Name: Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 학습하세요 대식세포 세포외 트랩을 공초점 현미경으로 시각화하는 방법을. 폐 샘플에서 면역 반응과 염증 연구에 활용할 수 있는 이 기법은 감염 대응 메커니즘 이해에 기여합니다.

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이 작품은 모나 쉬 대학, 국가 건강 및 의료 연구 위원회, 모나 쉬 폐 및 수 면 연구소에서 교부 금에 의해 투자 되었다. 저자 confocal 현미경 이미징, 모나 쉬, 쥬 디 캘 러 한, 알렉스 Fulcher, Kirstin Elgass, 건강과 Camden Lo의 모나 쉬 마이크로 이미징 (MMI)에 임상 면역학의 직원 도움 감사 하 고 싶습니다 그리고 저자 MMI 시설 인정 모나 쉬 대학. 저자는 시설, 모나 쉬 조직학 플랫폼의 과학 및 기술적인 도움을 인정합니다.

이 프로토콜에 승인 하는 실험을 다음과 같이: (1) 윤리 위원회의 모나 쉬 의료 센터, 멜버른 대학교의 윤리 위원회에 의해 (2) 동물에 의해 인간.
 1. Bronchoalveolar 게 (BAL) 세포 <ol><li>에 폐 세포를 사용 하 여 발: (1) 인간의 내부 tracheal 포부를 사용 하 여 상계 6, 및 (2) 마우스 과목 13 . 
	참고: 대 식 세포의 인수는 일반적으로 이러한 세포의 일부 활성화를 발생합니다. 대 식 세포는 잠재적인 의료 문제를 조사 하는 상계를 필요로 하는 환자에서 얻은 고 모든 과목 (이 각 개별 프로젝트에 대 한 결정을 해야 합니다) 메츠의 분석에 적합 있을 수 있습니다.
	<ol><li>발 솔루션 및 회전 (10 분 동안 500 x g) 감소 형태로 펠 릿, 문화 매체 (로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 5% 태아 종 아리 혈 청 및 1 %L-글루타민), 실내 온도에 두 번 세척 및 다음 셀 문화 메디의 4 mL에 희석 음.</li>
		<li>필요한 경우 요청 정식 차동 수; 세포의 대부분 (일반적으로 &#62; 80%) 대 식 세포 6 됩니다. 
		참고:이 일반적으로 의해 수행 됩니다 다른 세포 유형 6의 morphologic 모양을 사용 하 여 임상 조직학 서비스.</li>
		<li>수행 가능한 대 식 세포 세포 Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 발 솔루션에 셀. 
		참고: 발 솔루션 단계 1.1에서에서 설명 했 듯이 인간과 쥐에서 얻은입니다.</li>
		<li>추가 1-4 × 10 5 대 잘 두고 당 문화 매체의 500 µ L에서 coverslips에 24-잘 접시를 37 ° C에서 하룻밤; 세포는 coverslips를 준수 합니다. 인간의 샘플에 대 한 항생제를 추가 (예: 페니실린, 스, 10 4 U/mL) 세균 오염을 방지 하기 위해.</li>
	</ol></li></ol> 2. 발 대 식 세포의 면역 형광 검사 레이블/현미경 참고: 위에서 언급 한 세포 coverslips에 준수.
<ol><li>문화 매체를 제거 하 고 셀 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)을 한 번 씻어. 10 분에 대 한 2 %paraformaldehyde / periodate/lysine (PLP) 정착 액 셀 수정</li>
	<li>PBS, 짧게 셀을 세척 하 고 0.2 %permeabilize에서 다음 20 분에 대 한 PBS에 트윈 20</li>
	<li>10%에서 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 30 분에 대 한 PBS에 희석 치킨 세라 블록 셀</li>
