Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

본 절차의 전반적인 목표는 탈세포화된 폐 스캐폴드를 이용한 3D 배양 설정을 통해 마우스 배아 줄기 세포를 성숙한 기도 상피 세포로 분화시키는 것입니다. 이 방법은 폐 계통 분화 과정 중 세포 매트릭스 수축 및 성장 인자 신호 전달의 역할과 같이 폐 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정의된 무혈청 환경에서 3D 배양 시스템을 사용하며, 다른 내배엽 계통의 오염을 최소화하면서 견고한 기도 상피 분화를 달성한다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 성체 Wistar 랫드를 안락사시킨 후, 앞발과 뒷다리를 고정하여 동물을 해부면에 고정하고 70% ethanol을 사용하여 가슴과 복부를 분무합니다.흉곽 바로 아래에 절개선을 만듭니다.피부를 절개하여 횡격막을 노출시킵니다.그런 다음 횡격막에 작은 절개선을 내어 폐가 수축하게 함으로써 폐 천공 가능성을 줄입니다.다음으로 흉골을 따라 수직 절개선을 만들고 흉강을 열어 심장과 폐에 접근합니다.그런 다음 봉합사로 하대정맥을 결찰하고, 작은 해부 가위를 사용하여 좌심방에 작은 절개선을 냅니다.heparinized Hank's Balance salt solution이 채워진 25 gauge 바늘이 장착된 준비된 10ml 주사기를 사용하여, 바늘을 우심실에 삽입하여 폐 관류를 시작하고 완충액을 폐 순환계로 밀어 넣습니다.폐가 하얗게 변하고 좌심방에서 흘러나오는 액체가 투명해질 때까지 관류를 계속합니다.관류 후, 기관을 노출시키고 삽관을 위해 갑상연골 근처에 작은 절개선을 만듭니다.그런 다음 플라스틱 카테터로 기관을 삽관하고 봉합사를 사용하여 제자리에 고정합니다.이제 10ml 주사기를 레토르트 스탠드와 클램프에 고정하여 중력 관류 시스템을 구축합니다.그런 다음 주사기 플런저를 제거하여 버립니다.주사기 배럴의 최대 충전 지점을 폐에서 20 cm 위에 고정한 다음, 주사기 끝에 2방향 스톱콕을 부착하고 스톱콕의 다른 끝에 긴 플라스틱 튜브를 연결합니다.기관에서 카테터를 조심스럽게 끌어내어 플라스틱 튜브 끝에 연결합니다.그런 다음 탈세포화 용액을 주사기에 붓고 용액이 연결된 플라스틱 튜브와 카테터를 완전히 채우도록 합니다.용액이 채워진 카테터를 다시 기관에 넣고 1분 동안 총 폐용량까지 채워 폐를 세척(lavage)합니다.그런 다음 기관에서 카테터를 제거하여 액체가 폐에서 흘러나오게 합니다.탈세포화 용액으로 폐 세척을 8회 반복한 후, PBS로 10회 헹굽니다.세척 단계가 완료되면 폐는 하얗게 보일 것입니다.그런 다음 목과 흉강에서 기관과 폐를 적출합니다.식도와 심장을 포함하여 적출된 폐에서 불필요한 조직을 제거한 후, 바이브라톰(vibratome) 절편 제작 전까지 폐를 차가운 PBS에 옮겨둡니다.두꺼운 절편을 준비하려면, PBS에 2% 및 4% low melting point agarose를 각각 약 15ml 만들고, 모든 엽을 작은 직사각형 블록으로 임베딩하기에 충분한 6% agarose를 준비합니다.agarose를 15ml 튜브로 옮긴 후, 튜브를 히팅 블록에 올려 젤화되는 것을 방지하기 위해 온도를 40 degrees celsius 이상으로 유지합니다.작은 가위를 사용하여 각 엽기관지 끝에서 탈세포화된 폐를 절개하고 각 엽을 분리합니다.