 소 혈청 알부민의 50 μl의 10 %가 RT에서 PBS에 당나귀 혈청 삶은. </li><li> 다시 1X PBS로 씻어. 실온에서 1 시간 동안 1 % BSA-PBS에서 : (신경 세포의 신원을 확인하기 위해 1000 βIII의 tubulin의 1) 차 항체의 50 μL에 커버 슬립을 품어, 어두운 데에서. </li><li> PBS로 3 배 5 분 세척을 수행합니다. 튜 불린 (1 : 400)에 대한 스펙트럼-별개의 이차 항체의 50 μL에 커버 슬립을 품어, 형광 팔로이 딘 (여기에 따라 다릅니다 : 100 일에서 488 팔로이 딘 : 400, 647 팔로이 딘 1에서) 1 시간 동안 1 % BSA-PBS에서 . </li><li> 1X PBS로 3 배 5 분 세척하고 설치 미디어의 슬라이드 위에 커버 슬립을 탑재합니다. </li><li> 명확한 매니큐어로 커버 슬립과 씰의 가장자리에서 진공 초과 장착 매체. </li><li> 40 배 1.4NA의 목적, epifluorescent 기능과 EM-CCD와 거꾸로 현미경에 위드 표면 형광 이미지를 수집합니다. <ol><li> 수동 ImageJ에를 사용하여 분기 분석 할 수 있습니다. 창에 파일을 드래그하거나&gt; 열기&gt; 파일 이름 (그림 4A 인세 1에게) 파일로 이동하여 ImageJ에있는 이미지 열기 스택. </li><li> 라인&gt; 분할 줄을 사용하여, 소마 (- 3도 4a 인세 2)에서 연장이 가장 긴 신경 돌기로 정의 축삭을 추적. </li><li>분석&gt; 도구&gt; 투자 수익 (ROI) 관리자를 사용하여 관심 영역으로 추적 축삭을 저장합니다. 추적 및 길이에 신경 돌기 ≥20 μm의 정의 각 축삭 지점을 저장합니다. 분석 (- 4도 4a의 삽입 3)에서 (직접 축삭에서 돋의 outgrowths) 만 주요 지점을 포함합니다. </li><li> 를 눌러 &#39;m&#39;은 관심의 저장 영역을 측정하고 μm의 길이를 계산하기 위해 스프레드 시트로 픽셀 단위로 길이를 전송합니다. </li><li> 100 μm의 길이 엑손 당 분기 수를 얻기 위하여 100 μm의 분할에서 엑손의 길이만큼 길이가 ≥20 ㎛의 축삭 분기 수를 나눈다. </li></ol></li></ol>

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축삭 분기는 근본적인 신경 발달 과정이며 포유류 신경계의 광범위한 신경 연결성을 뒷받침합니다. 국소 원형질막 확장과 관련된 메커니즘을 이해하는 것은 정상 및 병리학적 신경 발달에 대한 이해에 필수적입니다. 집단 수준과 단일 세포 수준 방법론을 모두 통합하는 다각적인 접근 방식을 사용하면 집단 수준 분석을 손상시키지 않으면서 재현성이 향상되고 공간적, 시간적 해상도가 향상됩니다. 단일 세포 수준에서 네트린 의존성 축삭 분기를 검사하기 위해 고정 세포 및 살아있는 세포 접근법을 모두 활용하면 여러 실험에서 큰 샘플 크기를 수집할 수 있는 능력, DIC 이미징을 통한 시간적 분해능, TIRF 현미경을 사용한 엑소 사이틱 융합의 시공간 분해능의 세 가지 이점을 제공합니다. 
SDS 내성 SNARE 복합 분석을 통해 배양에서 피질 뉴런의 이질성을 설명하는 SNARE 활성을 측정할 수 있습니다. SNARE 복합체는 매우 안정적입니다. 대부분의 다른 단백질 복합체는 SDS를 첨가하여 해리됩니...