	<li>품 주 및 isotype 제어 항 체 37에서 1: 100 농도 (자세한 정보는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 실 온에서 1 h에 대 한 ° C. 
	참고: 벨 샘플에 대 한 대 식 세포의 특정 마커 일반적으로 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>기본 항 체의 추가 후 PBS, 셀을 세척 하 고 실 온에서 40 분 동안 해당 보조 항 체와 더 품 어.</li>
	<li>PBS에 마운트 장착 DAPI 기반 매체 레이저 업무가 647, 561, 488, 405 nm와 40 X (듯이) confocal 현미경을 사용 하는 시각화에 대 한 섹션을 세척, 1.0 나 오일 목표.</li>
</ol> 3. 폐 조직 샘플 참고: vivo에서 연구의 폐 조직, 관련 노출 후 샘플을 연구 (예를 들어, O에 의해 설명 된 대로 &#39; 설리반 외. 7).이 실험에 대 한 가장 관련성이 높은 노출은 감염 성 미생물, 특히 세균. 이 메서드에 사용할 수 있는 마우스 종자는 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스, 10-12 주 오래 된, 무게 25 ~ 30 g, 및 남성.
<li>Euthanize 쥐, 케 타 민 (400 mg/kg) 및 xylazine (40 mg/kg)의 복 주사를 통해 <ol>. 흉 강 열고 폐와 심장 외과 집게와가 위를 사용 하 여 노출 합니다.
	<ol><li>따뜻한 PBS 30 혈관에서 피를 우 심 실에 21-게이지 바늘을 사용 하 여 달 이다 s, 다음 30 2 %PLP 정착 액 10 mL를 주입 (우 심 실)에 s.</li>
		<li>오픈 흉 게를 따뜻한 PBS (42 ° C)를 사용합니다. 21 게이지 바늘와 0.8 m m 튜브 크기, 컷의 조각 기도 넣어야 하 고 주사 (42 ° C)를 미리 데워의 800 µ L, 3 %agarose 솔루션 포인트 낮은 녹는.</li>
		<li>넥타이 꼰 실크 (4.0 USP) 기관에서. 기도, 정의 삽입 지점 바로 아래 주위 스레드 놓고 간단한 overhand 매듭을 통해 그것을 보호 합니다. agarose를 공고히 폐 주위 얼음 처럼 차가운 PBS를 관리 합니다. 가 위 및 무딘 해 부를 사용 하 여 흉 강에서 블록으로 폐 및 심 혼을 제거 합니다. 개별적으로 각 폐를 제거 하 고 다음 16 h 2에 대 한 수정 %PLP 또는 말린 4 ° c.</li>
		<li>조직 단면까지 4 ° C에서 PBS에는 표본을 저장합니다. 폐 조직을 얻기 위해 이러한 방법은 앞에서 설명한 13 되었습니다.</li>
	</ol></li> <li>폐 조직 준비 샘플 사용 다음 단계.
	<li>10% 천연 버퍼링 말린 실 온에서 24 h에에서 수정 폐 조직 (3.1 단계에서 절제) 조직 <ol>. 75% 에탄올으로 전송 및 12 h 주기, (2.5 h 75 %EtOH, 절대 EtOH 3 h, 내용 제 3B, 그리고 파라핀에 3 h 3.5 h) 조직 프로세서에 넣어.</li>
		<li>소스를 실내 온도에 저장 되는 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 블록을 만드는 표준 파라핀에. 
		참고:이 단계에서 그것은 일반적으로 표준 슬라이드 폐 섹션을 잘라 편리한.</li>
		<li>FFPE 폐 섹션 4-5 µ m 두께 톰을 사용 하 여 자르고 충전, 코팅된 슬라이드 o 설명 이전에 마운트 &#39; 설리반 외. 7</li> <li>슬라이드 마운트, 60 mm x 24 mm coverslips (크기 1.5)에 장착 매체의 3 방울을 넣어, 반전 하는 coverslip에 슬라이드 및 초과 매체 밖으로 밀어. 밀폐 매니큐어와 함께 밀봉 하 고 상 온에서 저장.</li>
