Name: 생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 학습하세요 지지된 지질 이중층에서 MinD와 MinE 단백질의 자가 조직화 패턴 형성 방법을. 형태적 제약 조건 하에서 막 역학을 연구하여 세포 생물학 및 생물물리학 연구를 발전시키는 데 활용할 수 있습니다.

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우리는 마이클 Heymann 감사 하 고 실리콘의 생산에 대 한 프랭크 Siedler 웨이퍼, 단백질 정화와 사이먼 Kretschmer에 핵심 시설 MPI-B와 레온 해 링 턴 원고에 대 한 의견.

<ol><li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li>
<li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ParA%2FMinD+family+puts+things+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li>
<li>Shih, Y. -L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li>
<li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li>
<li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li>
<li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li>
<li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli%3A+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li>
<li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+Escherichia+coli%3A+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949(2014).</li>
<li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+biological+surfaces%3A+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MipZ%2C+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758(2014).</li>
<li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li>
<li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li>
<li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271(2016).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li>
<li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE%27s+membrane+targeting+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582(2017).</li>
<li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li>
<li>Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li>
<li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li>
<li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li>
<li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845(2018).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116(2013).</li>
<li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li>
<li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis%3A+fabrication%2C+system+setup%2C+and+operation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21545286">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li>
<li>Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li>
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저자는 공개 없다.

우리는 설명 하는 프로토콜 평면에 MinCDE 자기 조직화의 생체 외에서 재구성 지원 지질 bilayers 및 지질 bilayer 적용 3 차원 구조, 막대 모양의 PDMS 마이크로 구조의 예를 사용 하 여. 이러한 분석에서 중요 한 데이터를 얻기 위해 제어에 가장 중요 한 요소는 단백질 및 막 품질.
단백질, 단백질 품질을 보장 하기 위해 질량 SDS 페이지와 질량 분석을 사용 하 여 확인 한다. 또한, 그것은 단백질은 가용성과 하지 집계 분석 젤 여과 또는 동적 산란을 사용 하 여 확인 되어야 한다. 젤 여과 단백질의 모든 집계 분수를 제거 하려면 사용할 수 있습니다. 주의 깊은 pH 조정 및 추가 된 뉴클레오티드의 품질은 매우 중요, 단백질 비 조정 또는 부분적으로 저하 된 뉴클레오티드의 추가 주식 또는 자체 조직 분석 실험 단백질 활동, 따라서 폐지를 제거 하기에 충분 자기 조직입니다.
단백질 품질, 옆 막 품질이 가장 중요 한, 그리고 부적 절 한 막 형성은 가장 종종 결함이 자기 조직과 artefactual 표면 구조의 기원에 대 한 원인.
처음으로 프로토콜을 수행할 때 낮은 어 금 니 비율에서 Atto-655-마약 등 DiI 레이블이 지질 (0.05%)를 포함 하 여 지원된 지질 bilayers를 도움이 됩니다. 따라서 속성 및 막의 품질 수 판단 직접. FRAP를 사용 하 여 막의 유동성 평가 될 수 있다. 서 있을 것입니다 중 하나 너무 많은 소포, 아니 유체 막 또는 아무 막, 떨어져 세척 되는 경우 또한, 하나 직접는 SLB의 세척의 품질을 평가할 수 있습니다. 오픈 챔버 접근 방식은 엄격 하 게, 막 씻어 수 그리고 그러므로 또한 소포는 SLB의 표면에 고정을 제거 하. SUV 크기와 크기 분포를 사용 하 여 도움이 될 수는 청소와 화란 지원 표면 및 올바른 크기의대 수의 유체 및 균질 성 지원된 지질 bilayers는 얻기 위해 가장 중요 한 요인 동적 빛 비 산. 좁은 크기 분포에 대 한 그들을 sonicating 보다는 소포를 압출 하는 것이 좋습니다. 다른 방법 청소 coverslips, 강한 기초, 기본 세제, 또는 coverslips를 사용 하 여 직접 물으로 rinsing 후 치료 예를 들어, 응용 프로그램 및 지질 혼합물에 따라 좋은 결과 얻을 수 있습니다.
여기, 오픈 실에서 평면 지원된 지질 bilayers에 생체 외에서 재구성에 제시 된 프로토콜의 첫 번째 절반 표면 TIRF 현미경30, FRAP 같은 광학 microscopies 위한 렌더링의 이점이 있다 분석6,34, 원자 힘 현미경 검사 법26같은 표면 감지기 기술을 추적 단일 입자. 큰 균질 지역 정의 된 농도에서 더 나은 통계 수 있습니다. 또한 오픈 챔버 접근 단백질 농도 및 구성 요소 추가, 따라서 적정 단일 챔버20에 단백질 농도를 허용에 대 한 신속 하 고 간단한 추가 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 분석 결과 또한 FtsZ22,35, ZipA22 또는 공상 단백질 FtsZ YFP MTS10,35같은 다른 세균성 divisome 구성 요소를 추가 하 여 확장할 수 있습니다.
다른 그룹 분 시스템에는 생체 외에서오픈 챔버17,,1819대신 사용 흐름-셀 재구성에 유사한 접근 방식을 갔다. 흐름 세포 특정 이점이 있다, 특히 때 완전히 동봉 된 3D 환경 필요한18흐름17,,1923 의 영향 인지 MinCDE 패턴에 막 구성23 조사, 또는 단백질 패턴 제한 조건19단백질에서 관찰 될 경우. 그럼에도 불구 하 고, 분자 농도의 로컬 제어는 더 어렵습니다. 막 단백질 구성 요소, 특히 마음에 의하여 강하게 바인딩할 그들은 먼저18,19발생. 우리의 경험에서는, 단백질은 자주 튜브, 후미, 주사기 및 다른 미세 부품 비 특정 바인딩 전시. 따라서, 지방 단백질 농도 다 입력된 농도18 를 또한19다른 사람에 의해 관찰로 입구와 출구 사이 막에 다른 단백질 패턴의 다양 한 결과 흐름 셀의 길이에 따라 달라.
프로토콜의 절반 여기, 막대 모양의 마이크로 구조 다시 지질 적용 패턴된 지원에 오픈 챔버 방식을 사용 하 여에서 생체 외에서 재구성에 제시 된 두 번째 bilayers vivo에서 단백질 동작의 단순한 모방에 대 한 허용 비록 단백질 농도 정밀 하 게 제어 버퍼 제거 손실입니다. Note는 MinDE의 파장은 대략 1 개의 크기 순서 때문에 더 큰 생체 외에서 vivo에서 막대 모양의 microcompartments는 또한 1 개의 크기 순서 더 큰 (10 x 30 µ m) 막대 모양의 대장균 보다에 대 한 셀.
전반적으로,이 프로토콜 단백질 농도, 막 속성, 버퍼 구성 등 모든 조건 정밀 하 게 제어할 수 있습니다. 3 차원 구조적된 지원 사용 vivo에서 복잡 한 마이크로 장비에 대 한 필요 없이 행동을 흉내 낸 공간 감 금에서 공부를 반응이 있습니다.