최근 추정치에 따르면 인간의 뇌에는 1014 개의 시냅스 연결1을 가진 10개의 11 개의 뉴런이 포함되어 있으며, 이는 생체 내에서 축삭 분기의 중요성을 강조합니다. netrin-1과 같은 세포외 축삭 유도 신호는 축삭을 적절한 시냅스 파트너로 안내하고 축삭 분지를 자극하여 시냅스 용량을 증가시킵니다2-5. Netrin-1 의존성 축삭 수목화(accentinal arborization)는 상당한 원형질막 확장(plasma membrane expansion)6을 수반하며, 이를 위해서는 SNARE 복합체 의존성 외계소포 융합(complex dependent exocytic vesicle fusion)7을 통한 추가 막(membrane) 성분의 전달이 필요하다고 가정했습니다. 
netrin-1 의존성 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외포작용의 역할을 조사하는 것은 몇 가지 요인으로 인해 복잡합니다. 첫째, 피질 뉴런의 이질성으로 인해 중요한 효과를 식별하는 데 필요한 샘플 크기가 증가하여 이미징과 같은 단세포 기술이 복잡해집니다. 둘째, 생화학적 기술을 통해 개체군 수준에서 발생하는 변화를 관찰할 수 있지만, 축삭 분기 시간 프레임에서 축삭에 대한 원형질막 확장을 국소화하는 데 필요한 시간적, 공간적 해상도가 부족합니다. 마지막으로, 축삭돌기 가지가 몇 시간에 걸쳐 형성되더라도 축삭 확장에 기여하는 세포 변화는 몇 분 이내에 시작되어 몇 초 단위로 발생할 수 있으므로 실험적 고려를 위한 시간적 범위가 확장됩니다. 
우리는 외포작용과 축삭돌기 분지화의 이러한 다양한 시간적, 공간적 규모를 다루는 다중 기술 접근 방식을 간략하게 설명하여 근본적인 세포 메커니즘에 대한 이해를 향상시킵니다. 이러한 접근법을 활용하면 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외포작용(exocytosis)에 대한 중요한 역할을 뒷받침하는 증거를 얻을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>6-웰 조직 배양 처리 플레이트</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td>12CIR-1.5; 24시간 동안 질산 처리하고 DI 물로 2번 헹구고 사용 전에 건조해야 합니다. 1 mg/ml 폴리-디-라이신으로 코팅하고 세포를 도금하기 전에 헹궈야 합니다.</td></tr><tr><td>Amaxa nucleofection solution</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td>100 ml/transfection</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector/electroporator</td><td>Lonza</td><td></td><td>program O-005</td></tr><tr><td>35 mm Glass bottom live cell imaging dishes</td><td>Matek Corporation</td><td>p356-1.5-14-C</td><td>는 1 mg/ml Poly-d-lysine으로 코팅하고 세포</td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC2 도립 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td></td> 전에 헹궈야 합니다.</tr><tr><td>람다 LS 크세논 램프</td><td>Sutter Instruments Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>환경 무대 상단 인큐베이터</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.49 NA TIRF objective</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor ixon EM-CCD</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Licor 적외선 이미징 시스템</td><td>LI-COR</td><td>Odyssey CL-X</td><td>블롯 스캔에 사용</td></tr><tr><td>이미지 스튜디오 소프트웨어 제품군</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Odyssey Infrared 시스템에서 스캔하는 데 사용됩니다. 블롯의 오프라인 분석에 사용되는 Image studio lite</td></tr><tr><td>Metamorph for Olympus</td><td>Molecular devices, LLC</td><td>버전 7.7.6.0</td><td>모든 이미징 및 DIC 타임랩스 분석에 사용되는 소프트웨어</td></tr><tr><td>CELL TIRF 제어 소프트웨어 TIRF 이미징</td><td>용 레이저 제어에 사용되는</td><td>Olympus</td><td></td> 소프트웨어</tr><tr><td>피지(이미지 J)</td><td>NIH</td><td>ImageJ 버전 1.49t</td><td></td></tr><tr><td>60x Plan Apochromat 1.4 NA 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x 1.4 NA Plan Apochromat objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal media</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td>무혈청 및 트립신 담금질 매체용 기본 솔루션</td></tr><tr><td>보충제 B27</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td>500ml/50ml 무혈청 배지 및 트립신 담금질 배지</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td></td><td>35050-061</td><td>1ml/50ml 무혈청 배지</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Bio Basic Incorporated</td><td>9048-46-8</td><td>커버슬립 차단을 위한 1x PBS의 10% 용액; 니트로셀룰로오스 멤브레인 차단을 위한 TBS-T의 5% 용액.</td></tr><tr><td>10x&nbsp; 트립신</td><td>시그마</td><td>59427C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CELLGRO</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)+ Ca + Mg</td><td>코닝</td><td>21-030-cm</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base</td><td>Fisher scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>N-Propyl Gallate</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 광도 등급</td><td>Acros Organics</td><td>18469-5000</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 (비광학 등급)</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>B-mercaptoethonal</td><td>Fisher scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>증류수&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>152340-147</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>p-7886</td><td>1 mg/ml의 멸균수에 용해</td></tr><tr><td>Botulinum A 독소 BoNTA</td><td>List Biological Laboratories</td><td>128-A</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti human VAMP2</td><td>Cell signaling</td><td>11829</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-12736</td><td></td></tr><tr><td>염소 다클론 항 인간 SNAP-25</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7538</td><td></td></tr><tr><td>마우스 단클론 항 인간 및 베타; III-튜불린&nbsp;</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 및 Alexa Fluor 488 phalloidin, 또는 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-COR IR-염료 2차 항체</td><td>LI-COR</td><td>P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022</td><td>800 당나귀 안티 마우스, 680 당나귀 안티 토끼, 680 당나귀 안티 염소</td></tr><tr><td>0.2 &#956; m 기공 크기 니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Biorad</td><td>9004-70-0</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25426A</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Fisher Scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>O-4042-500</td><td></td></tr><tr><td>트리톤-X100</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>40% 비스-아크릴리미드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP1408-1</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Alternative Validated Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 클론</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0664</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 마우스 단클론 Synaptobrevin 2 (VAMP2)</td><td>Synaptic Systems</td><td>104-211</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Monoclonal SNAP25</td><td>Synaptic Systems</td><td>111-011</td><td></td></tr></tbody></table>

