Name: Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 배우세요 마우스 배아줄기세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법을 3D 탈세포 폐 스캐폴드와 무혈청 배양 조건을 사용하여. 이 기술은 폐 발달 연구와 재생의학에 활용됩니다.

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우리는 그림 1-3에 묘사 된 실험에 사용 된 Nkx2-1의 mcherry의 ESC 박사 Rossant 박사 Bilodeau을 감사드립니다. FACS는 SickKids-UHN 유동 세포 계측법 시설에서 수행되었다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 및 혁신 캐나다 재단 인프라 보조금 (CSCCD)에서 보조금을 운영에 의해 지원되었다.

동물 실험은 아픈 어린이 연구소 대한 병원의 동물 관리위원회의 지침에 따라 수행 하였다. 1. 비계 준비 <ol><li> 폐의 탈세 포화 <ol><li> CO 2 챔버를 사용하여 성체 위 스타 래트를 안락사. 챔버에서 동물을 놓고 분당 챔버 체적 10-30 %의 충전 속도 100 % CO 2 노출을 시작합니다. <ol><li> 무의식에 대한 동물을 관찰; 이 약 2 ~ 3 분 후에 발생합니다. 의식이 기간에 발생하지 않으면, 속도 및 챔버 시일 채우기 확인. 무의식에 이어, 어두운 눈 색깔과 호흡 부족으로 동물을 관찰한다. 모두가 관찰되는 경우, 1 ~ 2 분 동안 CO 2 충전을 유지하고 다음 절차를 챔버에서 동물을 제거합니다. </li></ol></li><li> 앞발과 뒷발 다리를 고정하여 표면을 해부에 동물을 고정하고, 70 % 에탄올로 가슴과 복부 영역을 스프레이. 심장과 루 입구흉골을 따라 수직 절개를 이용하여 흉강을 열어 NGS. </li><li> 격막을 통해 작은 절개를 만드 먼저 폐 천공의 가능성을 감소, 폐는 수축하게한다. 봉합과 하대 정맥을 결찰 작은 해부 가위 좌심방의 작은 절개를 배치합니다. </li><li> 헤파린 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) (HBSS 10 U / ㎖ 헤파린)로 채워진 25 G 바늘 준비된 10 ㎖ 주사기를 사용하여 폐순환 통해 버퍼 밀어 우심실에 바늘을 삽입하여 폐 관류 시작 (2 ㎖ / 분의 속도로). 폐는 흰색 켜고 좌심방에서 흐르는 유체 분명히 실행 때까지이 절차를 계속합니다. </li><li> 관류 후, 갑상선 연골 근처 플라스틱 카테터와 기관 및 cannulate을 노출하고 봉합 제자리에 고정합니다. </li><li> 설치 레토르트 스탠드와 클램프에 10 ML의 주사기를 고정하여 중력 재관류 시스템. 제거하고 Discard 주사기 플런저. 폐 위 20cm에 주사기 배럴의 최대 충전 포인트를 고정합니다. 주사기의 끝 및 유관 기관에 탈세 포화 용액을 제공하기위한 콕 반대쪽 긴 플라스틱 배관에 양방향 콕을 부착. 주사기에 솔루션을 붓고 솔루션이 부착 된 플라스틱 튜브와 카테터를 입력 할 수 있습니다. <ol><li> 1 분 동안의 총 폐 용량 (약 12 ml)에 충전하여 폐 세척 유체 폐 밖으로 흐르게 기관에서 플라스틱 카테터를 제거한다. H 2 O의 20cm 아래에 압력을 유지하기 위해 폐 lavaging 때 주사기 10 개 이상의 ml에 기입하지 마십시오 </li></ol></li><li> 인산 완충 식염수 (PBS) 10 린스 하였다 여덟 번 탈세 포화 용액 폐 반복 세척. </li><li> 목과 가슴에 구멍이없는기도와 폐를 해부와 동물에서 분리합니다. vibratome 자체에 대한 준비까지 4 ° C에서 차가운 PBS에서 조직을 유지ctioning. </li></ol></li><li> 두꺼운 섹션 생성 <ol><li> 2 %의 약 15 ml의 (w / v) 아가로 오스 4 % 및 6 % 정도로 작은 직사각형 블록으로 모든 돌출부를 매립 (w / v) 아가로 오스를 준비한다. 은 전자 레인지로 PBS에 저 융점 아가로 오스 분말을 녹인다. 열 블록에 50 ㎖ 튜브에 아가로 오스를 전송하고 겔화를 방지하기 위해 40 ° C 이상 온도를 유지한다. </li><li> 작은 가위를 사용하여 각 로브 (뇌, 중앙, 액세서리, 그리고 꼬리 오른쪽 엽과 좌측 엽)을 분리하기 위해 각 엽성 기관지의 끝에서 decellularized 폐를 해부하다. 특허 초과 PBS를 제거하고, 2 %의 내부에 배치하는 흡수 시트를 사용하여 각각의 건조 엽 (W / V) 아가로 가열 블록에있다. </li><li> 페트리 접시에 배치, 아가로 오스의 코팅의 5 분 후 각 로브를 제거하고 표면은 냉각 판에 1 분 동안 겔 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 5 분 후, 다시 4 % (w / v) 아가로 오스로 멋진 로브를 배치하고, 6 % (w / v) 아가로 오스와 함께 한 번 더 코팅을 반복합니다. </li><li> 순차적 공동 후각 로​​브는 ating 가장자리에서 주변 조직 아가 적어도 3mm 금속베이스 몰드를 사용하여 6 % (w / v) 아가로 오스 별도로 각 로브를 포함. 오리엔트 각 로브는 실험자 대향 금형의 표면에서의 돌출부의 가장 큰 평평한 에지 위치로 집게를 사용. 