Spatiotemporal 패턴 자연, 다세포과 세포 수준에, 통제 세포 분열1,2morphogenesis에서 복잡 한 작업을 모두 조절에 필수적입니다. 반응 유포 시스템 이러한 패턴을 수립에 중요 한 역할 하지만 아직도 잘 이해 된다. 반응 유포 시스템 그리고 최고의 특징이 생물학적 시스템의 대표적인 사례는 지금까지 대장균 MinCDE 시스템3,,45,6,7입니다. MinCDE 시스템 대장균 미래 사단 사이트로 셀의 가운데를 확인 하기 위해 장 대 셀에 셀 극에서 진동. 이 시스템은 ATPase 마음, 광산, 및 공간 반응 매트릭스8로 막 단백질을 활성화 ATPase 기반으로 합니다. MinC는 패턴 형성 메커니즘의 일부 이지만 실제 기능 에이전트: 주요 divisome 단백질 FtsZ5,6의 억제제. MinC 마음에 바인딩하고 따라서 다음과 같이 진동, 셀에서 최대한 이며 셀 중간에 최소한의 시간 평균 단백질 농도 기온 변화도 결과로 midcell9,10에서 유해를 FtsZ 허용 . MinCDE 시스템 위치를 수송 하는 단백질 복합물11 및 플라스 미드12 와 셀을 규제에 대 한 박테리아2, spatiotemporal 조직에 중요 워커 A ATPases의 가족의 일부입니다. 부문13 와 염색체 분리14. 따라서, MinCDE 반응 확산 시스템 뿐만 아니라 원형 반응-보급 시스템 나타내지만 또한 박테리아에 spatiotemporal 조직에 대 한 그것의 관련성 때문에 관심을 끌었다 있다.
MinCDE 시스템에는 vivo에서 의 상세한 기능 연구는 복잡 한, 단백질 및 유전자 삭제의 조작 일반적으로 세포 분열 결함 발생. 또한, 막 구성 또는 vivo에서 cytosol의 속성을 변경 하는 것은 매우 도전적인15,16. 시스템 및 요소에 영향을 미치는 변경 경우 세포 분열으로 같은 필수적인 기능에 방해 되는 셀의 복잡 한 환경에서 더욱 그렇게 해석 하는 하드 있다. 우리와 다른 그러므로 아닙니다 생체 외에서 재구성 접근, 시스템의 핵심 구성 요소에 감소: 마음, 에너지 원으로 ATP와 반응 매트릭스6,17, 로 지원된 지질 bilayer 내 18.이 상향식 접근 방식을 자세히 복잡 하지 않고 살아있는 세포의 자기 조직화의 메커니즘을 수 있습니다. 여행 표면 단백질 양식 파도6 와 다른 종류 패턴17,19 이러한 조건 하에서 파장으로는 비보에보다 큰 크기에 대 한 일반적으로 이기는 하지만. 개방 챔버를 사용 하 여 용이 하 게 정밀 하 게 제어할 패턴 형성에 영향을 미치는 모든 측면: 단백질 농도6, 단백질 속성20, 막 구성10, 버퍼 구성, 및 ATP 농도 6, 뿐만 아니라 대리인21 와 다른 divisome 단백질22를 크롤 링 하는 등 다른 요인의 추가. 비교에서는, 흐름 셀18,,1923 에 MinCDE 시스템의 생체 외에서 재구성 프로브 흐름17,23, 단백질의 영향을 사용할 수 있습니다. 제한 조건19, 막 구성19 와 단백질 패턴에 풀 3D 감18 하지만 단백질/구성 요소 농도 및 순차적 구성 요소 또한 훨씬 더 복잡 한 컨트롤을 렌더링 합니다.
우리는 하나 어떻게 기하학적 경계 영향 패턴 형성21, 최근에 현상을 프로브 수 있습니다 평면 지질 bilayers의 지원 또한 모방이 오픈 챔버를 사용 하 여, 또한 조사 되어 vivo에서 박테리아를 사용 하 여 마이크로 구조7으로 성형. 우리 또한이 분석 결과 내에서 어떻게 정의 된 돌연변이 조사 시스템20의 영향을 패턴 형성 고용. 또한, 동일한 기본적인 분석 결과 형식 빛, 분석 결과에 아조 가교 된 광산 펩 티 드를 소개 하 고 TIRF 현미경24이미징 패턴 형성을 제어 하는 방법은 조사 하 고용 하고있다.
우리는, MinDE 패턴을 복제 하기 위해 형성 관찰 vivo에 는 체 외에서 시스템, 감 금 했다 키 발견. MinDE 극-극 진동 및 단백질 그라데이션 형성 의 재구성을 허용 지원된 지질 bilayer와 입은 MinDE에서 생체 외에서 (10 x 30 µ m)의 더 큰 파장을 조정 하는 크기와 막대 모양의 microcompartments를 사용 하 여 10,25. 이 분석 결과에 지원된 지질 bilayers는 위에 열려 있는 막대 모양 microcompartments의 몇 백 복제본을 포함 하는 꽃무늬 PDMS 기판에 입금 됩니다. 이것에 의해, 반응 챔버를 오픈에서 설정할 수 있습니다 그리고 이후에 버퍼 microcompartments, 그로 인하여 수감 작은 볼륨에 대 한 반응의 가장자리를 인하 됩니다. 이러한 구획 한쪽에 어 버퍼 인터페이스 있고 따라서 막 풀 3D 감 변하지 않습니다, 비록 단백질 역학 유사 진동10,25 vivo에서 . 풀 3D 감 금에 비해 매우 유사 하 게 보여 주는 결과18, 오픈 마이크로 구조 분석 결과 비교적 간단 하 고 쉽게 처리 하 고 또한 하지 전문된 마이크로 장비를 갖춘 실험실에 의해 수행할 수 있습니다 및 클린 룸 시설입니다.
