결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

이 절차의 전반적인 목표는 신경세포, 외래 소포, fushion 및 축삭 분지의 시간적 및 공간적 발생을 정량화할 수 있는 관찰을 하는 것입니다. 이 방법은 신경세포 발달 중에 소포 융합이 팽창하는 원형질막에 막 물질을 삽입하는 시기와 위치와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포에서 높은 공간 및 시간 해상도를 획득하기 위해 살아있는 세포 이미징과 집단 기반 정보를 획득하기 위한 생화학적 접근 방식을 결합한다는 것입니다.

프로토콜 텍스트에 따라 Netrin-1 또는 대조군으로 피질 뉴런을 배양하고 시뮬레이션한 후. 조건의 첫 번째 웰에서 PBS를 흡입하고 250마이크로리터의 균질화 완충액으로 교체합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양한 다음 세포 리프터를 사용하여 얼음 위의 세포를 균질화합니다.

동일한 조건의 다음 웰에서 PBS를 흡인하고 최근에 균질화된 혼합물을 웰에 추가하면 단백질 농도가 증가합니다. 다음으로, 균질화된 해결책을 얼음에 미리 냉각된 1.6 밀리리터 microfuge 관으로 옮기고, 거품을 극소화하고 있는 동안 1%의 마지막 농도를 도달하기 위하여 20%Triton X-100를 그 후에 1, 000 마이크로리터 피펫으로, 혼합물 10 시간 triturate. 단백질을 가용화하기 위해 얼음 위에서 튜브를 2분 동안 배양합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 6, 010 RCF에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 펠릿화합니다. 라이 상태 상등액을 얼음 위의 새로운 냉각 1.6ml 튜브로 옮깁니다. 다음으로, Bradford 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.

그런 다음 BME가 보충된 1% Triton X-100 및 5X 샘플 버퍼가 있는 균질화 버퍼를 사용하여 샘플을 밀리리터당 3-5밀리그램의 최종 농도로 희석합니다. 각 실험 샘플을 두 개의 튜브로 고르게 나눕니다. 그런 다음 한 샘플은 섭씨 37도에서 30분 동안, 다른 샘플은 섭씨 100도에서 30분 동안 배양합니다.

샘플을 용액에 유지하기 위해 튜브를 간헐적으로 뒤집습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 SDS 페이지와 웨스턴 블로팅을 수행합니다. TIRF 현미경과 샘플을 설정하고 텍스트 프로토콜에 따라 신경 초점면을 찾은 후.

레이저 소프트웨어를 시작하고 레이저 제어 소프트웨어에 연결합니다. 조명을 광시야로 설정하고 대물렌즈를 선택합니다. 그런 다음 샘플의 굴절률을 설정하고 491 레이저에 대한 TTL을 선택 취소하여 레이저 강도를 조정합니다.

이미징 파라미터 최적화는 바닥 온전한 외래 소포를 이미징하는 동안 초점 드리프트 및 광독성을 방지하는 동시에 분석에 충분한 높은 신호 대 잡음비의 이미지를 생성하는 데 중요합니다. 슬라이더를 100으로 조정한 다음 20에서 40 사이의 값으로 다시 가져옵니다. 그런 다음 TTL을 다시 확인합니다.

다음으로, 투과광 조명에서 샘플에 다시 초점을 맞춥니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어에서 491 레이저 조명을 선택하고 셔터를 엽니다. 렌즈가 긁히지 않도록 광학 벤치에 콘덴서를 거꾸로 놓습니다.

천장에 있는 레이저의 초점을 미세 조정하고 콘덴서를 제거한 상태에서 점을 폐쇄 필드 다이어프램의 중앙에 놓습니다. 그런 다음 콘덴서를 교체하고 TIRF 소프트웨어에서 침투 깊이를 110나노미터로 보냈습니다. 그런 다음 이미징을 위해 광시야 조명에서 TIRF 조명 모드로 전환합니다.

이제 광시야 형광을 사용하여 접안렌즈를 통해 VAMP2 형광 발현 세포를 찾습니다. 그런 다음 광표백 및 광독성을 줄이기 위해 이미징 매개변수를 조정하여 최소 노출 시간과 레이저 강도를 사용하여 신호 대 잡음비와 동적 범위를 최대화합니다. 셀당 연속 자동 초점을 설정합니다.

그런 다음 5분 동안 0.5초마다 획득이 발생하는 타임랩스 이미지 세트를 획득합니다. 층류 후드에서 Netrin-1 자극 상태의 경우, Netrin-1의 최종 농도를 세포 접시에 1밀리리터당 500나노그램으로 추가하고 이미징 전 1시간 동안 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 세포 면적 및 시간별로 정규화된 외래 이벤트의 빈도를 정량화합니다.

ImageJ에서 파일을 창으로 드래그하거나 파일, 열기, 파일 이름을 선택하여 이미지 스택을 엽니다. 소포 융합 이벤트를 나타내지 않는 안정적인 형광 신호를 제거하려면 이미지, 스택, Z 프로젝트, 투영 유형 평균 강도를 사용합니다. 전체 스택의 평균 Z 투영을 생성합니다.

Process, Image Calculator, Image 1 your stack, Operation Subtract image two를 사용하여 타임랩스의 각 이미지에서 결과 평균 이미지를 뺍니다. 그 결과 Z 투영이 새로 생성됩니다. 이것은 이국적인 사건을 강조할 것입니다.

이제 눈으로 외래 fushion 이벤트를 세어볼 수 있으며, 이는 원형질막 내에서 VAMP2 플루오렌이 확산됨에 따라 빠르게 확산되는 회절 제한 형광 신호의 반점으로 식별될 수 있습니다. 이미지, 조정, 임계값으로 첫 번째 이미지를 강조 표시하고 전체 셀이 임계값이 강조 표시될 때까지 슬라이더를 조정합니다. 그런 다음 Analyze(분석)에서 Set Measurements(측정 설정)를 선택하고 영역과 디스플레이 레이블을 확인합니다.

