원자 힘 현미경과 뇌 Polysom​​es에서 피어링

이 프로토콜의 전반적인 목표는 운모에서 뇌 폴리리보솜의 정확한 정제 및 증착을 위한 상세한 파이프라인을 제공하고 무거운 후처리 또는 3D 재구성 분석이 필요 없이 나노 단위 해상도에서 수천 개의 이미지를 얻는 것입니다. 이 방법은 유전자 발현의 재배선 중 폴리솜 내 리보솜 조직의 영향을 이해하는 것과 같은 번역 및 번역 제어 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플 고정 또는 라벨링이 필요하지 않으며 리보솜과 노출된 RNA 스탠드를 쉽게 식별할 수 있도록 거의 생리학적 조건에서 측정을 수행할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 포유류 폴리리보솜의 조직에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 효모, 박테리아 및 곤충과 같은 다른 미생물뿐만 아니라 유전자 발현의 번역 제어와 관련된 상태에도 적용할 수 있습니다. 운모 흡수를 위한 다염색체 샘플과 세척 단계는 매우 까다롭고 취급 기술과 경험이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 파올라 베르나보(Paola Bernabo)와 로렌조 루넬리(Lorenzo Lunelli)입니다.

시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 뇌 조직을 수집하고 동결합니다. 그런 다음 냉동실에서 냉동 티슈를 꺼내 벤치로 가져옵니다. 냉동된 뇌 조직과 액체 질소를 미리 식힌 절구에 넣고 유봉을 사용하여 가루가 될 때까지 분쇄합니다.

약 25mg의 뇌 분말을 차가운 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 즉시 0.8ml의 용해 완충액을 추가합니다. 혼합물을 빠르게 25회 위아래로 피펫팅하여 세포를 파괴합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 1분 동안 12, 000 x g의 튜브를 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.

상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 15분 동안 유지합니다. 그런 다음 튜브를 5분 동안 원심분리하여 핵과 미토콘드리아를 펠릿화합니다. 다음으로, 미리 준비된 자당 구배의 상단에서 1ml를 조심스럽게 제거합니다.

자당을 세포질 용해물(cytosolic lysate)의 상등액과 한 방울 한 방울 겹쳐 놓습니다. 이제 샘플을 그래디언트 위에 로드한 상태에서 튜브와 카운터밸런스 튜브를 스윙 버킷 로터의 버킷으로 조심스럽게 내립니다. 100분 동안 그래디언트를 원심분리합니다.

초원심분리 후, 튜브를 버킷에 넣어 섭씨 4도에서 20분 동안 그대로 두어 기울기가 안정화되도록 합니다. 그런 다음 샘플 튜브를 조심스럽게 제거하고 밀도 구배 분별 시스템의 수집기 장치에 장착합니다. UV 가시광선 검출기로 260나노미터에서 핵산의 흡광도를 모니터링하면서 1밀리리터 분획을 수집하여 얼음 위에 올려놓습니다.

다음으로, 관심 분획의 30-40마이크로리터 분취액을 준비하고 얼음 위에 보관합니다. 샘플을 즉시 사용하지 않을 경우 섭씨 80도에서 보관하고 동결-해동 주기 횟수를 제한하는 조치를 취하십시오. AFM 이미징을 위한 샘플을 준비하려면 먼저 세척된 운모 시트를 200마이크로리터의 1밀리몰 니켈 ii 황산염으로 덮고 실온에서 시트를 3분 동안 배양합니다.

그런 다음 용액을 제거하고 압축 공기로 표면을 건조시킨 다음 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 관심 분수(portion of interest)에서 전체 부분 표본을 운모에 한 방울씩 부드럽게 추가합니다. 100 또는 200 마이크로리터 팁을 사용하여 샘플을 운모 전체 표면에 펴 바르고 얼음 위에서 3분 동안 샘플을 배양합니다.