여기, 우리 현재 MinCDE 패턴 형성에 지질 bilayers에서 지원 체 외에서 광학 현미경에 의해 그리고, 미성년자의 모든 구성 요소와 쉽게 액세스 제어 허용 하는 오픈 챔버를 사용 하 여 재구성 하는 실험 프로토콜 수정, 표면 조사 기법26에 대 한 적응도. 평면 지원된 지질 bilayers 옆 우리는 또한 단백질 감 수 어떻게 표시 막대 모양의 PDMS 마이크로 구조에 간단한 패턴된 지원된 지질 bilayers를 사용 하 여 얻을. 이 분석 실험, 비록 MinCDE 시스템에 최적화 된 옮겨질 수 있다 또한 FtsZ27 등 최소한의 걸 피28막과 유사한 방식으로 상호 작용 하는 다른 단백질 시스템.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polar lipid extract</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-triphosphate disodium salt trihydrate</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5&prime;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세테이</td>트 <td>머크 밀리 포어</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>황산 98 %</td> <td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 50 %</td> <td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드 (DMSO)</td> <td>머크</td><td>102950</td><td>우바솔</td></tr><tr><td>글리세롤 86 %</td> <td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소 프로필 &beta; -D-1- 티오 갈락 토피라노 시드 (IPTG)</td> <td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>, Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 아가 로스</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>다우 코닝 공사</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS crosslinker</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 및 #63 모두 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; </td><td>PDMS 미세 구조</td>0.5 ml 반응 튜브에만 사용되는 ser <td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>0030123301</tr><tr><td>배양 플라스크 2L</td><td>Corning</td><td>예: 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>겔여과 칼럼: HiLoad Superdex 75 PG 또는 200PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG 탈염 칼럼 사전 포장 칼럼</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>투석 장치: Slide-A-Lyzer 투석 카세트, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL 또는 0.5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 또는 66330</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrapure: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 단백질 정제 시스템: &Auml; kta 퓨어</td>, <td>GE 헬스케어, 생명 과학</td> 수조, <td></td><td></td></tr><tr><td>초음파 처리기</td><td>, 브랜슨,</td><td></td><td>예: 모델 1510</td></tr>, <tr><td>ARE-250 믹서</td>, <td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 플라즈마 세척기, Zepto</td><td>Diener, 전자</td><td></td><td>제품, 공정 가스로 산소,</td></tr><tr><td>용적식 변위, 피펫,</td><td>브랜드</td><td></td>: <td>Transferpettor, 모델(유리 팁</td></tr> <tr><td>포함)LSM780 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Zeiss Zeiss</td><td></td><td>C-Apochromat 40X/1.20 수침 대물</td></tr><tr><td>렌즈Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>세포 및 분자 생물물리학과, 생화학의 MPI, 수</td>율 pET28a-His-MinE<td>를 개선하기 위해 His-MinD 및 태그가 지정되지 않은 MinE를 인코딩</td>하는 Schwille <td></td> 플라스미드 교수</tr><tr><td></td><td>세포 및 분자 생물 물리학과, 생화학 MPI,</td><td></td><td>His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>세포 및 분자 생물 물리학과, 생화학 MPI,</td><td></td><td>His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>세포 및 분자 생물 물리학과, 생화학 MPI, Schwille</td><td></td><td>플라스미드 인코딩 교수 His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinC</td><td>세포 및 분자 생물 물리학과, 생화학 MPI, His-MinC를 인코딩하는 Schwille</td><td></td><td>플라스미드</td> 교수</tr></tbody></table>