그런 다음 흡수 시트를 사용하여 과잉 PBS를 제거하고, 조직을 코팅하기 위해 엽을 히팅 블록 위의 2% agarose에 5분 동안 옮겨둡니다.각 엽을 페트리 접시에 옮긴 후, 접시를 콜드 플레이트에 올려 표면이 1분 동안 젤화되도록 합니다.엽을 4% agarose에 조심스럽게 넣고 5분 동안 배양 및 냉각시킨 후, 6% agarose로 코팅을 반복합니다.코팅 후, 금속 베이스 몰드를 사용하여 각 엽을 6% agarose에 개별적으로 임베딩하며, 가장자리부터 조직 주위를 최소 3ml의 agarose가 둘러싸게 합니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 조직의 가장 넓고 평평한 면이 실험자를 향해 금속 몰드 표면에 오도록 각 엽의 방향을 잡고, 플라스틱 카세트를 사용하여 임베딩을 완료합니다.바이브라톰 절편 제작 전, 콜드 플레이트 위에서 블록을 최소 30분 동안 젤화시킵니다.대안적으로, 바이브라톰 절편 제작 전 4 degrees celsius의 습윤 챔버에 블록을 최대 12시간 동안 보관합니다.절편을 준비하려면, 절단 챔버를 차가운 PBS로 채워 바이브라톰을 설정합니다.절단 내내 낮은 온도를 유지하기 위해 주변에 아이스 배스를 설치합니다.이제 금속 몰드에서 블록을 제거하고, 면도날을 사용하여 조직 가장자리에서 약 3 millimetres를 유지하면서 엽 주변의 과잉 agarose를 다듬습니다.접착제를 사용하여 조직을 시료 플레이트 중앙에 고정하고, 플레이트를 PBS가 채워진 절단 챔버에 담급니다.바이브라톰에 절단 날을 장착합니다.바이브라톰에서 각각 다음의 속도, 진폭, 두께 값을 선택하여 절단 경계를 설정합니다.각 엽을 완전히 절단하고, 절편들이 서로 완전히 분리되지 않은 경우 작은 가위를 사용하여 수동으로 절편을 잘라 분리합니다.그런 다음 스캐폴드 절편을 조심스럽게 수집하여 차가운 PBS로 옮깁니다.핀셋을 사용하여 주변 agarose로부터 각 절편을 조심스럽게 분리합니다.스캐폴드 절편을 오염 제거하려면, PBS에서 마이크로 원심 분리 튜브로 옮긴 후, PBS에 90 units per milliliter의 nuclease를 첨가하고 상온의 로테이터에서 12~24시간 동안 배양합니다.텍스트 프로토콜에 따라 절편을 새 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고, 멸균 조건 하에 항균 용액을 첨가한 후 상온의 로테이터에서 6시간 동안 배양합니다.그런 다음 멸균 조건 하에 PBS를 사용하여 스캐폴드를 2회 헹구고, 세포 파종 전 무혈청 배지(SFDM)로 옮깁니다.공기-액체 계면(air liquid interface) 배양을 설정하려면, 멸균 핀셋을 사용하여 소수성 막을 페트리 접시에 놓습니다.그런 다음 SFDM에서 각 탈세포화 스캐폴드 절편을 막 위로 옮기며, 절편이 막 위에 고르게 퍼지도록 합니다.웰에 각각 1ml 또는 0.5ml의 SFDM을 채워 6-웰 또는 12-웰 플레이트를 준비합니다.그런 다음 막을 웰 속에 조심스럽게 넣어 막이 배지 위에 뜨게 하여 공기-액체 배양 설정을 만듭니다.3D 스캐폴드에 파종하기 위해, 내배엽 세포 준비 및 형광 활성 세포 분류(FACS)를 통해 definitive endoderm를 농축한 후, 혈구계수기(haemocytometer)를 사용하여 분류된 세포 수를 측정합니다.그런 다음 세포를 400 Gs에서 5분 동안 원심 분리합니다.SFDM을 사용하여 펠렛화된 세포를 10ml 당 약 100,000 cells가 되도록 재부유시킵니다.