Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 탈세포화된 폐 골격으로 설정된 3D 배양을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포를 성숙한 기도 상피 세포로 분화시키는 것입니다. 이 방법은 폐 계통 분화 중 세포 매트릭스 수축 및 성장 인자 신호의 역할과 같은 폐 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정의된 무혈청 환경에서 3D 배양 시스템을 사용하고 다른 내배엽 계통의 오염을 제한하면서 강력한 기도 상피 분화를 달성한다는 것입니다. 성체 위스타쥐를 안락사시킨 후 텍스트 프로토콜에 따라 앞발과 뒷다리를 고정하여 동물을 해부 표면에 고정하고 70% 에탄올을 사용하여 가슴과 복부에 분사합니다. 흉곽 바로 아래에 절개를 만듭니다. 피부를 자르고 횡격막을 노출시킵니다. 그런 다음 횡격막을 통해 작게 절개하여 폐가 수축되도록 하여 폐에 구멍을 뚫을 가능성을 줄입니다. 그런 다음 흉골을 따라 수직 절개를 만들고 흉강을 열어 심장과 폐에 접근합니다. 그런 다음 봉합사로 하대정맥을 접합하고 작은 절개 가위를 사용하여 왼쪽 심방에 작은 절개를 놓습니다. 헤파린화된 행크스 밸런스 소금 용액으로 채워진 25게이지 바늘이 있는 준비된 10ml 주사기를 사용하여 바늘을 우심실에 삽입하여 폐 관류를 시작하고 폐순환을 통해 완충액을 밀어 넣습니다. 폐가 하얗게 변하고 좌심방에서 흐르는 액체가 맑아질 때까지 관류를 계속합니다. 관류 후 기관을 노출시키고 갑상선 연골 근처를 작게 절개하여 캐혈을 만듭니다. 그런 다음 플라스틱 카테터로 기관에 캐패닝을 하고 봉합사를 사용하여 제자리에 고정합니다. 이제 10ml 주사기를 레토르트 스탠드와 클램프에 고정하여 중력 관류 시스템을 설정합니다. 그런 다음 주사기 플런저를 제거하고 폐기합니다. 주사기 배럴의 최대 충전 지점을 폐 위 20cm에 고정한 다음 주사기 끝에 양방향 마개를 부착하고 마개의 다른 쪽 끝에 긴 플라스틱 튜브를 부착합니다. 기관에서 카테터를 부드럽게 당겨 플라스틱 튜브 끝에 부착합니다. 그런 다음 탈세포화 용액을 주사기에 붓고 용액이 부착된 플라스틱 튜브와 카테터를 완전히 채우도록 합니다. 용액이 채워진 카테터를 다시 기관에 삽입하고 1분 동안 총 폐활량까지 채워 폐를 세척합니다. 그런 다음 기관에서 카테터를 제거하여 액체가 폐 밖으로 흘러나오도록 합니다. 탈세포화 용액으로 폐 세척을 8회 반복한 다음 PBS로 10회 헹굽니다. 폐는 세척 단계가 완료되면 하얗게 보일 것입니다. 그런 다음 목과 흉강에서 기관과 폐를 절개합니다. 식도와 심장을 포함하여 절개된 폐에서 과도한 조직을 제거한 다음 진동 절편을 준비할 때까지 폐를 차가운 PBS로 옮깁니다. 두꺼운 단면을 준비하려면 PBS에서 약 15ml의 2% 및 4% 저융점 아가로스를 만들고 모든 로브를 작은 직사각형 블록에 삽입하기에 충분한 6% 아가로스를 만듭니다. 아가로스를 15ml 튜브에 옮긴 후 튜브를 열 블록에 놓고 겔화를 방지하기 위해 온도를 섭씨 40도 이상으로 유지합니다. 작은 가위를 사용하여 각 엽 기관지 끝에 있는 탈세포화된 폐를 절개하고 각 엽을 분리합니다. 그런 다음 흡수 시트를 사용하여 과도한 PBS를 제거하고 엽을 가열 블록의 2% 아가로스로 5분 동안 옮겨 조직을 코팅합니다. 