생체 외에서 자가 지원된 지질 bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

셀의 기본 spatiotemporal 조직의 여러 측면 반응 유포 형식 시스템에 의해 규율 됩니다. 이러한 시스템의 재구성 생체 외에서 가능 하지 않을 것 이라고 그들의 기본 메커니즘의 상세한 연구에 대 한 허용 vivo에서. 여기, 우리는 생체 외에서 의 대장균, 셀 중간에는 세포 분열 심장 MinCDE 시스템의 재구성에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 분석 결과 구성 요소만 자기 조직에 필요한 즉 막, 두 단백질 마음 및 광산 및 ATP의 형태로 에너지를 공급 하도록 설계 되었습니다. 우리는 그러므로 지원된 지질 bilayer 형성 되는 coverslip에 오픈 반응 챔버를 조작. 챔버의 오픈 디자인 지질 bilayer의 최적의 준비 및 대량 콘텐츠 제어 조작에 대 한 수 있습니다. 두 단백질, 마음 및 광산,으로 ATP, 다음 막 위에 대량 볼륨에 추가 됩니다. 영상은 디자인 지원 confocal, 넓은 필드와 비슷하게 TIRF 현미경으로 많은 광학 microscopies에 의해 가능 하다. 프로토콜의 변이에서 지질 bilayer는 셀 모양의 PDMS 마이크로 구조, 유리 대신에 패턴된 지원에 형성 된다. 이 구획의 가장자리에 대량 해결책을 낮추는 작은 구획에는 반응의 포함 하 고 vivo에서 진동 동작의 흉내 낸 수 있는 경계를 제공 합니다. 함께 찍은, 우리 설명 MinCDE 시스템 모두와 함께 공간 감 금 없이 다시 구성할 프로토콜 연구원은 정확 하 게 농도 범위 등 다른 요인의 추가 패턴 형성에 영향을 미치는 모든 측면을 제어할 수 있도록 또는 단백질, 그리고 체계적으로 비교적 간단한 실험 설치 프로그램에서 시스템의 복잡성을 증가.