이 날은 vibratome 절편에 대한 표본 플레이트에 고정 된 측면 될 것입니다. </li><li> 블록 전에 vibratome와 절편에 적어도 30 분 동안 냉각 판에 겔 할 수 있습니다. 4 ° C에서 최대 12 시간 동안 가습 실에 보관 블록은 이전 절편 vibratome합니다. </li><li> 설치 차가운 PBS (12)와 절편 챔버를 작성하여 vibratome. 주변의 얼음 목욕과 절편에 걸쳐 차가운 온도를 유지한다. 금형에서 블록을 제거하고 조직의 가장자리에서 약 3mm를 유지하면서, 로브를 둘러싼 초과 아가로 오스를 잘라하기 위해 면도날을 사용합니다. </li><li> 접착제를 이용하여 시료 판의 중심에 조직을 고정, 및 t에 접시 잠수함그는 절편 챔버를 PBS-가득합니다. 0.2 mm / 초, 1.85 mm, 및 350 ㎛의 : 각각 이하의 속도, 크기 및 두께의 값을 선택하여 vibratome에 경계가 설정 절편. 참고 : 로브 방향의 종 방향 및 횡 방향 모두 섹션이 허용됩니다. </li><li> 제 각각의 로브 완전히. 섹션 완전히 부 시퀀스의 마지막 날에 의해 분리되지 않는 경우 수동 절단 섹션 작은 가위를 사용하여 무료입니다. 부드럽게 발판 섹션을 수집하고 다음 단계까지 얼음에 PBS에 유의하십시오. 참고 : 생성 된 섹션은 근위 및 원위 폐 지역과 recellularization에 사용할 수있는 두 소스를 모두 포함한다; 그러나, 표면의 대부분은 말초 폐를 포함합니다. </li></ol></li><li> 비계 부분의 오염 제거 <ol><li> 마이크로 원심 튜브 (최대 30 섹션 / 튜브)에 PBS에서 350 마이크론 두께의 발판 섹션을 전송하고 클레아로 처리 (PBS에서 90 U / ㎖) (자료의 목록 참조) 12 -에 실온에서 24 시간,회 전자. </li><li> 클레아 제 처리 후, 새로운 마이크로 원심 튜브에 집게를 사용하여 회 전자에 실온에서 6 시간 동안 멸균 상태에서 (PBS 200 U / ㎖ 페니실린 스트렙토 마이신과 25 μg의 / ml의 암포 테리 신 B) 항균 용액으로 처리 전송 섹션. 참고 : 공사장 공중 발판은 사용하기 전에 일주까지 4 °에서 C에 대한 항균 솔루션에 저장할 수 있습니다. </li><li> 항균 용액으로 오염 제거 단계에 이어, 멸균 조건에서 두 번 PBS와 발판을 씻어 세포를 파종하기 전에 무료로 차별화 미디어 (SFDM)를 혈청에 전송합니다. </li></ol></li></ol> 2. 내배엽 세포 준비 <ol><li> 확실한 내배엽 유도 <ol><li> 2I 조건 (13)를 사용하여 피더 무료, 혈청 무료 문화에서 마우스 ESC 라인을 유지한다. 트립신에 의해 부착 만능 문화에서 세포를 제거하여 내배엽 유도를 시작합니다. </li><li> 20000의 밀도 SFDM 종자 세포를 재현 탁미디어의 변화없이 세포를 3 일 동안 낮은 부착 플레이트 / ㎖는 EB 형성을 허용합니다. </li><li> 사흘 부드럽게 10 ㎖ 피펫을 사용하여 50 ㎖로 원뿔형 튜브를 사채를 전송하고 실온에서 3 분 동안 바닥에 수집 할 수 있도록 한 후. </li><li> 조심스럽게 대기음 미디어와 추가 신선한 SFDM 미디어 50 NG / ㎖ 티빈 A. 보충 </li><li> 다시 1에서 낮은 부착 판 위에 종자 세포 : 세 가지 추가 일간 2 밀도와 문화가 결정적인 내배엽 분화를 달성했다. </li></ol></li><li> 확실한 내배엽 농축 <ol><li> 하루 6 사채를 수집 트립신 해리와 결합 된 형광 항체 (14)를 사용하여 C-KIT와 CXCR4 발현에 대한 레이블을 붙입니다. </li><li> 두 마커의 발현을 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 정렬 표지 된 세포를 풍부한 최종 내배엽 인구 (15)를 얻었다. </li></ol></li></ol> 3. R​​ecellularization 설치 <ol><li> 공기 - 액체 계면문화 설치 <ol><li> 멸균 집게를 사용 소수성 부동 막 (8 μm의 기공 크기)에 SFDM 각 decellularized 발판 섹션 (단계 1.2.9)를 전송합니다. 비계를 확인 섹션 막에 균일하게 확산됩니다. </li><li> 각각 SFDM의 1 또는 0.5 ml의에 우물을 작성하여 6 또는 12 웰 플레이트를 준비합니다. 부드럽게 공기 - 액체 배양 설정을 작성, 멤브레인 미디어의 상단에 떠 있도록 우물에 막을 배치합니다. </li></ol></li><li> 3D 비계의 시드 <ol><li> 최종 내배엽 마커 (단계 2.2.2)에 대한 다음 FACS는 혈구를 사용하여 정렬 세포를 계산 SFDM에서 5 분,에 resuspend 400 XG에 스핀 다운. 약 100,000 세포 / 10 μL / 골격을 함유하는 부피를 얻기 위해 세포를 재현 탁. </li><li> 직접 단계 3.1.2에서 각각의 준비 섹션에 피펫, 세포의 10 μl를 발판을 recellularize합니다. </li><li> 문화의 모든 48 시간을 SFDM 미디어를 교체합니다. 약간의 경사에 접시를 들고가 기존의 미디어를 대기음문화를 방해 방지 할 수 있습니다. 천천히 떠있는 막으로 가라 앉는 것을 방지하기 위해 잘의 측면을 따라 문화에 신선한 SFDM를 추가합니다. </li><li> 성숙한기도 상피 세포에 접종 세포의 분화를 달성하기까지 21 일 동안 공기 - 액체 문화를 유지한다. 주 : Recellularized 절 세포 배양 물 (16) 중 임의의 시점에서 조직 면역 염색법 (IF) 현미경을 위해 처리 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