	</ol></li></ol> 4. 폐 조직 샘플의 준비/현미경 <ol><li>드 왁 스 rehydrate, 항 원 검색 솔루션 FFPE 폐 조직 샘플을 pretreat.
	<ol><li>오븐 건조는 FFPE 60 ° c.에서 60 분에 대 한 슬라이드 다음 실 온에서 5 분 동안 70% 에탄올 솔루션 30 분 및 전송 자일 렌 용액에 슬라이드를 넣어. 수돗물에 씻어.</li>
		<li>장소 열 플라스틱 랩에 여기 원 검색 10에서 10 분 압력 밥 솥에 따라 m/mol/L 트리 스, 1 mmol/EDTA pH 9.0. 5 분, 로커에 다음 한 번 PBS를 가진 로커에 대 한 수도 물에 두 번 20 분 세척에 대 한 멋진.</li>
		<li>블록 5%에서 10% 닭 혈 청 실 온에서 30 분 동안 BSA/PBS.</li>
	</ol></li> <li>조직 얼룩.
	<ol>대 식 세포에서 메츠를 정의 1%에 1 차 항 체 (MMP 9, H3Cit, 및 f 4/80)을 추가 <li>1/100 희석 (항 체 금액에 대 한 특정 정보는 자료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 4 ° C에서 16 h BSA/PBS. 로커에 5 분에 대 한 PBS를 가진 두 번 세척.</li>
		<li>해당 보조를 가진 외피에 의해 달성 형광 탐지 항 체 1 %BSA에서 / PBS 실 온에서 40 분. 항 체는: (1) 닭 안티 마우스 488 (녹색), 닭 (2) 항 염소 594 (빨간색), 및 (3) 당나귀 반대로 마우스 647 (빨간색까지).</li>
		<li>PBS에 마운트 chromatin는 얼룩이 지기에 대 한 설치 매체 DAPI 포함 된 섹션을 세척.</li>
	</ol></li> <li>Confocal 레이저 스캐닝 머리는 거꾸로 한 현미경에 부착 된를 사용 하 여 형광 이미지를 얻을.
	<li>Excite와 405, 488, 561, 647 준비 <ol>nm의 레이저 라인 연속 클릭 하 여 단일 면 512 x 512 픽셀 이미지를 캡처, 버튼 (2 라인 평균) 20 X 0.1을 사용 하 여 평준화 나 공기와 40 X 1.0 나 석유 목표.</li>
		<li>얻을 각 결과 (즉, 10 고 전력 분야의 보기 (HFOV) 10 자극된 샘플, 등, 각 마우스 컨트롤에 대 한)에 대 한 데이터 및 분석에 대 한 섹션 당 적어도 10 시야. 
		참고: 전체 분야의 대표적인 샘플을 얻기 위해 매트릭스 시스템 사용할 수 있습니다 필드 분할 하는로 다른 섹션 같은 매트릭스 보기의 필드를 선택 하는 각 서로 다른 샘플에 대 한 (예를 들어, 필드 9 섹션으로 분할 될 수 있다 그리고 센터 4 모서리에서 두 HFOV 찍힌다).</li>
	</ol></li></ol> 5. 3 차원 (3 차원) 이미징의 메츠 참고: 메츠는 3 차원 구조, 여러 z-스택 취 함으로써 이미지를 재구성 하는 귀중 한 정보를 제공할 수 있습니다.
<ol><li>1.8 m m와 0.1-0.5의 속도 설정 진폭에는 vibratome를 사용 하 여 200 µ m에서 파라핀 블록에서 폐 표본 섹션 m m/s.</li>
	<li>각각 혈 청 (10% 태아 종 아리 혈 청 및 10% 닭 혈 청)의 20%와 폐 조직 차단 하 고 보충 하는 PBS에 3.75 %permeabilize 다음 부드러운 동요에서 실 온에서 7 h에 대 한 Triton X 100.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브 (항 체 농도 재료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 200 µ L 볼륨에 관련 1 차 항 체 (MMP 9, H3Cit, 및 f 4/80)와 4 ° C에서 16 h에 대 한 섹션을 얼룩.</li>
	<li>1 헤에 대 한 실 온에서 관련 2 차 항 체와 함께 배양 하기 전에 10 분 동안 3 번 PBS에 섹션을 씻어</li>