단백질 정화 우리의 프로토콜에 따라 적절 한 순도의 분 단백질 항복 한다. 참고로, 그림 1 붙일 마음, 광산, 그리고 MinC 이라는 마음의 SDS 페이지 이미지를 제공 합니다. 꽃무늬 비 지원된 지질 bilayers에 MinDE 자기 조직 분석 결과 수행 하는 절차의 각 단계는 그림 2에 설명 되어 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 표면 파를 여행 하는 일반 MinDE 챔버 (그림 3)에 걸쳐 관찰할 수 있습니다. 파장은 챔버 내에서 약간 다를 수 있습니다 하지만 일반적 패턴 유사. 챔버의 가장자리 형태 UV 접착제에는 유리에 보다 다른 특성을가지고 것 막 표면 ( 그림 3C참조)으로 양적 비교를 위해 사용할 수 없습니다. (그림 3B) 전파 방향에 따라 강도 그려서 여행 표면 파를 분석할 수 있습니다. 마음 형광 파의 앞 가장자리에서 오히려 빨리 정점 다음 후행 가장자리에서 급격히 감소, 동안 광산 형광 마음 물결의 시작부터 거의 선형으로 증가 하 고 후행 가장자리에 마음 후 최대에 도달 어디 그것 6현저 하 게 떨어져 떨어진다.
단백질 품질 옆 지원된 지질 bilayers의 품질이 MinCDE의 일반 자기 조직에 대 한 가장 중요 합니다. 한 손으로 막 너무 지나치게 씻어 또는 기본 표면 청소 되었고 따라서 너무 강하게 충전, 구멍 형성할 수 있습니다 멤브레인 (그림 6A, 상단). 다른 한편으로 막 제대로 세척 되지 또는 기본 표면 청소/hydrophilized 하지 않습니다, 경우 소포 막에 붙어 것입니다 또는 막 유동성 위험 해질 것 이다 (그림 6A, 하단). 비록 하지으로 명백한 레이블이 지질 통해 직접 막 관찰 하는 경우 이러한 문제 수 또한 검출 될 마음 형광 신호에서 패턴은 일반 고는 맥시 마에 형광 균일 하지만 "구멍"를 포함 하거나 그림 6A의 중간 패널에 표시 된 밝은 명소.
막대 모양의 PDMS 마이크로 구조에서 MinDE 자기 조직에 대 한 절차는 그림 4에 요약 됩니다. 몇 가지 프로토콜 단계 필요가 없습니다 반복 될 것으로 단백질과 지질을 다시 사용할 수 있습니다. 처럼 비 패턴이 기판에 기판 청소 (플라즈마-청소)에 의해 hydrophilized, 지원된 지질 bilayer는 PDMS에 형성 되 고 자기 조직 분석 결과 200 µ L의 볼륨에 설정 되어. 적절 한 막 형성 하고있다 MinDE 자체 막에 구성 확인에 실은 몇 군데. 적절 한 막 형성 되었습니다, MinDE 양식 일반 개별 마이크로 구조 사이 PDMS의 표면에 표면 파를 여행 하 고 또한 자체 구성 마이크로 구조는의 밑에 파도 자유롭게 할 수 있는 전체를 통해 이동 막으로 덮인 표면 (그림 5A). 버퍼 제거 후, 구획 사이 표면 해야 보여주지 전파 MinDE 패턴 (그림 5B), 그것은 완전히 건조 되어야 합니다. MinDE 패턴은 여전히 이동, 더 많은 버퍼를 제거 해야 합니다. 막 입은 PDMS와 상위 인터페이스 (그림 5C), 있는 그들은 자기 조직에 공기 단백질은 이제 막대 모양 microcompartments에 국한 됩니다. 이러한 조건 하에서 두 가지 단백질 그림 5D와 같이 극-극 진동 수행할 수 있습니다. 마음과 나의 일부분은 항상 막 도약, 또한 버퍼 제거 하는 동안 버퍼 제거 후 농도 없습니다 입력 농도 비교. 이 효과 농도 또한 다 같은 coverslip에 개별 마이크로 구조 사이 그들은 버퍼 제거 하기 전에 패턴의 위치에 따라. 실리콘 웨이퍼 생산 또는 실리콘 웨이퍼에서 PDMS 조형 분석 (그림 6B)에 대 한 사용할 수 없는 불완전 한 마이크로 구조에서 발생할 수 있습니다. 또한, 버퍼 때문 제거 마이크로 구조 그리고 과정에서 건조 수 있습니다 따라서, 추가 분석 (그림 6B)에서 제외 해야 합니다. 결과적으로 한 챔버에 마이크로 구조의 일부 분 일 뿐인 원하는 극-극 진동 보여줍니다. 단백질은 마이크로 구조 역학을 분석 하는 kymograph는 전체 구조 (그림 5E) 선택 여 얻어질 수 있다. 때 MinCDE 극-극에서 흔들 리 다, MinC와 마음 구획 (그림 5F) 중간 구획에서 최대 농도와 최소 농도 시간 평균 농도 그라데이션 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> 그림 1: 단백질 담긴의 최종 제품을 보여주는 SDS 페이지. 