선언 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 다른 보충제와 차별화를 직접 천연 폐 비계를 사용하여 성숙한 ESC 유래기도 상피 세포를 생성합니다. 이 문화의 설정은, 무 혈청, 저렴하고 재현성 정의된다. 기본 차별화 미디어의 어떠한 성장 인자 보충이 필요하지 않습니다. 줄기 세포 유래 폐 상피 세포를 생성 이전에 발행 된 방법은 혈통 제한 3,4,8,18,19을 촉진하는 성장 인자 보충과 2 차원의 전략을 사용하고 있습니다. 정의 배양 조건 기능성기도 세포 다른 내배엽 계통 (갑상선, 간, 췌장)에서 제한 오염 높은 분화 효율 및 3D 분화 미세 여기 기재된 기술을 포함한 여러 가지 이유로, 이러한 방법에 비해 유리하다. 이 기술은 마우스 유래 ECM과 유사한 결과를 얻을 수 있으므로, 마우스의 폐를 사용 decellularized 골격을 생성하기 위해 수정 될 수있다. 쥐 유래는 ESC는 최종 내배엽으로 분화이 프로토콜은 또한기도 상피 세포로 분화하여 비계에 시드. Dec...

폐 혈통에 만능 세포의 감독 차별화는 미세 1, 2에 정확한 신호 이벤트에 따라 달라집니다. 이 때문에 프로세스의 동적 특성으로는 시험 관내에서 폐 기관 형성 정확한 이벤트를 모방하는 도전되었다. 최근보고는 폐 분화 3-8을 달성하기 위해 이차원 문화 수용성 성장 인자로 보충 단계적 혈통 제한 전략을 이용했다. 단계적인 분화 프로토콜에서 다 능성 세포는 배아 줄기 세포 (ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포 여부를 먼저 최종 내배엽 세균 층으로 분화되었다. homeodomain을 포함하는 전사 인자의 발현 NKX2-1 의해 식별 내배엽 세포는이어서, 폐 전구 세포에 후 전방 내배엽 운명에 가압 하였다. 이러한 폐 전구 세포는 더 근위 (기도) 또는 원위부 (폐포) 폐 상피 세포 위스콘신에 차별화 된번째는 성장 인자 보충을 계속했다. 이러한 2 차원 전략 폐 상피 세포를 생성하는 약간의 성공이 있었다 그러나이 불분명 효율 다른 내배엽 계통의 오염 가능성, 3 차원 (3D) 구조의 부족 등 여러 제한이 있고, 일부 경우에 정의 문화 사용 혈청 보충과 함께. decellularized 폐 골격에 능성 또는 분화 세포의 배양은 점점 폐 상피 3,5,6,8,9 구조를 형성하는 시드 세포의 재생 가능성을 평가하기위한 분석법으로 사용된다. 이러한 보고서 문화는 계속 성장 인자 또는 혈청 보충과 비계에 세포를 파종. 폐 개발 환경 단서에 대한 응답으로 분할, 마이그레이션, 유전자 발현 및 개별 세포의 분화를 포함한다. 세포 외 기질 (ECM)는 구조적지지를 제공 할뿐만 아니라, tissu 지시 당 단백질의 격자 인통합하고 이러한 프로세스 10, 11를 조절하여 전자 형태 형성. 더 생체 폐 개발 환경을 모방 내배엽 배양 용 천연 플랫폼 폐 ECM 지지체를 사용함으로써 높은 효율과 재현성으로 설정 정의 된 3 차원 배양 세포 유래기도 상피 줄기 세포를 생성했다. 쥐의 폐 ECM의 발판이 생성 된 탈세 포화뿐만 아니라 마우스 ESC 유래 내배엽 세포에 의해 생성 이후에 이러한 지지체에 접종 하였다. CXCR4 &amp; C-KIT 단백질의 이중 표현은기도 (근위 폐) 전구 세포로 식별됩니다 SOX2 및 NKX2-1 식 모두에 긍정적 인 최종 내배엽 세포의 정체성과 세포를 나타냅니다. 확실한 내배엽 세포는 시험 관내에서 기능적인기도 상피 세포를 생성하는 데 최대 3 주가 용 공기 액체 경계면 (ALI)에서 배양 하였다. 이 프로토콜은 defini의 폐 계통의 분화를 촉진조기 NKX2-1 + / SOX2 + 초기 근위 폐 전구 세포의 출현으로 관찰 칠일뿐만적인의 내배엽. 하루 14 섬모를 포함 등장 문화 성숙한기도 상피 세포 인구의 21 (TUBB4A +), 클럽 (SCGB1A1의 +) 및 기저 (TRP63 +, KRT5 +) 기본 마우스기도에 대한 형태 학적 및 기능적 유사성을 가진 세포. 이 프로토콜은 상피 세포를기도 강인 분화를 달성하기위한 3 차원 매트릭스의 미세 환경의 중요성을 보여준다.

