Name: 구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 배우세요 물-오일 에멀젼 방울 내에서 유사 분열 스핀들 구조를 재구성하는 방법을 통해 세포 분열 메커니즘을 연구하세요. 이 기법은 개별 구성 요소의 역할과 스핀들 역학을 밝히는 데 활용됩니다.

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귀중한 토론을 해주신 Dogterom 연구실 구성원들에게 감사드립니다. 시약을 제공해 주신 Stefan Diez와 Marcel Janson, 그리고 다인(dynein) 정제에 도움을 주신 Samara Reck-Peterson에게 감사드립니다. 이 연구는 유럽 연구 위원회(ERC Synergy 보조금: MODEL-CELL)의 자금 지원을 받았습니다.

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

방법은 유 중수 에멀젼 방울에 기본 유사 분열 스핀들을 재구성하기 위해 여기에 존재하는 최근의 노력을 설명했다. 기하학적 경계 내에서 스핀들 어셈블리를 공부하는 것은 많은 장점을 제공한다. 주요 피드백 메커니즘 방추사의 미세 소관 그들이 조립 된 기하학적 제한 사이에 존재한다. 미세 소관은 유사 분열 스핀들 변위가 발생할 수 있습니다 기하학적 경계로 성장할 때 힘을 밀어 생성 할 수 있습니다. 또한, 물리적 인 장벽으로 성장하면 미세 소관 재해를 유발할 수있다. 또한, 밀폐 된 형상 내의 스핀들 조립체는 차례로 직접 미세 소관 증가율 (36)에 영향을 미치는 등의 튜 불린 등의 개별 구성 요소의 점진적인 고갈을 초래할 수있다. 이들은 여기에 설명 된 분석법을 이용하여 연구 할 수 스핀들 조립체의 모든 중요한 결정 요인이다. 설명 된 분석은 작은 농도 differe에 매우 민감하다액적 성분 NCES. 이것은 작은 농도 차이가 너무 느리거나 너무 빠른 미세 소관의 성장을 초래할 수 tubulin에 대한 경우이다. 이 경우, 미세 소관 성장률들은 여전히​​ 실험의 첫 번째 ~ 30 분 동안 온도를 조정함으로써 보정 할 수있다. 방추사 조립체 및 위치도 (피질) 힘 발생기의 농도의 변화에​​ 매우 민감하다. 이렇게 정제 된 성분의 농도, 순도 및 활성에 의존 할 가능성이 모든 새로 정제 된 단백질을 적정 신중해야한다. 또한, 특정한 절충은 분석의 특성에 따라, 촬상 설정에서 수행 될 수있다. 먼저, 수용성 형광 튜 불린 이량 높은 수준의 화상 개별 미세 소관을 어렵게 만든다. 미세 소관은 이상 성장 수용성 튜 불린 천천히 고갈 된 바와 같이, 신호 대 잡음비가 점점 높아져 individu의 이미징을 허용알 미세 소관. 오픈 시스템 설정과는 달리 기하 구속 상당한 표백 결과, 벌크 저장소 내의 형광 분자 산소 제거제 시스템 부품의 교환을 방지한다. 특히, 시간이 지남에 따라 스핀들 어셈블리 및 위치 모니터링, 그것도 강력한 탈산 소제 시스템의 존재하에 낮은 광도를 가진 이미지에 요구된다. 이들 방법은 시험 관내 간략화 스핀들 형 구조의 상향식 재구성을 가능하게한다. 여기에 소개 된 구성 요소에 더하여, 다른 많은 요인 등 3 바이폴라 스핀들 형성, 위치, 방향, 정형을, 영향을 설명 하였다. 이 시스템은 추가의 힘 발생기의 개별 및 결합 효과를 연구하기 위해 확장 될 수있다. 이 시스템에서 현재 존재하지 않는다 스핀들 형성에 중요한 기여는 유사 분열 염색체 수 있습니다. 유사 분열 염색질은로 표시되었습니다&#39;극성 토출 힘&#39;(3), (2) 염색질 바인딩 RanGEF RCC1 (38)에 의해 RanGTP 구배의 형성, (3) kinetochores (해중합과 상호 작용할 수있는 소위 생성 할 수 있습니다 (1) chromokinesins에 의해 직접 스핀들 형성 ) 미세 소관 (39) 및 (4) 반대 미세 소관 (40) 사이에-기계 스프링 역할을 할 수있는 염색질 자체. 마지막으로, 기술 시스템은 현재 제한된 시간과 공간 활동을 제어 도입 힘 발전기의 국산화를 제공합니다. 세포, 많은 스핀들 어셈블리 요소는 특정 구획에 지역화 또는 제한된 시간 창에서 활성화됩니다. 현저한 예는 구체적으로는 (C)의 후방 측에 충실 네인의 활성 인 엘레 한 세포 단계의 배아는 비대칭 스핀들 포지셔닝 및 세포 분열을 촉진한다. 이 시스템에서, 우리는 현재와 같은 t을 흉내 낸의 가능성을 모색하고 있습니다광학 유전 기술에서 차용 emporal 및 비대칭 활동에 사용하는 방법. 또한, AS는 C.의 경우와 엘레 배아와 단단한 세포벽과 세포는 많은 세포 유사 분열에서 반올림하지 않습니다. 기하학적 구속 형상은 스핀들 (41)에 작용하는 힘에 기초 영향을 미칠 것이다. 따라서, 잠재적으로 정형 및 에멀젼이 기억 42,43 방울 허용 더 복잡한 마이크로 유체 시스템의 사용뿐만 아니라 비 구형 방울 스핀들 어셈블리 및 위치를 재구성하는 것이 중요 할 것이다. 마지막으로, 조직에서 세포 - 세포 및 세포 - 기질 시그널링 및 첨부들은 상피 세포에서 관찰 된 바와 같이, 스핀들 방향 지시로 번역 될 수있는 외부 신호를 제공하고, 줄기 세포. 이러한 전문적인 측면 모두이 현재 연구에서 고려되지 않은 및 유사 분열 스핀들 assemb의 생체 -like 더 reconstitutions으로 구축하는 미래의 도전을 제공 할 수 있습니다LY 및 위치.