그의 마음 (33.3 kDa), 그의 eGFP 마음 (60.1 kDa), 그의 mRuby3 마음 (59.9 kDa), 그의 광산 (13.9 kDa)와 그의 MinC (28.3 kDa) 순서로 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> 그림 2: 개별 단계와 비 꽃무늬 지원된 지질 bilayers (1-6 단계)에 자기 조직에 대 한 프로토콜의 타이밍 프로세스 흐름 다이어그램. 점선된 상자 청소를 위해 사용할 수 있습니다 이러한 두 가지 옵션 중 하나를 나타냅니다. 원으로 표시 된 화살표는 프로토콜을 일시 중지 하 고 나중에 다시 시작할 수 있습니다 어디를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> 그림 3: confocal 현미경 검사 법에 의해 MinDE 분석 결과의 이미징. A) 일반 분 나선형, 어떤 파 전파 속도, 강도 플롯 및 속도 측정을 얻을 수 있습니다. 사용 농도: 0.6 µ M (30 %eGFP-마음), 마음이 1.8 µ M 그의-광산 (30% 그의-광산-Alexa647) B) 지역에 대 한 예제에서는 정규화 된 강도 음모 a에서 표시 C) 전체 시험 챔버의 개요 (눈금 막대: 1mm로 동일한 단백질 농도 위). 뿐만 아니라 대상 패턴을 관찰할 수 있다 어느 방향으로 돌고 나선. 확대 지역 웨이브 패턴 UV 접착제에 다 하는 방법을 보여 줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> 그림 4: 개별 단계와 막대 모양의 마이크로 구조 (단계 1-5, 7, 8)에서 자기 조직에 대 한 프로토콜의 타이밍 프로세스 흐름 다이어그램. 회색 상자 단계 제품을 다시 사용할 수 있는 프로토콜에서 비 꽃무늬 지원된 지질 bilayers에 나타냅니다. 원으로 표시 된 화살표는 프로토콜을 일시 중지 하 고 나중에 다시 시작할 수 있습니다 어디를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> 그림 5: MinDE에 대 한 결과 대표적인 패턴 막대 모양의 PDMS microcompartments에 형성. A) MinDE 표면 파도 여행 형성 PDMS의 표면에 자체 구성 (1 µ M 마음 (30 %EGFP-마음), 2 µ M 내와 2.5 m m ATP). B) 단백질 자체 조직에서 microcompartments 사이의 평면 표면에 중지 후 버퍼는 마이크로 구조의 높이를 낮 췄 다. C) 1 개의 막대 모양 microcompartment의 도식. D) MinDE 극-극 진동 버퍼 제거 후의 대표 이미지. E) D에 표시 된 강조 표시 된 줄을 따라 진동의 Kymograph). F) 이미지와 프로필 D에 표시 된 시계열의 평균 형광 강도의) 명확 하 게 보여주는 microcompartment 기둥에 최대한 고 구획 중에서 최소한의 단백질 그라데이션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> 그림 6: 부정적인 실험 결과의 예. A) 차선 소포 준비 및 지질 구성 소포 튀어나와 이어질 동안 지나치게 씻어 막 구멍, 축적. 두 센터 패널 모두 문제 하 고 어떻게 그들이 분 진동 관찰의 조합을 표시 합니다. 막 0.05%로 표시 했다 Atto655-마약. (바 규모: 50 µ m) B) 상단 패널: 밖으로 건조 microcompartments 너무 많은 버퍼 제거 하거나 버퍼 시간 동안 증발 하는 때 발생할 수 있습니다. 하단 패널: 불완전 한 구획 웨이퍼 생산 또는 PDMS 성형 동안 형성 될 수 있다. (바 규모: 30 µ m) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 1: 그의 마음에 대 한 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 2: 그의 EGFP 마음에 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 3: 그의 mRuby3 마음에 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 4: 그의 광산에 대 한 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 5: 그의 MinC에 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 6: 막대 모양 microcompartments의 실리콘 웨이퍼에 대 한 CAD 파일입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