<table><tbody><tr><td><강한>시약</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>관류 용액</td><td>Sigma</td><td>H0777</td><td>10 U/ml 헤파린</td></tr><tr><td>관류 용액</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td>Hank의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS-)</td></tr><tr><td>탈세포화 용액</td><td>BioShop</td><td>CHA003</td><td>8&nbsp; mM CHAPS</td></tr><tr><td>탈세포화 솔루션</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td>25&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>탈세포화 솔루션</td><td>BioShop</td><td>SOD002</td><td>1&nbsp; M NaCl</td></tr><tr><td>탈세포화 용액</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease Novagen</td><td></td><td>70664-3</td><td>90&nbsp에 용해; U/ml 벤조나제 뉴클레아제&nbsp;</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td> PBS 항균 용액<td>에 희석됨</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>200&nbsp; U/ml 페니실린 스트렙토마이신</td></tr><tr><td>항균 용액&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290</td><td>25&nbsp; &뮤; g/ml 암포테리신 B</td></tr><tr><td>항균 용액&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td>는 PBS 트립신화<td>에 희석됨</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>TrypLE</td></tr><tr><td>무 분화 매체(SFDM)</td><td>Gibco</td><td>IMDM 2440-053, F12 11765-054</td><td>3:1 비율의 IMDM과 Ham' s modified F12 배지</td></tr><tr><td>무혈청 분화 배지(SFDM)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>B27 보충제(50배 희석)</td></tr><tr><td>무혈청 분화 배지(SFDM)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>N2 보충제(100배 희석)</td></tr><tr><td>무혈청 분화 배지(SFDM)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>0.05%(분획 V) 소 혈청 알부민</td></tr><tr><td>무 분화 배지(SFDM)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>200&nbsp; mM 글루타맥스</td></tr><tr><td>무 혈청 분화 매체 (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>4&nbsp; &뮤; M 모노티오글리세롤</td></tr><tr><td>세럼 무함유 분화 매체(SFDM)</td><td>Sigma</td><td>A4403&nbsp;</td><td>0.05&nbsp; mg/ml 아스코브산</td></tr><tr><td>내배엽 유도</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF</td><td>Activin A</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Mouse, non-conjugated, 1:100</td></tr><tr><td>C-KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>558163</td><td>Rat, PE-Cy7, 1:100</td></tr><tr><td>CXCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>558644</td><td>Rat, APC, 1:100</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab24647</td><td>토끼, 비활용, 1:1,000</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>토끼, 비활용, 1:200</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td><td>토끼, 비활용, 1:200</td></tr><tr><td>SCGB1A1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9772&nbsp;</td><td>염소, 비활용, 1:1,000</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>R& D 시스템</td><td>AF2018&nbsp;</td><td>염소, 비활용, 1:400</td></tr><tr><td>TRP63</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8431</td><td>마우스, 비활용, 1:200</td></tr><tr><td>TUBB4A</td><td>BioGenex</td><td>MU178-UC</td><td>마우스, 비활용, 1:500</td></tr><tr><td>염소 IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>동키, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>마우스 IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>동키, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>마우스 IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>당나귀, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td>토끼 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>당나귀, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>토끼 IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>동키, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td>Other Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low adherent plates</td><td>Nunc</td><td>Z721050&nbsp;</td><td>낮은 세포 결합 플레이트,&nbsp; 6 웰&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>공기-액체 인터페이스 멤브레인&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>110614</td><td>소수성 핵포어 막, 8&nbsp; &뮤; m 모공 크기</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S&nbsp;</td><td>라이카 비브라톰</td></tr><tr><td>티슈 접착제</td><td>Ted Pella</td><td>10033</td><td>Pelco 티슈 접착제</td></tr></tbody></table>

decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 esc 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