	<li>PBS에 슬라이드는 현미경 커버 전표를 추가 하기 전에 20 분 동안 솔루션에 폐 섹션 DAPI (1:5, 000)에 대 한 얼룩.</li>
	<li>형광 이미지를 거꾸로 confocal 현미경 (40 x 1.3 없음) 405 장비를 사용 하 여 얻을 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm, 그리고 635 nm 레이저.</li>
	<li>기록 최적의 z 40 x 1.3 나 오일 목표에 대 한 단면 0.54 µ m 두께의 3 차원 z-스택. 
	참고: 사용 하는 소프트웨어는 개별 현미경 따라 달라 집니다. 소프트웨어를 사용 하 여 한 현미경에는 어떻게 예를 들어 보조 파일 1에 제공 됩니다.</li>
</ol> 6. 분석 이미지 참고: 특정 이미징 분석 소프트웨어의 사용을 필요로 하는 샘플의 분석 및 예제 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. 결과의 분석은 사용 하는 특정 프로그램에 따라 달라 집니다, 하는 동안 아래 나열 된 점은 중요 하다.
<ol><li>DAPI 위한 파랑 채널을 선택 하 고 셀에 대 한 최소 크기를 지정 하 여 분석의 발 샘플 <ol><li>정의 대 식 세포의 수 (예를 들어, &#62; 18 µ m 직경에서). 관련 소프트웨어를 사용 하 여 측정 필드 당 세포의 총 수.</li>
		<li>다른 마커 (예를 들어, MMP12, PAD2, 및 H3Cit)의 공동 식 DAPI에서 검색 하는 extracellular chromatin의 존재에 의해 메트로의 기능을가지고 있는 셀의 수를 세. 
		참고: 분석 될 수 있는 마커 수 레이저를 사용할 수의 수에 따라 달라 집니다 하지만 이상적으로 DAPI, 뿐만 아니라 다른 마커를 두 개 이상 포함 되어야 합니다. 다른 메트로 식 (예를 들면, extracellular chromatin와 진된 핵 세포의 수)에 대 한 특정 매개 변수를 덜 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>발에 메트로 식 비교 (는 제어, 연기, 연기/DNase 처리 그룹 사이), 샘플 분석 샘플 당 100 발 세포의 최소.</li>
		이차 항 체 isotype 측정 하 <li>형광의 수준을 제어; 그들의 형광에 대 한 각 샘플에서 100 셀의 최소 측정. 각 마커를 (예를 들어, H3Cit)에 대 한 배경 형광의 평균 수준을 측정 표준 소프트웨어를 사용 하 여.</li>
		<li>메트로 식을 정의를 전형적인 형 (예를 들어, H3Cit 및 MMP9 공동 식 extracellular chromatin)와 셀 그리고 각 메트로 대 한 마커 (예를 들어, H3Cit 및 MMP9)의 형광의 수준을 측정. 셀 배경 및 isotype 컨트롤 위에 아니었다 그들의 얼룩이 메츠 생산 제외.</li>
		<li>인간의 발 샘플에 대 한 최소 100 셀 하 메츠는 대 식 세포의 비율에 대 한 각 샘플에 대 한 분석. Murine 샘플에 대 한 셀은 작은 고 메츠 힘들어 하 정의 분석 (예를 들어, 200 대) 각 샘플에 대 한 셀 수.</li>
	</ol></li> <li>폐 조직 샘플의 분석 <ol><li>폐 조직에 메츠의 존재를 확인 하려면 F4/80 등 특정 macrophage 마커.</li>
		<li>섹션 6.1에에서 나와 다른 매개 변수와 함께 extracellular chromatin를 표현 하는 셀에서 F4/80의 공동 지역화를 사용 하 여 폐 조직에 메츠의 존재를 정의.</li>
		<li>이차 항 체와 샘플에 배경 형광의 수준과 isotype 컨트롤을 결정합니다. 배경 위에서 하지 않은 분석에서 제외 하는 메츠.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 작품에 관하여 있도록 아무 공개 있다.