우리 제공 프로토콜 시험관에 마음과 나의 자기 조직 분석 오픈 챔버에 지원된 지질 bilayer에. 또한, 우리는 vivo에서 조건 반응 감 금에 의해 모방 PDMS microcompartments 지질 입은에 분석 결과 포함 하는 방법을 설명 합니다.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

이 방법은 세포의 조직과 막에 대한 주요 질문(예: 기하학적 단서가 과정에서 어떤 역할을 하는지)에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 농도와 같은 패턴 형성에 영향을 미치는 모든 측면을 정밀하게 제어할 수 있다는 것입니다. 시작하려면 text 프로토콜에 설명된 대로 다층 소포를 생성합니다.이제 7-10 사이클 동안 지질을 동결-해동하고, 먼저 핫 플레이트에서 섭씨 70-99도의 물이 담긴 비커와 액체 질소가 담긴 용기를 준비합니다. 질소가 끓는 것을 멈출 때까지 큰 핀셋으로 액체 질소에 바이알을 잡습니다. 그런 다음 용액이 완전히 해동될 때까지 바이알을 뜨거운 물에 옮깁니다.혼합물에 따라 지질 혼합물이 눈에 투명하게 나타날 때까지 이 단계를 반복합니다. 다음으로, 지질 압출기를 조립하고 Min buffer로 시스템을 미리 헹굽니다. 50 나노미터 공극 크기의 멤브레인을 통해 지질 혼합물을 35 및 41회 압출합니다.멤브레인을 통과하지 않은 응집체를 피하기 위해 홀수 번의 패스로 끝나야 합니다. 거꾸로 된 유리 페트리 접시 또는 기타 불활성 표면에 유리 커버 슬립을 분배하십시오. 유리 피펫을 사용하여 각 커버슬립의 중앙에 농축 황산 7방울을 추가합니다.그런 다음 산 방울의 중간에 50% 과산화수소 두 방울을 추가합니다. 반응을 덮고 최소 45분 동안 배양합니다. 이제 핀셋을 사용하여 커버슬립을 개별적으로 집어 들고 초순수로 산을 헹굽니다.세척된 커버 슬립을 붙지 않는 홀더 또는 유사한 운송 장치에 넣으십시오. 이제 각 커버슬립을 초순수로 광범위하게 헹구고 가압 가스로 표면을 건조시킵니다. 커버슬립의 깨끗한 면을 영구 마커로 표시하십시오.챔버를 조립하려면 먼저 날카로운 가위로 0.5 밀리리터 반응 튜브의 뚜껑과 원뿔 부분을 잘라서 버리십시오. 그런 다음 튜브의 상단 가장자리에 UV 접착제를 바르고 피펫 팁을 사용하여 접착제를 고르게 분배합니다. 커버슬립의 깨끗한 면에 튜브를 거꾸로 붙입니다.마지막으로, 360 나노미터 램프 또는 LED 아래에 여러 개의 챔버를 5-15분 동안 배치하여 UV 접착제를 경화시킵니다. 지질 이중층 형성을 지원하기 위해 열 블록을 섭씨 37도로 예열하고 챔버당 하나의 튜브에서 Min 또는 SLB 버퍼가 있는 2개의 밀리리터 반응 튜브를 배양합니다. 조립 및 경화된 챔버에 질소를 불어 넣어 UV 경화 및 조립 중에 침전되었을 수 있는 먼지 또는 기타 입자를 제거합니다.그런 다음 챔버를 열 블록에 놓습니다. 20마이크로리터의 투명 지질 분취액을 130마이크로리터의 Min 완충액으로 희석하여 밀리리터당 0.53mg의 작업 농도를 구축합니다. 각 챔버에 75마이크로리터의 지질 혼합물을 추가합니다.이제 타이머를 3분으로 설정합니다. 배양 시간 동안 소포는 친수성 유리 표면에서 파열되고 융합하여 일관된 SLB를 형성합니다. 60초가 지나면 각 챔버에 150마이크로리터의 최소 버퍼를 추가합니다.남은 120초 후에 200마이크로리터의 Min 또는 SLB 버퍼를 추가하고 조심스럽게 위아래로 몇 번 피펫팅한 다음 200마이크로리터를 더 제거 및 추가하여 각 챔버를 세척합니다. 각 챔버를 한 번 세척한 후 2ml의 버퍼가 소진될 때까지 첫 번째 챔버를 철저히 세척합니다. 지지된 지질 이중층의 세척은 챔버의 움직임 정도를 완벽하게 하고 올바른 세척 강도를 찾기 위해 약간의 경험이 필요합니다.패턴화된 실리콘 웨이퍼에서 PDMS 미세 구조를 생성하려면 먼저 플라스틱 컵을 사용하여 PDMS 베이스 10g과 PDMS 가교제 1g의 무게를 잰다. 혼합 장치를 사용하여 PDMS 혼합물을 혼합 및 제거합니다. 이제 피펫 팁을 사용하여 소량의 PDMS를 실리콘 웨이퍼의 구조물에 직접 떨어뜨립니다.즉시 PDMS 드롭에 1 커버슬립을 놓고 깨끗한 피펫 팁의 상단을 잡고 커버슬립을 실리콘 웨이퍼에 부드럽게 누릅니다. PDMS는 커버슬립과 실리콘 웨이퍼 사이에 얇게 퍼져야 합니다. 커버슬립이 있는 웨이퍼를 오븐에 넣고 섭씨 75도에서 3-4시간 또는 밤새 PDMS를 경화합니다.그런 다음 오븐에서 웨이퍼를 제거하고 실온으로 식힙니다. 면도날을 사용하여 실리콘 웨이퍼에서 PDMS가 부착된 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 이제 유리에 대해 앞에서 설명한 대로 플라스틱 챔버를 PDMS에 부착합니다.챔버가 부착된 커버슬립을 가져다가 산소를 공정 가스로 사용하는 플라즈마 세정제에 넣습니다. 플라즈마로 커버슬립을 청소하십시오. 이 작업에서는 1분 동안 30%의 출력과 0.3mbar의 산소 압력이 사용되었습니다.이제 유리에 대해 이전에 설명한 대로 챔버에서 SLB를 준비합니다. 자가 조직화 분석을 수행하려면 챔버의 완충액 부피를 200마이크로리터의 최소 완충액에서 단백질과 ATP 용액의 양을 뺀 값으로 조정합니다. 그런 다음 MinD, MinE, 원하는 경우 MinC라고 표시된 MinD를 추가하고 피펫팅으로 성분을 부드럽게 혼합합니다.이제 2.5 millimolar ATP를 추가하여 MinDE의 자기 조직을 시작합니다. 다음 10-30분 동안 형광 현미경에서 규칙적인 MinDE 패턴 형성과 적절하게 형성된 미세 구조를 확인합니다. 규칙적인 MinDE 패턴이 형성되면 위아래로 두 번 부드럽게 피펫팅하여 성분을 혼합합니다.100 마이크로 리터 피펫을 사용하여 많은 양의 버퍼를 제거한 다음 10 마이크로 리터 피펫을 사용하여 나머지를 조심스럽게 제거합니다. 이미징 시간을 더 길게 하려면 축축한 스폰지 조각을 챔버 내부에 꽂습니다. 스폰지가 커버 슬립 표면에 닿지 않도록 하십시오.즉시 뚜껑이 있는 챔버를 닫아 미세 구조의 잔류 완충액이 건조되지 않도록 합니다. 미세구조를 이미징하기 전에 미세공동의 단백질이 진동하는 동안 PDMS 미세구조 위에서 MinDE 자가 조직화가 중단되었는지 확인합니다. 이 대표적인 비디오에서 이중 색상 이미징은 MinD 및 MinE가 지지된 지질 이중층의 나선형 패턴을 따르는 이동 표면파로 자체 조직하는 방법을 보여줍니다.여기서 단색 이미징은 MinD 및 MinE가 PDMS 미세 구조에서 극 간 진동을 수행하는 것을 보여줍니다. 진동은 격실 극에서 최대 농도와 격실 중앙에서 최소 농도로 시간 평균 MinD 농도 구배를 설정합니다. 이 절차에 따라 단일 입자 추적과 같은 다른 방법을 수행하여 멤브레인 결합 역학 및 체류 시간을 결정할 수 있습니다.피라냐 용액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 일차 인간 T 세포와 지지된 지질 이중층(SLB) 사이의 면역 시냅스 형성을 연구하는 시험관 내 기술을 보여줍니다. T 세포 표면 단백질은 SLB에 고정된 각 리간드와 상호 작용하여 면역 시냅스를 형성한 다음, lytic granule이 시냅스를 향해 이동하며, 이는 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