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

신경 발달 과정에서 성장하는 축삭은 축삭 가지를 정교하게 만들어 여러 시냅스 파트너로 확장됩니다. 축삭돌기 분지화는 netrin-1과 같은 세포 외 유도 신호에 의해 촉진되며 축삭 원형질막의 표면적을 극적으로 증가시킵니다. Netrin-1 의존성 축삭돌기 분지화는 원형질막 확장의 시간적, 공간적 제어를 포함할 가능성이 높으며, 그 구성 요소는 외래 소포 융합을 통해 공급됩니다. 이러한 융합 사건은 VAMP2(소포 관련 막 단백질 2)와 같은 v-SNARE와 원형질막 t-SNARE, syntaxin-1 및 SNAP25(synaptosomal-associated protein 25)를 포함하는 SNARE 복합체의 형성에 선행됩니다. 본 명세서에 자세히 설명된 것은 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외포작용의 역할을 조사하는 데 사용되는 다각적인 접근 방식입니다. 결합된 접근 방식의 강점은 개별 뉴런에서 단일 소포 융합 이벤트의 역학에서 배양된 뉴런 집단에서 SNARE 복합 형성 및 축삭 분기에 이르기까지 다양한 공간 및 시간 해상도에서 데이터를 수집하는 것입니다. 이 프로토콜은 내인성 SNARE 복합체의 수치 분석과 pH 민감성 GFP(VAMP2-pHlourin)로 태그된 VAMP2를 발현하는 피질 뉴런의 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경 검사에 대한 확립된 생화학적 접근 방식을 활용하여 개별 뉴런의 외세포 활성에서 netrin-1 의존적 변화를 식별합니다. netrin-1 의존적 분기의 타이밍을 밝히기 위해 시간 순에 걸친 단일 뉴런의 타임 랩스 미분 간섭 대비(DIC) 현미경이 사용됩니다. SNARE 기전을 절단하고 엑소사이토시스를 차단하는 보툴리눔 신경독과 쌍을 이루는 고정 세포 면역형광은 netrin-1 의존 축삭돌기 분지화가 SNARE 매개 외세포 활성을 필요로 한다는 것을 보여줍니다.

시험관 내 생화학 적 기법을 활용하는 것은. 뉴런의 인구 SDS 방지 SNARE 복합체의 양을 분석 그림 1 SNAP-25, syntaxin1A 및 VAMP2에 대한 프로브 SDS 방지 SNARE 복잡한 분석의 결과 웨스턴 블롯 다음 완료를 보여줍니다. 기저 세포막에서 TIRF 현미경 단셀의 개체 exocytic 융합 이벤트의 높은 해상도 이미지를 제공한다.도 2a-VAMP2 phluorin 매개 exocytic 이벤트를 식별하기위한 이미지 분석 방법을 보여주고있다. 소포 융합이 발생 VAMP2-phluorin은 세포막 내에서 확산되고있다.도 2b는 대뇌 피질 신경 세포에서 (초)의 시간에 걸쳐 발생하는 exocytic 이벤...

생화학적 분석과 결합된 광학 현미경 기술은 네트린 의존성 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외세포작용의 관여를 밝힙니다. 이러한 기술의 조합을 통해 축삭돌기 분지 및 세포 모양 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 식별할 수 있습니다.