이 리뷰에서 설명 하는 방법을 기반으로 그물14의 존재를 정의 하는 데 사용 되는. 대 식 세포는 지금까지 발 샘플에서 지배적인 셀 형식이 고 컬렉션의이 방법은 특히 메츠 공부에 대 한 적합 한. 적혈구는 발에 존재 하는 경우이 셀 염화 암모늄을 사용 하 여 lysed 한다. 발 절차 일반적으로 대 식 세포를 활성화 하 고 따라서 메츠 취소 자극 샘플에 있을 것으로 예상 된다. 발 대 식 세포는 일반적으로 매우 부착. 발 대 식 세포 일반적으로 필요 하지 않습니다 특정 표식이 셀이 지배적인 세포 유형 그리고 또한 그들의 형태학에 의해 구별 될 수 있다. 일반적으로 큰 보다 80%는 대 식 세포 (호 중구는 5% 미만), 한 발에 그리고 여러 세척 후에, 일반적으로 (즉, 대 식 세포)만 부착 백혈구6남아 있습니다. 인간 호 중구에서 대 식 세포를 구별할 수 있는 능력에 대해 의심의 여지가, 호 중구 elastase 같이 호 중구...

호 중구 extracellular 함정 (그물), Brinkmann 외. 에 의해 처음으로 설명 했다 1 그들은 주로 (특히 박테리아)에 감염에 대 한 응답에서 생산 되 고 호스트 방어1,2에서 중요 한 역할을 했습니다. 그들은 또한 맥과 반성 루 푸 스 (SLE);를 포함 하 여 비 전염 성 질병에 응답에 설명 되었습니다. 그리고 물질 phorbol 12-myrisate 13-아세테이트 (PMA)2,3. 그것은 최근에 다른 세포 유형 대 식 세포를 포함 한 extracellular 함정 생산 또한 수 있습니다 인식 하고있다. 대 식 세포 extracellular 함정 (메츠)는 아직 문학4,5에서 잘 정의 된 엔터티. 우리는 최근 설립 메츠의 존재를 감지 방법을 생체 외에서 그리고 vivo에서6,7. 이 문서에서는, 메츠 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정을 설명 합니다.
(Apoptosis8) 같은 다른 세포질 통로에서 그것을 구별 하는 NETosis의 주요 특징은 함께에서 chromatin의 압출: 히스톤 (H3Cit)9(1) citrullination, (2)과 립 프로 테아 제10의 공동 식 , peptidyl 아르기닌의 deiminase (패드) 4의 (3) 참여11,12. 대 식 세포는 또한 H3Cit과 립 프로 테아 제, 그리고 패드, 표현 하 고 이러한 기능 메츠의 존재를 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.
메츠는 대 식 세포는 폐 포와 폐의 기도에 있는 지배적인 셀 고 감염/염증 세포 면역 반응을 지시에 초기 역할이 폐, 특히 중요 한 역할을 할 수 있습니다. 또한, 폐의 대부분은 빈 공간 (예를 들어,는 폐 포 내), 메츠 잠재적으로 단단한 장기와 달리 사용 가능한 공간으로 확장 수 있습니다.
그물의 존재를 정의 하는 가장 널리 사용 되는 방법은 confocal 현미경 검사 법입니다. 있다 아직 메츠를 측정 하는 명확 하 게 정의 된 방법. 그물의 측정에 대 한 기술이이 프로토콜에 메츠의 존재를 측정 하는 적응 하고있다. 이 메서드에 대 한 주요 요구 사항 분석 confocal 현미경 검사 법 및 적절 한 이미징 소프트웨어에 액세스할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Human samples: Primary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>1:100 농도 정량화 불가</td></tr><tr><td>Mouse anti-human MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 복수, 농도 없음 주어진</td></tr><tr><td>토끼 anti-human PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug/ml</td></tr><tr><td>마우스 anti-human PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Mouse samples: primary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rat anti-mouse F4/80</td><td>In-house (hybridoma)</td><td>In house</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td><td>사파이어 바이오사이언</td>스 <td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 &shy; &수줍음; &수줍음; &수줍음; PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Super-frost plus 슬라이드</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>분자 프로브</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> 회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td> Chicken anti-goat AF 594 Life technologies A-21442 <td></td></tr><tr><td>Chicken anti-goat AF 594</td><td>Life technologies</td><td>a-21468</td><td></td></tr><tr><td>닭 안티 마우스 AF488</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 양 AF 594</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>닭 안티 마우스 AF 647</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 양 AF 594</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>아이소타입 제어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>토끼 IgG</td><td>집</td><td></td><td></td></tr> 토끼 <tr><td>IgG</td><td>집</td><td></td><td></td></tr><tr><td>내 마우스 IgG1</td><td>BD 생명 과학</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>토끼 IgG</td><td>집</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>양 IgG</td><td>집</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에서Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software Programs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광의 평균 강도를 위해 Microsoft Excel과 같은 표준 사무용 응용 프로그램을 사용할</td> <td>수 있습니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Columns</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 컨포칼 주사 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 컨포칼 주사 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tissue sources</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monash Medical Center</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>의 기관지경 검사실에서 채취한 인간 BAL 샘플멜버른 대학교 약리학과의 마우스 BAL 샘플 및 폐 조직.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td><강한>이름</강한></td><td><강한>회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>기타 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수단 블랙</td><td>시그마-알드리치</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드/주기산염/라이신(PLP) 고정제</td><td>시그마-알드리치</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>자일렌</td><td>시그마-알드리치</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>시그마-알드리치</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>천연 포르말린</td><td>시그마-알드리치</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>파라핀</td><td>시그마-알드리치</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>솔벤트 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 12ml</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 60 x 24ml</td><td>시그마-알드리치</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 블랙 6</td><td>모나쉬 동물 연구 플랫폼(MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