폐 혈통 차별화는 성장 인자 신호 전달, 세포 - 세포 상호 작용 및 세포 - 기질 상호 작용을 포함하는 복잡한 환경 단서의 통합이 필요합니다. 이 때문에 복잡성, 체외에서 폐 개발의 재현부는 도전 된 폐 상피 세포로 줄기 세포의 분화를 촉진합니다. 이 프로토콜에서, decellularized 폐 비계 줄기 세포 유래기도 상피 세포 폐의 3 차원 환경을 모방하고 생성하기 위해 사용된다. 마우스 배아 줄기 세포는 먼저 decellularized 지지체 상에 시딩 티빈 A를 내배엽 세포와 배아 체 (EB) 배양 방법을 이용하여 내배엽 계통으로 분화 최대 21 일 동안 공기 - 액체 계면에서 배양된다. 이 기술은 추가로 성장 인자를 보충하지 않고 작용기도 상피 세포에 접종 세포 (섬 모세포 클럽 세포 및 기저 세포)의 분화를 촉진한다. 이 문화의 설정이 정의되고, serum-무료, 저렴하고 재현성. 제한된 오염이 문화가 아닌 폐 내배엽 계통에서이 있지만,이 프로토콜은기도 상피 인구를 생성하고, 폐포 상피 세포에 상승을 제공하지 않습니다. 이 프로토콜 생성기도 상피는 폐 기관 형성 기간 동안 질병 모델링이나 낭포 성 섬유증과 같은기도 관련 병리의 약물 발견 플랫폼 세포 - 매트릭스 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 최종 내배엽의 강력한 차별화 상피 세포가 decellularized 폐 비계 부분에 씨앗을 품고 세포의 확장 된 문화를 사용하여 달성 될 수기도 성숙한합니다. decellularized 지지체는 (1) 숙주 세포가 완전히 제거되도록하는 것을 특징으로한다, (2) 세포 외 매트릭스 단백질 분화 지지체를 사용하기 전에 보존하는 것이 권장된다. 도 1a에 도시 된 바와 같이 탈세 포화는 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)과 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)로 조직 염색을 사용하여 평가 될 수있다. 도 1b에 도시 된 바와 같이, 고배율 주사 전자 현미경 (SEM) 비계의 분석은 숙주 세포 그대로 매트릭스 구조의 유무를 확인한다. 매트릭스 단백질 및 면역 인장 시험에 의한 잔존 지지체의 추가 특성화 preservat을 위해 수행 될 수있...

이 프로토콜은 효율적으로기도에게 상피 세포를 성숙 마우스 배아 줄기 세포 유래 최종 내배엽 지시합니다. 분화 기술은 정의 된 무 혈청 배양 환경에서, 폐 계통 사양을 직접 3 차원 decellularized 폐 지지체를 사용한다.

Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

본 절차의 전반적인 목표는 탈세포화된 폐 스캐폴드를 이용한 3D 배양 설정을 통해 마우스 배아 줄기 세포를 성숙한 기도 상피 세포로 분화시키는 것입니다. 이 방법은 폐 계통 분화 과정 중 세포 매트릭스 수축 및 성장 인자 신호 전달의 역할과 같이 폐 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정의된 무혈청 환경에서 3D 배양 시스템을 사용하며, 다른 내배엽 계통의 오염을 최소화하면서 견고한 기도 상피 분화를 달성한다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 성체 Wistar 랫드를 안락사시킨 후, 앞발과 뒷다리를 고정하여 동물을 해부면에 고정하고 70% ethanol을 사용하여 가슴과 복부를 분무합니다.흉곽 바로 아래에 절개선을 만듭니다.피부를 절개하여 횡격막을 노출시킵니다.그런 다음 횡격막에 작은 절개선을 내어 폐가 수축하게 함으로써 폐 천공 가능성을 줄입니다.다음으로 흉골을 따라 수직 절개선을 만들고 흉강을 열어 심장과 폐에 접근합니다.그런 다음 봉합사로 하대정맥을 결찰하고, 작은 해부 가위를 사용하여 좌심방에 작은 절개선을 냅니다.heparinized Hank's Balance salt solution이 채워진 25 gauge 바늘이 장착된 준비된 10ml 주사기를 사용하여, 바늘을 우심실에 삽입하여 폐 관류를 시작하고 완충액을 폐 순환계로 밀어 넣습니다.폐가 하얗게 변하고 좌심방에서 흘러나오는 액체가 투명해질 때까지 관류를 계속합니다.관류 후, 기관을 노출시키고 삽관을 위해 갑상연골 근처에 작은 절개선을 만듭니다.그런 다음 플라스틱 카테터로 기관을 삽관하고 봉합사를 사용하여 제자리에 고정합니다.이제 10ml 주사기를 레토르트 스탠드와 클램프에 고정하여 중력 관류 시스템을 구축합니다.그런 다음 주사기 플런저를 제거하여 버립니다.주사기 배럴의 최대 충전 지점을 폐에서 20 cm 위에 고정한 다음, 주사기 끝에 2방향 스톱콕을 부착하고 스톱콕의 다른 끝에 긴 플라스틱 튜브를 연결합니다.기관에서 카테터를 조심스럽게 끌어내어 플라스틱 튜브 끝에 연결합니다.그런 다음 탈세포화 용액을 주사기에 붓고 용액이 연결된 플라스틱 튜브와 카테터를 완전히 채우도록 합니다.용액이 채워진 카테터를 다시 기관에 넣고 1분 동안 총 폐용량까지 채워 폐를 세척(lavage)합니다.그런 다음 기관에서 카테터를 제거하여 액체가 폐에서 흘러나오게 합니다.탈세포화 용액으로 폐 세척을 8회 반복한 후, PBS로 10회 헹굽니다.세척 단계가 완료되면 폐는 하얗게 보일 것입니다.그런 다음 목과 흉강에서 기관과 폐를 적출합니다.식도와 심장을 포함하여 적출된 폐에서 불필요한 조직을 제거한 후, 바이브라톰(vibratome) 절편 제작 전까지 폐를 차가운 PBS에 옮겨둡니다.두꺼운 절편을 준비하려면, PBS에 2% 및 4% low melting point agarose를 각각 약 15ml 만들고, 모든 엽을 작은 직사각형 블록으로 임베딩하기에 충분한 6% agarose를 준비합니다.agarose를 15ml 튜브로 옮긴 후, 튜브를 히팅 블록에 올려 젤화되는 것을 방지하기 위해 온도를 40 degrees celsius 이상으로 유지합니다.작은 가위를 사용하여 각 엽기관지 끝에서 탈세포화된 폐를 절개하고 각 엽을 분리합니다.