지원되는 평면 지질 이중층과의 T 세포 상호 작용을 연구하기 위한 In Vitro 기술

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

여기 postfusion bilayer에이 막 단백질의 세제 무료 배달 대상 지질 bilayers와 fusogenic proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 및 같은 proteoliposomes의 융합에 대 한 두 개의 초고속 프로토콜 선물이. 이러한 방법의 복잡 한 다중 구성 요소 막 시스템의 신속 하 고 쉽게 제어 조립이 있습니다.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

솔리드-지원, 단백질-무료, 이중 인지질 bilayer 막 (DLBM) 복잡 하 고 동적 지질 나노튜브 네트워크로 변형 될 수 있다 고 바인딩과 그물의 2D 상향식 모델로 사용할 수 있습니다.

자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

여기에서는 인공 지질막에서 높은 시공간 정밀도로 광 조절 및 가역성 단백질 패턴을 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 청색광 아래에서 파트너 단백질 Nano(야생형 SspB)에 결합하는 모델 멤브레인에 고정된 단백질 iLID(Improved Light-Inducible Dimer)의 국부적인 광활성화로 구성됩니다.

모델 멤브레인에서의 Dynamic light-induced protein pattern

학습하세요 지지된 지질 이중층에서 MinD와 MinE 단백질의 자가 조직화 패턴 형성 방법을. 형태적 제약 조건 하에서 막 역학을 연구하여 세포 생물학 및 생물물리학 연구를 발전시키는 데 활용할 수 있습니다.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

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