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

본 절차의 전반적인 목표는 신경세포의 엑소사이토시스 소포 융합 및 축삭 분지의 시간적, 공간적 발생을 정량적으로 관찰하는 것입니다. 이 방법은 신경계 발달 과정 중 소포 융합이 확장되는 세포막의 어느 시점과 어느 위치에 막 물질을 삽입하는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포에서 높은 공간 및 시간 분해능을 모두 확보하기 위한 라이브 셀 이미징과 집단 기반 정보를 얻기 위한 생화학적 접근법을 결합했다는 점입니다.프로토콜 텍스트에 따라 Netrin-1 또는 대조군으로 피질 뉴런을 배양하고 자극한 후, 해당 조건의 첫 번째 웰에서 PBS를 흡입하여 제거하고 250 µL의 균질화 버퍼로 교체합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양한 다음, 셀 리프터를 사용하여 세포를 얼음 위에서 균질화합니다.동일한 조건의 다음 웰에서 PBS를 흡입하여 제거하고, 최근에 균질화한 혼합물을 해당 웰에 추가하여 단백질 농도를 높입니다. 다음으로, 균질화된 용액을 얼음 위에 미리 냉각시킨 1.6 milliliter 마이크로 퓨지 튜브로 옮기고, 최종 농도가 1%가 되도록 20% Triton X-100을 첨가합니다. 그런 다음 1, 000 microliter 피펫을 사용하여 기포 발생을 최소화하면서 혼합물을 10회 트리투레이션(triturate)합니다. 단백질을 가용화하기 위해 튜브를 얼음 위에서 2분 동안 배양합니다.그 다음, 비용해성 물질을 침전시키기 위해 4 °C에서 6,010 RCF로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 얼음 위에 둔 새로운 냉각된 1.6 mL 튜브로 옮깁니다. 이어서, Bradford 분석법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.그런 다음, 1% Triton X-100이 포함된 균질화 완충액과 BME가 첨가된 5X 샘플 완충액을 사용하여 샘플을 최종 농도 3-5 mg/mL가 되도록 희석합니다. 각 실험 샘플을 두 개의 튜브에 동일하게 나누어 담습니다. 그 후, 한 개의 샘플은 37 °C에서 30분 동안, 다른 샘플은 100 °C에서 30분 동안 배양합니다.샘플이 용액 상태로 유지되도록 튜브를 간헐적으로 뒤집어 줍니다. 그 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 SDS page 및 Western blotting을 수행합니다. TIRF 현미경과 샘플을 설정하고, 텍스트 프로토콜에 따라 신경세포의 초점면을 찾습니다.레이저 소프트웨어를 실행하고 레이저 제어 소프트웨어

utilizing-combined-methodologies-to-define-role-plasma-membrane

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 이용 배아 여자 척수에서 뉴런의 유전자 정의된 그룹의 axonal 경로를 시각화하는 방법을...

활용 칙 신경 튜브에서 뉴런의 유전 정의된 그룹 Axonal 경로를 벗기기 비켜에서 Electroporation

쥐 척수로 감각 afferents의 틀에 박힌 예상 단일 axons의 추적을 통해 axonal 분기를 공부하기 위해 쉽게 액세스할 실험 시스템을 제공합니다.

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출처: Winkle, CC, et al. 축삭 분지 및 신경 형태 형성 동안 원형질막 전달의 역할을 정의하기 위해 결합된 방법론을 활용합니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 피질 뉴런에서 실시간 축삭 분기를 관찰하기 위해 DIC(Differential Interference Contrast) 현미경을 사용하는 라이브 이미징 기술을 보여줍니다. 타임랩스 비디오는 축삭에서 국소적인 엑소사이토시스 및 세포골격 재배열을 유도하는 신호 분자인 netrin-1 처리의 효과를 포착합니다. 이러한 과정은 성숙한 축삭 가지로 발달하는 막 돌출을 시작하여 신경 발달에 대한 통찰력을 제공합니다.

마우스 피질 뉴런에서 축삭 분지의 실시간 체외 이미징

우리는 여기에서 pH 에 민감한 녹색 형광 단백질 변이체, pHluorin의 사용을 설명, 축 슨 유도 수용체의 스파티오-측두동역학을 연구 하는 세포 표면에 인신 매매. pHluorin 태그 수용체는 병아리 배아의 전기 기공을 사용하여 세포 배양 및 생체 내에서모두 표현된다.

세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용

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