그런 다음 흡수 시트를 사용하여 과잉 PBS를 제거하고, 조직을 코팅하기 위해 엽을 히팅 블록 위의 2% agarose에 5분 동안 옮겨둡니다.각 엽을 페트리 접시에 옮긴 후, 접시를 콜드 플레이트에 올려 표면이 1분 동안 젤화되도록 합니다.엽을 4% agarose에 조심스럽게 넣고 5분 동안 배양 및 냉각시킨 후, 6% agarose로 코팅을 반복합니다.코팅 후, 금속 베이스 몰드를 사용하여 각 엽을 6% agarose에 개별적으로 임베딩하며, 가장자리부터 조직 주위를 최소 3ml의 agarose가 둘러싸게 합니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 조직의 가장 넓고 평평한 면이 실험자를 향해 금속 몰드 표면에 오도록 각 엽의 방향을 잡고, 플라스틱 카세트를 사용하여 임베딩을 완료합니다.바이브라톰 절편 제작 전, 콜드 플레이트 위에서 블록을 최소 30분 동안 젤화시킵니다.대안적으로, 바이브라톰 절편 제작 전 4 degrees celsius의 습윤 챔버에 블록을 최대 12시간 동안 보관합니다.절편을 준비하려면, 절단 챔버를 차가운 PBS로 채워 바이브라톰을 설정합니다.절단 내내 낮은 온도를 유지하기 위해 주변에 아이스 배스를 설치합니다.이제 금속 몰드에서 블록을 제거하고, 면도날을 사용하여 조직 가장자리에서 약 3 millimetres를 유지하면서 엽 주변의 과잉 agarose를 다듬습니다.접착제를 사용하여 조직을 시료 플레이트 중앙에 고정하고, 플레이트를 PBS가 채워진 절단 챔버에 담급니다.바이브라톰에 절단 날을 장착합니다.바이브라톰에서 각각 다음의 속도, 진폭, 두께 값을 선택하여 절단 경계를 설정합니다.각 엽을 완전히 절단하고, 절편들이 서로 완전히 분리되지 않은 경우 작은 가위를 사용하여 수동으로 절편을 잘라 분리합니다.그런 다음 스캐폴드 절편을 조심스럽게 수집하여 차가운 PBS로 옮깁니다.핀셋을 사용하여 주변 agarose로부터 각 절편을 조심스럽게 분리합니다.스캐폴드 절편을 오염 제거하려면, PBS에서 마이크로 원심 분리 튜브로 옮긴 후, PBS에 90 units per milliliter의 nuclease를 첨가하고 상온의 로테이터에서 12~24시간 동안 배양합니다.텍스트 프로토콜에 따라 절편을 새 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고, 멸균 조건 하에 항균 용액을 첨가한 후 상온의 로테이터에서 6시간 동안 배양합니다.그런 다음 멸균 조건 하에 PBS를 사용하여 스캐폴드를 2회 헹구고, 세포 파종 전 무혈청 배지(SFDM)로 옮깁니다.공기-액체 계면(air liquid interface) 배양을 설정하려면, 멸균 핀셋을 사용하여 소수성 막을 페트리 접시에 놓습니다.그런 다음 SFDM에서 각 탈세포화 스캐폴드 절편을 막 위로 옮기며, 절편이 막 위에 고르게 퍼지도록 합니다.웰에 각각 1ml 또는 0.5ml의 SFDM을 채워 6-웰 또는 12-웰 플레이트를 준비합니다.그런 다음 막을 웰 속에 조심스럽게 넣어 막이 배지 위에 뜨게 하여 공기-액체 배양 설정을 만듭니다.3D 스캐폴드에 파종하기 위해, 내배엽 세포 준비 및 형광 활성 세포 분류(FACS)를 통해 definitive endoderm를 농축한 후, 혈구계수기(haemocytometer)를 사용하여 분류된 세포 수를 측정합니다.그런 다음 세포를 400 Gs에서 5분 동안 원심 분리합니다.SFDM을 사용하여 펠렛화된 세포를 10ml 당 약 100,000 cells가 되도록 재부유시킵니다.