호 중구 extracellular 함정 (그물)의 존재를 정의 하는 데 사용 하는 기본 방법 confocal 현미경 검사 법 이다. 우리는 대 식 세포 extracellular 함정 (메츠) 시각화 설립된 confocal 현미경 검사 법 방법 수정 했습니다. 이러한 extracellular 함정과 립 프로 테아 제, citrullinated 히스톤, peptidyl arginase deiminase (패드) 등 다른 부품의 공동 식 extracellular chromatin의 존재에 의해 정의 됩니다. 메츠의 식은 일반적으로 자극에 노출 후에 측정 하 고 유엔 자극 샘플에 비해. 샘플 배경 및 isotype 제어에 대 한 포함 됩니다. 셀 잘 정의 된 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. Confocal 현미경 검사 법 메츠의 존재를 정의 하는 데 사용할 수 있습니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 조직에.

메츠는 발 샘플, 폐 조직 및 3 차원 이미지와 두꺼운 폐 섹션에서에서 구상 될 수 있습니다. 발 샘플 시각 메츠의 예는 그림 1에 표시 됩니다. 메츠의 형태는의 성숙의 단계에 따라 달라 집니다. 현미경에 첫 번째 감지 기능은 셀의 가장자리에 핵의 운동 이다. 이것은 H3Cit 및과 립 프로 테아 제와 같은 다른 공동 표현된 중재자와 extracellular chromatin 옵니다. 이전 단계에서 셀 아직도 표현 extracellular 함정으로 대략 구형을 있다. 나중 단계에서 메트로 형성 신장 세포의 본문의 특징 이다.
폐 조직 메츠는 그림 2에 표시 됩니다. 폐는 폐 아키텍처를 정의 하는 액체로 팽창로 메츠 치경 벽에 밀어 일반적으로 것입니다. 메츠의...

대 식 세포 세포 외 트랩은 새로 설명된 엔터티. 이 기사는 confocal 현미경 검사 법 방법에 집중할 것 이다 그리고 그들은 어떻게 시각 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 샘플에서.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

