생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

이 방법은 세포의 조직과 막에 대한 주요 질문(예: 기하학적 단서가 과정에서 어떤 역할을 하는지)에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 농도와 같은 패턴 형성에 영향을 미치는 모든 측면을 정밀하게 제어할 수 있다는 것입니다. 시작하려면 text 프로토콜에 설명된 대로 다층 소포를 생성합니다.

이제 7-10 사이클 동안 지질을 동결-해동하고, 먼저 핫 플레이트에서 섭씨 70-99도의 물이 담긴 비커와 액체 질소가 담긴 용기를 준비합니다. 질소가 끓는 것을 멈출 때까지 큰 핀셋으로 액체 질소에 바이알을 잡습니다. 그런 다음 용액이 완전히 해동될 때까지 바이알을 뜨거운 물에 옮깁니다.

혼합물에 따라 지질 혼합물이 눈에 투명하게 나타날 때까지 이 단계를 반복합니다. 다음으로, 지질 압출기를 조립하고 Min buffer로 시스템을 미리 헹굽니다. 50 나노미터 공극 크기의 멤브레인을 통해 지질 혼합물을 35 및 41회 압출합니다.

멤브레인을 통과하지 않은 응집체를 피하기 위해 홀수 번의 패스로 끝나야 합니다. 거꾸로 된 유리 페트리 접시 또는 기타 불활성 표면에 유리 커버 슬립을 분배하십시오. 유리 피펫을 사용하여 각 커버슬립의 중앙에 농축 황산 7방울을 추가합니다.

그런 다음 산 방울의 중간에 50% 과산화수소 두 방울을 추가합니다. 반응을 덮고 최소 45분 동안 배양합니다. 이제 핀셋을 사용하여 커버슬립을 개별적으로 집어 들고 초순수로 산을 헹굽니다.

세척된 커버 슬립을 붙지 않는 홀더 또는 유사한 운송 장치에 넣으십시오. 이제 각 커버슬립을 초순수로 광범위하게 헹구고 가압 가스로 표면을 건조시킵니다. 커버슬립의 깨끗한 면을 영구 마커로 표시하십시오.

챔버를 조립하려면 먼저 날카로운 가위로 0.5 밀리리터 반응 튜브의 뚜껑과 원뿔 부분을 잘라서 버리십시오. 그런 다음 튜브의 상단 가장자리에 UV 접착제를 바르고 피펫 팁을 사용하여 접착제를 고르게 분배합니다. 커버슬립의 깨끗한 면에 튜브를 거꾸로 붙입니다.

마지막으로, 360 나노미터 램프 또는 LED 아래에 여러 개의 챔버를 5-15분 동안 배치하여 UV 접착제를 경화시킵니다. 지질 이중층 형성을 지원하기 위해 열 블록을 섭씨 37도로 예열하고 챔버당 하나의 튜브에서 Min 또는 SLB 버퍼가 있는 2개의 밀리리터 반응 튜브를 배양합니다. 조립 및 경화된 챔버에 질소를 불어 넣어 UV 경화 및 조립 중에 침전되었을 수 있는 먼지 또는 기타 입자를 제거합니다.

그런 다음 챔버를 열 블록에 놓습니다. 20마이크로리터의 투명 지질 분취액을 130마이크로리터의 Min 완충액으로 희석하여 밀리리터당 0.53mg의 작업 농도를 구축합니다. 각 챔버에 75마이크로리터의 지질 혼합물을 추가합니다.

이제 타이머를 3분으로 설정합니다. 배양 시간 동안 소포는 친수성 유리 표면에서 파열되고 융합하여 일관된 SLB를 형성합니다. 60초가 지나면 각 챔버에 150마이크로리터의 최소 버퍼를 추가합니다.

남은 120초 후에 200마이크로리터의 Min 또는 SLB 버퍼를 추가하고 조심스럽게 위아래로 몇 번 피펫팅한 다음 200마이크로리터를 더 제거 및 추가하여 각 챔버를 세척합니다. 각 챔버를 한 번 세척한 후 2ml의 버퍼가 소진될 때까지 첫 번째 챔버를 철저히 세척합니다. 지지된 지질 이중층의 세척은 챔버의 움직임 정도를 완벽하게 하고 올바른 세척 강도를 찾기 위해 약간의 경험이 필요합니다.