지팡이 추적 도구를 사용하여 임계값이 설정된 세포 영역을 설정하고 M을 눌러 측정합니다. 수집된 데이터를 텍스트 프로토콜에 따라 스프레드시트로 전송합니다. 시험관 내 2일째 되는 날, 형질주입되지 않은 뉴런이 들어 있는 유리 바닥 이미징 접시를 예열된 습한 환경 챔버에 놓습니다.

6개의 DX plan 아포크로맷 1.4 NA DIC 대물 렌즈와 높은 개구수 콘덴서가 장착된 현미경을 사용하여 최상의 이미지 품질과 해상도를 얻을 수 있습니다. 다음으로, 투과광 조명으로 초점면을 조정하여 접안렌즈를 통해 뉴런을 찾습니다. 축삭돌기 분기의 DIC 이미징의 경우, 더 차가운 조명의 적절한 설정은 이미지 최적화에 필수적이며 분석 가능한 결과를 생성하는 데 매우 중요합니다.

그런 다음 시야 내에 관심 있는 뉴런이 있는 상태에서 이미징 소프트웨어의 다중 영역 획득 기능을 사용하여 최소 6개 세포의 XYZ 위치를 찾고 저장합니다. 이제 Netrin-1 또는 기타 관심 인자의 최종 농도 1밀리리터당 250나노그램을 추가하여 세포를 시뮬레이션하고 다중 영역 획득 시작을 누릅니다. 24시간 동안 20초마다 각 위치에서 이미지를 순차적으로 획득합니다.

필요에 따라 획득을 일시 중지하고 다시 초점을 맞춥니다. 이미징 소프트웨어 내에서 앱, 다차원 데이터 검토를 선택하여 이미지를 검토하고 원하는 파일을 엽니다. 이미징 세션 중에 형성된 안정적인 축삭 가지를 식별합니다.

추적 영역 도구를 사용하여 축삭 기저부에서 끝부분까지 안정적인 축삭 가지를 측정합니다. Netrin과 Botulinum toxin으로 뉴런을 치료하고 텍스트 프로토콜에 따라 beta-3 tubolin 및 actin에 대한 고정 및 면역 염색 및 면역 염색 후. 도립 현미경을 사용하여 광시야 epifluorescence 이미지를 수집합니다.

ImageJ에서 이미지 스택을 열고 분기 사용 선, 분절 선을 수동으로 분석하고 소마에서 연장되는 가장 긴 신경돌기로 정의된 축삭을 추적합니다. Analyze(분석), Tools(도구), ROI Manager(ROI 관리자)를 사용하여 축삭 추적을 관심 영역으로 저장합니다. 그런 다음 길이가 20마이크로미터 이상인 신경돌기로 정의되는 각 축삭돌기 가지를 추적하고 저장합니다.

분석에 기본 분기만 포함합니다. 여기에 표시된 것은 SDS 내성 SNARE 복합체 분석 완료 후 발생한 웨스턴 블롯입니다. SNAP25, Syntaxin 1A 및 VAMP2에 대해 조사되었습니다.

복합체의 SNARE 단백질, 식별 가능한 단량체가 여기에 나와 있습니다. 피질 뉴런에서 시간이 지남에 따라 발생하는 VAMP2 플루로엔 매개 외래 사건의 예가 여기에 나와 있습니다. 확대된 삽입은 soma, axon branch 및 axonal growth cone을 나타내며 이 분석의 공간적 유용성을 보여줍니다.

원은 TIRF 현미경을 통해 볼 수 있는 단일 외래 핵융합 이벤트를 폭발시킵니다. 이 타임 랩스 DIC 이미징은 Netrin이 축삭 분기의 형성을 자극한 것을 실시간으로 보여줍니다. 이러한 위치는 분기 사이트의 초기 돌출을 나타냅니다.

이들은 주 축삭돌기에서 분지 끝까지 측정된 최소 20마이크로미터의 완전히 형성된 안정된 가지를 나타냅니다. 이 실험에서 3 DIV의 피질 뉴런은 분지를 자극하는 Netrin-1 또는 SNARE 복합체의 구성 요소인 SNAP25를 절단하고 exocytosis를 차단하는 보툴리눔 A 독소로 처리되었습니다. 결과는 SNARE 매개 외포작용이 Netrin 의존적 분기에 필요하다는 것을 보여줍니다.

일단 마스터하면 DIC 이미징은 한 번의 야간 이미징 세션으로 완료할 수 있습니다. 개별 외래 이벤트의 TIRF 이미징은 4-5시간 내에 관리할 수 있습니다. SNARE 복합체 형성 생화학 프로토콜은 2시간 내에 수행할 수 있습니다.

이러한 절차를 시도하는 동안 자신의 속도를 유지하고 한 단계도 서두르지 않는 것이 중요합니다. 최상의 결과를 얻으려면 각 절차에주의와 인내가 필요합니다. 이 절차에 따라, 태그가 지정된 후보 화물과 함께 태그가 지정된 소포 구성 요소의 cotransfection과 같은 다른 방법을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다.

예를 들어, 외래 소포의 화물은 무엇입니까? 개발 후, 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 해리된 신경 배양에서 신경 형성, 축삭 분지 및 기타 형태 형성 단계를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경 형태 형성의 변화에 해당하는 신경 세포 외래 소포 융합 이벤트의 공간적 및 시간적 특성을 관찰하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

보툴리눔 독소 또는 고출력 레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 보안복을 착용하고 현미경 안전 잠금 장치를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.