다광자 타임랩스 이미징을 사용한 제브라피시 배아의 신경능선세포 이동 시각화

저융점 아가로스에 매립된 살아있는 탈융모 형질전환 제브라피쉬 배아로 시작하여 배아 배지로 채워진 챔버에 넣습니다.

배아는 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP) 표지 신경능선 세포를 발현합니다.

챔버를 현미경 스테이지에 배치합니다. 명시야 조명을 사용하여 대물렌즈를 조정하여 배아의 초점을 맞추고 시야의 중앙에 배치합니다.

물 침수 대물렌즈로 전환하고 배아에 다시 초점을 맞춥니다.

이미징 매개변수를 조정하여 측면에서 내측 가장자리까지 Z-스택 이미지를 획득하여 눈의 너비를 캡처합니다.

명시야 조명을 끄고 스테이지를 덮고 타임랩스 이미징을 시작합니다.

이미징 중에 필요에 따라 챔버에 미디어를 다시 채웁니다.

레이저 조명 하에서 신경능선 세포는 형광을 발합니다.

신경관에서 두개안면 영역으로, 발달 중인 눈 주변으로 이동하여 안구 주위 중간엽 및 전두비동을 채우고 복부로 인두궁을 형성하는 것을 시각화합니다.

전체 설정을 현미경 스테이지에 놓은 후 텍스트 프로토콜에 따라 5배 대물렌즈를 사용하여 배아를 찾습니다. 그런 다음 수동으로 스테이지를 가장 높은 위치로 올리고 미세 초점을 사용하여 배아를 현미경 범위의 중간에 배치합니다.

수동으로 스테이지를 내리고 5배 대물렌즈를 25배 침수 대물렌즈로 변경합니다. 배아에 다시 초점을 맞추기 위해 조심스럽게 무대를 들어 올리십시오. 소프트웨어에서 xyzt 모드를 클릭하여 z의 깊이에 걸쳐 xy 평면에서 시간 또는 t 간격으로 여러 이미지를 얻습니다.

epifluorescence 또는 명시야 보기를 사용하여 관심 영역의 초점 심도를 찾으면 z-스택을 구분할 수 있습니다. 이러한 실험에서 눈의 측면 가장자리는 z-스택의 시작입니다. 여기에서 소프트웨어에 초점을 맞추면 시작 버튼을 클릭합니다. z-스택의 끝인 배아의 정중선까지 초점을 맞춘 후 끝 버튼을 클릭합니다.

중요한 단계는 z 단계가 관심 영역을 포함하는지 확인하는 것입니다. 우리의 경우 측면 가장자리에서 내측 가장자리까지 눈의 너비를 캡처하려고 합니다.

획득 시간과 이미징 주파수를 조정하려면 메뉴를 클릭하십시오. 형광단의 적절한 회복과 배아의 생존을 위해 레이저 출력이 켜져 있을 때 z-스택 획득과 레이저 출력이 꺼져 있을 때 회복 시간 사이에 최소 1:3의 비율을 허용하십시오. 배아 회복을 위한 적절한 시간을 가지고 z-스택과 지정된 창 사이의 시간을 설정합니다. 그런 다음 적절한 창에서 실험의 총 시간을 설정합니다.

이제 라이브 이미지 설정을 켜서