각 로브를 페트리 접시에 옮긴 후 접시를 차가운 접시에 놓고 표면이 1분 동안 겔화되도록 합니다. 엽을 4% 아가로스에 부드럽게 넣고 5분 동안 배양하고 식힌 후 6% 아가로스로 코팅을 반복합니다. 코팅 후 금속 베이스 몰드를 사용하여 각 엽을 6% 아가로스에 개별적으로 삽입하고 가장자리에서 조직을 둘러싼 최소 3ml의 아가로스를 삽입합니다. 다음으로, 집게를 사용하여 조직의 가장 크고 평평한 가장자리를 실험자를 향하는 금속 주형의 표면에 배치하여 각 엽의 방향을 지정하고 플라스틱 카세트를 사용하여 임베딩을 완료합니다. 진동 절편 전에 최소 30분 동안 블록이 냉각판에서 젤화되도록 합니다. 또는 진동 절편 전에 섭씨 4도에서 최대 12시간 동안 가습 챔버에 블록을 보관하십시오. 섹션을 준비하려면 절편실을 차가운 PBS로 채워 비브라톰을 설정하십시오. 단면 전반에 걸쳐 차가운 온도를 유지하기 위해 주변에 얼음 수조를 설치하십시오. 이제 금속 주형에서 블록을 제거하고 면도날을 사용하여 조직 가장자리에서 약 3mm를 유지하면서 엽을 둘러싼 과도한 아가로스를 잘라냅니다. 접착제를 사용하여 조직을 표본 플레이트의 중앙에 고정하고 플레이트를 PBS로 채워진 절편 챔버에 담그십시오. 바이브라톰에 단면 블레이드를 로드합니다. 진동에서 단면 경계를 설정하고, 다음 속도, 진폭, 두께 값을 각각 선택합니다. 각 엽을 완전히 절단하고 섹션이 서로 완전히 분리되지 않으면 작은 가위를 사용하여 섹션을 수동으로 잘라냅니다. 그런 다음 비계 부분을 부드럽게 모아 차가운 PBS로 옮깁니다. 집게를 사용하여 주변 아가로스에서 각 부분을 부드럽게 제거합니다. 오염을 제거하려면 PBS에서 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후 PBS에 뉴클레아제 1밀리리터당 90단위를 추가하고 실온의 회전기에서 12-24시간 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 절편을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후 멸균 상태에서 항균 용액을 추가하고 실온의 회전기에서 6시간 동안 배양합니다. 그런 다음 무균 조건에서 PBS를 사용하여 골격을 두 번 헹구고 세포를 파종하기 전에 무혈청 배지(SFDM)로 옮깁니다. 공기 액체 계면 배양을 설정하려면 멸균 집게를 사용하여 페트리 접시에 소수성 멤브레인을 배치합니다. 그런 다음 SFDM의 탈세포화된 각 골격 절편을 멤브레인으로 옮겨 절편이 멤브레인에 고르게 퍼져 있는지 확인합니다. 웰에 각각 1ml 또는 0.5ml의 SFDM을 채워 6개 또는 12개의 웰 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 멤브레인을 웰에 부드럽게 배치하여 멤브레인이 매체 위에 떠 있도록 하여 공기 액체 배양을 설정합니다. 내배엽 세포(endodermal cell)의 준비 및 형광 활성화 세포 분류에 따라 3D 골격을 시딩하려면 최종 내배엽을 위해 농축하기 위해 혈구계를 사용하여 분류된 세포를 계수합니다. 그런 다음 5분 동안 400G에서 셀을 스핀다운합니다. SFDM을 사용하여 펠릿화된 셀을 10개 중 약 100, 000개의 셀로 다시 현탁합니다.