이 방법의 전반적인 목표는 컨포칼 현미경을 사용하여 대식세포 세포 외 트랩을 시각화하고 연구할 수 있는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 감염 및 기타 면역 자극에 대한 반응과 같은 염증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 호중구 세포 외 트랩을 연구하는 데 사용되어 온 잘 확립된 방법을 수정한 것이라는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 Roleen Sharma입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 기관지폐포 세척(BAL)으로 인간과 마우스로부터 폐 대식세포를 얻은 후 트리판 블루와 혈구계를 사용하여 BAL 용액에서 생존 가능한 세포 수를 수행합니다. 500 마이크로 리터의 배양 배지에 10-5 번째 대식 세포를 1-4 회 피펫으로 24 웰 플레이트의 웰에있는 커버 슬립에 넣은 다음 세포가 부착 할 수 있도록 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다.배양 배지를 제거하고 PBS를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 2%파라포름알데히드-오디에이트-라이신 또는 PLP 고정제를 추가하고 샘플을 10분 동안 배양합니다. PBS를 사용하여 세포를 간단히 세척한 후 PBS에 0.2%TWEEN 20을 첨가하고 세포를 20분 동안 배양합니다.다음으로, 세포를 차단하기 위해 PBS로 희석한 5% BSA에 10% 치킨 세럼을 첨가하고 샘플을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 블록 용액을 1-100 농도의 1차 및 동위원소 제어 항체로 교체하고 실온에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 PBS를 사용하여 해당 2차 항체를 추가하기 전에 세포를 세척합니다.그런 다음 실온에서 40분 동안 샘플을 배양합니다. PBS에서 세포를 세척한 후 DAPI 기반 장착 매체로 샘플을 장착한 다음 컨포칼 현미경을 사용하여 샘플을 시각화합니다. FFPE 샘플을 항원 회수 용액으로 전처리하려면 슬라이드를 섭씨 60도에서 60분 동안 오븐에서 건조시킵니다.그런 다음 5분 동안 실온에서 샘플을 70% 에탄올로 옮기기 전에 슬라이드를 크실렌 용액으로 30분 동안 옮깁니다. 수돗물을 사용하여 슬라이드를 헹군 후 내열 플라스틱 랩에 넣고 Tris-EDTA pH 9.0의 압력솥에 10분 동안 넣어 항원 회수율을 높입니다. 샘플을 20분 동안 식힌 후 수돗물로 옮깁니다.그런 다음 5분 동안 로커에 올려 놓습니다. 수돗물 세척을 반복한 다음 로커의 PBS에서 슬라이드를 한 번 세척합니다. 샘플을 차단하려면 5% BSA PBS에 10% 치킨 세럼을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.그런 다음 대식세포에서 대식세포 외 트랩(macrophage extracellular trap) 또는 MET를 정의하기 위해 1%BSA PBS에 1-100 희석된 1차 항체를 추가하고 슬라이드를 섭씨 4도에서 16시간 동안 배양합니다. PBS를 사용하여 로커에서 각각 5분씩 샘플을 두 번 세척합니다. 1%BSA PBS에 해당 형광 2차 항체를 추가하고 슬라이드를 실온에서 40분 동안 배양합니다.PBS 세척 후 DAPI가 포함된 마운팅 매체를 사용하여 염색질을 염색하고 샘플을 장착합니다. 도립 현미경에 부착된 컨포칼 레이저 스캐닝 헤드를 사용하여 20X 0.1 NA 공기 및 40X 1.0 NA 오일 대물렌즈를 사용하여 형광 이미지를 캡처합니다. Line Sequential leveling 버튼을 클릭하여 단일 평면 512 x 512 픽셀 이미지를 캡처합니다.각 결과에 대한 분석 및 데이터를 위해 섹션당 최소 10개의 시야를 확보합니다. 마이크로 원심분리 튜브의 절편을 염색하려면 관련 1차 항체를 200마이크로리터 부피로 추가하고 섭씨 4도에서 16시간 동안 샘플을 배양합니다. PBS에서 10분 동안 절편을 세 번 세척한 후 적절한 2차 항체를 추가하고 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.DAPI를 사용하여 용액의 폐 단면을 염색하고 PBS의 현미경 슬라이드 섹션에 커버 슬립을 추가하기 전에 샘플을 20분 동안 배양합니다. 405 나노미터, 440 나노미터, 473 나노미터, 543 나노미터 및 635 나노미터 레이저가 장착된 40X 1.3 NA 대물렌즈가 있는 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하고 최적의 Z 절편으로 0.54미크론 두께의 3D Z 스택을 기록합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 이미지를 분석합니다.BAL 샘플의 MET 예는 다음과 같습니다. 첫 번째로 감지할 수 있는 특징은 대략 구형의 초기 단계 MET에서 볼 수 있듯이 핵이 세포의 가장자리로 이동하는 것입니다. 그 다음에는 보다 성숙한 MET에서 볼 수 있듯이 H3Cit 및 과립 프로테아제와 같은 다른 동시 발현 매개체와 함께 세포 외 염색질이 뒤따릅니다.초기 단계의 MET는 왼쪽 상단에 있고 후반 단계의 MET는 이 아래 중앙을 향하고 있습니다. 폐 조직 MET가 이 그림에 나와 있습니다. 폐가 폐 구조를 정의하기 위해 액체로 부풀어 오르면 MET는 폐포 벽에 밀려 들어갈 것입니다.MET의 형태는 조직이 절단된 평면에 따라 달라집니다. 폐 조직 샘플에 사용되는 표준 절편은 두께가 4-5미크론입니다. 조직 절편이 두꺼워지면 여러 이미지를 촬영할 수 있으며 MET를 3D로 볼 수 있습니다.25 - 35 미크론 절편으로 절단된 쥐 폐 조직의 3D 이미지 예가 여기에 제시되어 있습니다. 이 기술을 마스터하면 이틀 동안 염색하고 적절하게 수행한다면 이미징으로 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 세탁을 부드럽게 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 자이모그래피와 같은 다른 방법을 수행하여 프로테아제 발현과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 염증성 대식세포 반응 연구를 위한 길을 열 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 컨포칼 현미경을 사용하여 MET를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.PLP로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 및 보안경 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