그런 다음 운모 시트를 200마이크로리터의 콜드 버퍼 AFM으로 한 방울 한 방울 덮고 샘플을 얼음에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플을 40도로 유지하고 RNase가 없는 물에서 준비된 콜드 버퍼를 사용하는 것은 폴리리보솜 조직을 보존하는 데 중요합니다. 배양 후 완충액을 조심스럽게 제거하고 200마이크로리터의 차가운 완충액 AFM으로 운모를 3-4회 세척하여 과도한 자당을 제거합니다.

그런 다음 차가운 세척액으로 운모를 세 번 씻고 종이를 사용하여 운모에서 여분의 물을 배출합니다. 흡수제 샘플에서 자당을 완전히 제거하는 것은 폴리솜에서 리보솜과 벌거벗은 RNA를 모두 절단했기 때문에 매우 중요합니다. 샘플을 그대로 두십시오.amp페트리 접시의 상단이 부분적으로 열린 상태에서 화학 후드 아래에서 건조시킵니다.

2시간 후 페트리 접시를 닫습니다. 이제 샘플을 실온에서 보관할 수 있습니다. 준비된 샘플을 양면 테이프를 사용하여 AFM의 샘플 홀더에 부착합니다.

그런 다음 샘플 홀더를 AFM s에 삽입하십시오.tage 제조업체의 지침에 따라. 보정 후 캔틸레버 팁이 표면에 맞물릴 때까지 샘플에 접근합니다. 2 x 2 미크론의 스캔 영역, 최소 512 x 512 픽셀의 해상도를 선택하고, 라이브 배경 빼기 모드를 선택하고, 20-25 나노미터의 Z 스케일을 선택합니다.

그런 다음 이미지 획득을 시작합니다. 이미지를 검사하여 공중에서 이미지를 획득할 때 10나노미터에서 15나노미터 사이의 높이를 특징으로 하는 둥근 물체가 있는지 확인합니다. 다음으로, 날카로운 물체가 시각화될 때까지 설정값과 피드백 매개변수를 조정합니다.

배경은 약 2-4나노미터 높이의 물체가 있는 좋은 샘플에서 비교적 평평하게 나타나야 합니다. 이미지가 양호해 보이면 서로 다른 샘플 영역에서 2x2 미크론 스캔을 여러 개 획득합니다. 운모에 자당 분취액을 증착한 후, AFM은 촘촘하게 채워진 리보솜의 클러스터로 나타나는 단일 폴리솜의 정확한 크기 설명을 제공합니다.

단면 분석을 사용하여 리보솜 피크 중 하나를 자세히 살펴보면 리보솜 피크의 높이가 약 14나노미터임을 알 수 있습니다. 이는 공기 건조 후 인간 리보솜 및 폴리솜에서 이전에 관찰된 것과 일치합니다. 오른쪽 이미지에서는 매크로를 사용하여 리보솜 위치를 식별하고 각 리보솜을 빨간색 원으로 표시했습니다.

이 정보를 사용하여 폴리솜당 리보솜 수의 빈도 분포를 분석할 수 있습니다. 이 실험적 분포에는 폴리솜당 5.8개의 리보솜을 중심으로 하는 가우스 곡선이 적용되었으며 표준 편차는 1.3이었습니다. 일단 숙달되면, 뇌 분쇄에서 폴리리보솜 이미지 획득에 이르는 이 기술은 적절하게 수행된다면 8시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 샘플을 얼음 위에 보관하고 운모에 샘플을 증착하기 위해 콜드 버퍼를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 개발자의 ImageJ 플러그인을 사용하여 논문에서 사용할 수 있도록 하면 폴리솜당 리보솜 수를 정확하게 계산할 수 있습니다. 각 개발 후에 이 기술은 폴리솜 형성의 동역학을 이해하고 폴리솜 조직의 변화와 다양한 세포 또는 조직 상태를 식별할 수 있는 길을 열 것입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 조직을 체계적으로 분석하고 연구하기 위해 수천 개의 폴리솜 이미지를 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.