원자 힘 현미경과 뇌 Polysom​​es에서 피어링

본 프로토콜의 전반적인 목표는 마이카(mica) 위에 뇌 폴리리보솜(polyribosome)을 정확하게 정제 및 증착시키고, 과도한 후처리나 3D 재구성 분석 없이도 나노스케일 해상도로 수천 장의 이미지를 얻기 위한 상세한 파이프라인을 제공하는 것입니다. 이 방법은 유전자 발현의 재배선 과정 중 폴리솜(polysome) 내 리보솜 조직화가 미치는 영향을 이해하는 것과 같이, 번역 및 번역 조절 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시료 고정이나 라벨링이 필요 없으며, 거의 생리적인 조건에서 측정이 가능하여 리보솜과 노출된 RNA 가닥을 쉽게 식별할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 포유류 폴리리보솜의 구성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 효모, 박테리아, 곤충과 같은 다른 미생물 및 유전자 발현의 번역 조절과 관련된 상태에도 적용될 수 있습니다. 마이카 흡착을 위한 폴리솜 샘플 취급과 세척 단계가 상당히 까다롭고 숙련된 기술과 경험이 필요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 실험 절차의 시연은 Paola Bernabo와 Lorenzo Lunelli가 진행합니다.

먼저, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 뇌 조직을 수집하여 동결합니다. 그런 다음, 동결된 조직을 냉동고에서 꺼내 실험대로 가져옵니다. 미리 냉각시킨 막자사발에 동결된 뇌 조직과 액체 질소를 넣고, 막자를 사용하여 분말 형태가 될 때까지 분쇄합니다.

약 25 milligrams의 뇌 분말을 차가운 마이크로원심분리관으로 옮기고 즉시 0.8 milliliters의 lysis buffer를 첨가합니다. 세포를 파쇄하기 위해 혼합물을 피펫으로 25회 빠르게 상하로 섞어줍니다. 다음으로, 세포 파편을 펠렛화하기 위해 4 °C에서 12,000 x g로 1분 동안 원심분리합니다.

상층액을 새로운 마이크로원심분리관으로 옮기고 15분 동안 얼음 위에 둡니다. 그런 다음, 원심분리를 5분간 수행하여 핵과 미토콘드리아를 펠렛화합니다. 다음으로, 이전에 준비한 sucrose gradient의 상단에서 1 mL를 조심스럽게 제거합니다.

cytosolic lysate의 상층액을 sucrose 위에 한 방울씩 층을 쌓아 올립니다. 샘플이 밀도 구배 위에 로딩되면, 튜브와 균형 튜브를 스윙 버킷 로터의 버킷에 조심스럽게 넣습니다. 해당 밀도 구배를 100분 동안 원심분리합니다.

초원심분리 후, 밀도 구배가 안정화될 수 있도록 튜브를 버킷에 넣은 상태로 4 °C에서 20분 동안 둡니다. 그 다음, 샘플 튜브를 조심스럽게 꺼내어 밀도 구배 분획 시스템의 수집 장치에 장착합니다. UV 가시광선 검출기로 260 nm에서 핵산의 흡광도를 모니터링하며 1 mL씩 분획하여 수집하고, 이를 얼음에 보관합니다.

다음으로, 관심 분획을 30-40 µL씩 소분하여 얼음 위에 둡니다. 샘플을 즉시 사용하지 않을 경우 -80 °C에 보관하며, 동결-해동 반복 횟수를 제한하도록 조치합니다. AFM 이미징을 위한 샘플을 준비하려면, 먼저 세척된 마이카 시트를 1 mM nickel ii sulfate 200 µL로 덮고 실온에서 3분 동안 배양합니다.

그 다음 용액을 제거하고, 압축 공기로 표면을 말린 후 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 이어서, 관심 분획의 aliquot 전체를 마이카 위에 한 방울씩 조심스럽게 첨가합니다. 100 또는 200 µL 팁을 사용하여 샘플을 마이카 표면 전체에 펴 바르고, 샘플을 얼음 위에서 3분 동안 배양합니다.