패턴화된 실리콘 웨이퍼에서 PDMS 미세 구조를 생성하려면 먼저 플라스틱 컵을 사용하여 PDMS 베이스 10g과 PDMS 가교제 1g의 무게를 잰다. 혼합 장치를 사용하여 PDMS 혼합물을 혼합 및 제거합니다. 이제 피펫 팁을 사용하여 소량의 PDMS를 실리콘 웨이퍼의 구조물에 직접 떨어뜨립니다.

즉시 PDMS 드롭에 1 커버슬립을 놓고 깨끗한 피펫 팁의 상단을 잡고 커버슬립을 실리콘 웨이퍼에 부드럽게 누릅니다. PDMS는 커버슬립과 실리콘 웨이퍼 사이에 얇게 퍼져야 합니다. 커버슬립이 있는 웨이퍼를 오븐에 넣고 섭씨 75도에서 3-4시간 또는 밤새 PDMS를 경화합니다.

그런 다음 오븐에서 웨이퍼를 제거하고 실온으로 식힙니다. 면도날을 사용하여 실리콘 웨이퍼에서 PDMS가 부착된 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 이제 유리에 대해 앞에서 설명한 대로 플라스틱 챔버를 PDMS에 부착합니다.

챔버가 부착된 커버슬립을 가져다가 산소를 공정 가스로 사용하는 플라즈마 세정제에 넣습니다. 플라즈마로 커버슬립을 청소하십시오. 이 작업에서는 1분 동안 30%의 출력과 0.3mbar의 산소 압력이 사용되었습니다.

이제 유리에 대해 이전에 설명한 대로 챔버에서 SLB를 준비합니다. 자가 조직화 분석을 수행하려면 챔버의 완충액 부피를 200마이크로리터의 최소 완충액에서 단백질과 ATP 용액의 양을 뺀 값으로 조정합니다. 그런 다음 MinD, MinE, 원하는 경우 MinC라고 표시된 MinD를 추가하고 피펫팅으로 성분을 부드럽게 혼합합니다.

이제 2.5 millimolar ATP를 추가하여 MinDE의 자기 조직을 시작합니다. 다음 10-30분 동안 형광 현미경에서 규칙적인 MinDE 패턴 형성과 적절하게 형성된 미세 구조를 확인합니다. 규칙적인 MinDE 패턴이 형성되면 위아래로 두 번 부드럽게 피펫팅하여 성분을 혼합합니다.

100 마이크로 리터 피펫을 사용하여 많은 양의 버퍼를 제거한 다음 10 마이크로 리터 피펫을 사용하여 나머지를 조심스럽게 제거합니다. 이미징 시간을 더 길게 하려면 축축한 스폰지 조각을 챔버 내부에 꽂습니다. 스폰지가 커버 슬립 표면에 닿지 않도록 하십시오.

즉시 뚜껑이 있는 챔버를 닫아 미세 구조의 잔류 완충액이 건조되지 않도록 합니다. 미세구조를 이미징하기 전에 미세공동의 단백질이 진동하는 동안 PDMS 미세구조 위에서 MinDE 자가 조직화가 중단되었는지 확인합니다. 이 대표적인 비디오에서 이중 색상 이미징은 MinD 및 MinE가 지지된 지질 이중층의 나선형 패턴을 따르는 이동 표면파로 자체 조직하는 방법을 보여줍니다.

여기서 단색 이미징은 MinD 및 MinE가 PDMS 미세 구조에서 극 간 진동을 수행하는 것을 보여줍니다. 진동은 격실 극에서 최대 농도와 격실 중앙에서 최소 농도로 시간 평균 MinD 농도 구배를 설정합니다. 이 절차에 따라 단일 입자 추적과 같은 다른 방법을 수행하여 멤브레인 결합 역학 및 체류 시간을 결정할 수 있습니다.

피라냐 용액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.