generation-esc-derived-mouse-airway-epithelial-cells-using

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 decellularized의 폐를 세포외 기질 및 기능 폐 조직을 생성하는 데 사용할 수있는 소설 biomimetic 생물 반응기를 개발했습니다. 생물 반응기에서 매트릭스와 culturing에 세포를 시딩함으로써, 우리는 시간의 짧은 기간에 대한 생체내에 이식하면 효과 가스 교환을 보여주는 조직을 생성합니다.

룽 공학을위한 절차

이 비디오에서는 조직 공학 응용 분야를 위해 생화학적 구조와 구성이 보존된 탈세포화된 돼지 식도 골격을 준비하는 방법을 보여줍니다.

Decellularized Porcine Esophageal Scaffold Preparation: A Technique: A Techniques to Generate Acellular Scaffold from a Pig Esophagus (탈세포화된 돼지 식도 골격 준비: 돼지 식도에서 무세포 골격을 생성하는 기술)

전체 장기 탈세포화는 재생 의학에 사용될 수 있는 자연적인 생물학적 골격을 생성합니다. 폐 재생의 비인간 영장류 모델에 대한 설명이 제시되는데, 이는 전체 폐가 탈세포화되고 성체 줄기 세포와 내피 세포를 파종하여 혈관 순환과 액체 매체 환기를 촉진하는 생물 반응기에 파종되는 것입니다.

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화)

이 프로토콜은 마우스의 심장과 폐를 탈세포화하는 것을 목표로합니다. 생성된 세포외 매트릭스(ECM) 스캐폴드는 면역염색및 이미지화되어 구성요소의 위치와 토폴로지를 매핑할 수 있다.

뮤린 심폐 복합체의 탈세포화

이 기사는 근접성 및 말단 상피 폐 세포를 메센키메와 함께 포함하는 3차원 전체 폐 오르가노이드로 유도된 다능성 줄기 세포의 단계 현명한 분화를 설명합니다.

폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성

이 프로토콜은 탈세포화된 정밀 절단된 폐 조각을 폐포 상피 유형 2 세포, 섬유아세포 및 내피 세포로 재채움으로써 재현 가능한 소규모 조작된 폐 조직을 생성하는 방법을 설명합니다.

탈세포화된 폐 조각으로 제조된 조작된 폐 조직

이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

인간 유도 만능 줄기 세포 분화 프로토콜의 최근 발전은 기관 특이적 세포 유형의 단계적 유도를 허용한다. 여기에서, 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포의 유지 및 확장과 공기-액체 계면 배양물에서 점막 상피로의 분화를 위한 상세한 단계를 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

이 논문에서는 공기-액체 계면 배양에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 폐 상피, 중간엽, 내피 세포 및 대식세포로 구성된 복잡한 다세포 기도 장벽 모델의 생성에 대해 설명합니다.

폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

이 논문은 탈세포화(decellularization) 및 재세포화(recellularization) 방법을 사용하여 생체공학적 마우스 폐를 만드는 방법을 설명합니다. 또한 후속 정소성 폐 이식에 대해서도 자세히 설명합니다.

탈세포화된 마우스 폐와 1차 인간 내피 세포를 이용한 생체공학적 폐 이식

배우세요 마우스 배아줄기세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법을 3D 탈세포 폐 스캐폴드와 무혈청 배양 조건을 사용하여. 이 기술은 폐 발달 연구와 재생의학에 활용됩니다.

Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

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