그 다음, 마이카 시트 위에 차가운 AFM 버퍼 200 µL를 한 방울씩 떨어뜨려 덮고, 샘플을 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 폴리리보솜 구조를 보존하기 위해서는 샘플을 40°C로 유지하고 RNase-free water로 조제한 차가운 버퍼를 사용하는 것이 중요합니다. 배양 후, 버퍼를 조심스럽게 제거하고 차가운 AFM 버퍼 200 µL로 마이카를 3~4회 세척하여 과량의 sucrose를 제거합니다.

그런 다음, 운모를 차가운 세척액으로 세 번 세척하고 종이를 사용하여 운모에서 과잉 수분을 제거합니다. 폴리솜의 리보솜과 naked RNA를 모두 분리했으므로, 흡착된 시료에서 sucrose를 완전히 제거하는 것이 매우 중요합니다. 페트리 접시의 뚜껑을 부분적으로 열어둔 채 시료를 화학 흄후드 내에서 건조시킵니다.

2시간 후, 페트리 접시를 닫습니다. 이제 샘플을 상온에서 보관할 수 있습니다. 양면테이프를 사용하여 준비된 샘플을 AFM의 샘플 홀더에 부착하십시오.

그 다음, 제조사의 지침에 따라 샘플 홀더를 AFM 스테이지에 삽입하십시오. 보정 후, 캔틸레버 팁이 표면에 닿을 때까지 샘플에 접근합니다. 스캔 영역은 2 x 2 µm, 해상도는 최소 512 x 512 픽셀로 설정하고, 라이브 배경 제거(live background subtraction) 모드를 선택한 후 Z-scale을 20-25 nm로 설정하십시오.

그다음, 이미지 획득을 시작합니다. 공기 중에서 이미지를 획득할 때 높이가 10에서 15 nanometers 사이인 원형 물체의 존재 여부를 확인하며 이미지를 검사하십시오. 이어서, 선명한 물체가 시각화될 때까지 설정점(set point)과 피드백 파라미터를 조정하십시오.

양질의 샘플에서는 배경이 비교적 평탄하게 나타나며, 2~4 nm 높이의 물체들이 일부 관찰되어야 합니다. 이미지가 양호해 보이면, 샘플의 서로 다른 영역에서 2 x 2 µm 스캔을 여러 차례 수행하십시오. 마이카 위에 수크로스 분주액을 증착시킨 후 AFM을 사용하면, 조밀하게 뭉쳐진 리보솜 클러스터 형태로 나타나는 단일 폴리솜의 정확한 크기 정보를 얻을 수 있습니다.

단면 분석을 통해 리보솜 피크 중 하나를 자세히 살펴보면, 리보솜 피크의 높이가 약 14 nanometers임을 알 수 있습니다. 이는 공기 건조 후 인간 리보솜 및 폴리솜에서 이전에 관찰된 결과와 일치합니다. 오른쪽 이미지에서는 매크로를 사용하여 리보솜의 위치를 식별하고 각 리보솜을 빨간색 원으로 표시하였습니다.

이 정보를 사용하여 폴리솜당 리보솜 수의 빈도 분포를 분석할 수 있습니다. 이 실험적 분포는 폴리솜당 리보솜 수 5.8을 중심으로 하고 표준 편차가 1.3인 가우시안 곡선에 적합되었습니다. 뇌 분쇄부터 폴리리보솜 이미지 획득까지의 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행할 경우 8시간 이내에 완료할 수 있습니다.

본 절차를 수행할 때, 샘플을 얼음 위에 유지하고 마이카(mica) 위에 샘플을 증착할 때 차가운 버퍼를 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따르고 개발자가 논문에서 제공하는 ImageJ 플러그인을 사용하면 폴리좀당 리보솜의 수를 정확하게 측정할 수 있습니다. 각 개발 단계 이후, 이 기술은 폴리좀 형성의 역학을 이해하고, 다양한 세포 또는 조직 조건에 따른 폴리좀 조직의 변화를 식별하는 토대가 될 것입니다.

이 영상을 시청하고 나면, 폴리솜의 조직을 체계적으로 분석하고 연구하기 위해 수천 장의 폴리솜 이미지를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.