방법을 개별적으로 선택 조작 설명 및 이미지 라이브 병원균은 회전 디스크 현미경을 결합 광학 트랩을 사용하고 있습니다. 광학 트랩은 생물의 공간적 시간적 및 제어를 제공하며, 호스트 세포에 인접 장소. 형광 현미경은 세포에 최소한의 섭동와 역동적인 세포 상호 작용을 캡처합니다.

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

이 동영상에서는 쥐의 폐 조직에서 대식세포 세포외 트랩(MET)의 면역염색 및 컨포칼 현미경 기반 시각화를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 조직 상주 대식세포는 대식세포 특이적 F4/80 표면 당단백질 마커의 발현을 특징으로 하는 반면, MET는 MET 마커 매트릭스 금속단백분해효소 9, 시트룰린 히스톤 H3 및 세포외 염색질을 라벨링하여 시각화합니다.

Characterization of Macrophage Extracellular Traps in Mouse Lung Tissue Samples

이 동영상은 기관지폐포 세척액에서 기관지폐포 대식세포의 대식세포 외 트랩(METs)의 면역 라벨링과 컨포칼 현미경을 사용한 시각화를 보여줍니다.

Visualization of Extracellular Traps in Macrophages from Human Bronchoalveolar Lavage Fluids

이 동영상은 TNF-알파, PMA 및 HOCL과 같은 다양한 염증 자극을 사용하여 인간 단핵구에서 파생된 대식세포의 대식세포 외 트랩(MET)의 체외 자극을 보여줍니다. 이 비디오는 또한 시각화를 위한 MET의 SYTOX 염료 염색 방법을 보여줍니다.

In Vitro Stimulation and Visualization of Macrophage Extracellular Traps

우리는 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 대식세포에서 전례 없는 고해상도 phagosome formation 및 close를 3차원으로 시각화하는 실험 설정을 설명합니다. 이를 통해 phagocytic cup의 기저부, 확장된 pseudopods, phagosome scission의 정확한 위치를 모니터링할 수 있습니다.

&quot;Phagosome 폐쇄 분석은&quot;사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

호중구 세포 외 트랩 (NETs)은 자극 된 호중구 과립구에 의해 생성 된 3 차원 구조입니다. 최근 몇 년 동안 NET가 다양한 질병에 관여하고 있음이 분명해졌습니다. 조직에서 NET를 검출하는 것은 진단 관련성이 있을 수 있으므로 NET 성분을 라벨링하기 위한 표준화된 프로토콜이 필요합니다.

파라핀 내장 된 조직에서 인간과 뮤린 호중구 세포 외 트랩의 면역 형광 라벨링

여기에 제시된 프로토콜은 현미경 및 형광 염색을 사용하여 살아있는 세포 배양에서 대식세포 외 트랩(MET) 생산을 검출하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 면역형광 염색에 의해 특정 MET 단백질 마커를 검사하기 위해 더 확장될 수 있다.

분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

여기에 제시된 것은 시험관 내 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 유도 및 분석을위한 프로토콜입니다. DNA, 카텔리시딘(LL37) 및 효소 활성의 정량화는 유사한 통제 조건에서 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 구성 및 형태의 가변성을 보여주는 데이터를 산출했습니다.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 질병과 관련이 있으며, 면역형광은 종종 시각화에 사용됩니다. 그러나 다양한 염색 프로토콜이 있으며 많은 경우 한 가지 유형의 조직만 검사합니다. 여기서는 생쥐 및 인체 조직에서 NET을 염색하는 데 일반적으로 적용 가능한 프로토콜을 설정합니다.

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

학습하세요 대식세포 세포외 트랩을 공초점 현미경으로 시각화하는 방법을. 폐 샘플에서 면역 반응과 염증 연구에 활용할 수 있는 이 기법은 감염 대응 메커니즘 이해에 기여합니다.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

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