유사 분열 동안, 복제 된 게놈이 염색체 새로 형성된 딸세포 위에 자매 염색 분체의 동일한 분포가되도록하여 셀 적도 구성된다. 염색체 위치 및 분리는 두 개의 반대 중심체에서 발생하는 스핀들 미세 소관에 자신의 첨부 파일에 의해 매개된다. 충실 염색체 분배를 보장 외에도 방추사의 방향은 또한 세포 분열 평면 일을 지시. 세포 분열의 조정 방향은 개발의 여러 단계 동안 조직의 항상성이 필수적이다. 특히, 규제 유사 분열 스핀들의 위치는 휴대 내용의 비대칭 분포 될 수 있습니다 또는 다른 크기 2의 딸 세포를 생산하고 있습니다. 유사 분열 스핀들 조립 및 방향 의향에 시작 협력과 힘 발전소 3,4를 길항 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조율된다. 생성 된 힘은 B 구성OTH 당기고 미는 힘. 이러한 힘은 세포 외피와 스핀들 주소록에서뿐만 아니라 발 스핀들 내에 모두 기인 한 미소 관 역학뿐만 아니라 분자 모터 및 가교제 (도 1)에 의해 생성 될 수있다. 미세 소관은 세포 외피로서 단단한 구조에 대해 증가 할 때 가압력을 생성 할 수있다. 시스템 내에서 발생하는 총 저항력에 따라이는 유사 분열 스핀들 (낮은 힘)의 재배치가 발생하거나 미세 소관의 좌굴 또는 재앙 (높은 힘) 5-8를 트리거 할 수 있습니다. 길이가 9 미세 소관이 좌굴 강한 결정이므로 누름으로써 생성 될 수 힘의 크기는 미세 소관의 길이에 의존한다. 또한, 하나의 중심체에서 발생한 미세 소관, 다른 중심체 대해 초기 의향에 3,10- 중심체 분리 구동 제안 된 메커니즘을 밀 수있다. 광고에서성장 미세 소관에 의해 생성 된 힘을 추진, 미세 소관이 접촉 단부 셀 피질시 조건은 힘 (11)를 당겨 중재 할 수 있습니다. 여러 실험실에서 연구 피질 힘 발생기의 조절 활성을 생체 (1) 유사 분열 스핀들의 비대칭 위치 결정을 위해 필요한 것으로 나타났다. 이 당기는 힘에 필수는 (이하 &#39;네인&#39;이라 함) 피질 지역화 세포질 네인, 마이너스 엔드 감독 미세 소관 모터 단백질 8,12,13이다. 예를 들어, 효모, 피질 (14)을 따라 슬라이딩 모터에 의존하는 미세 소관의 미세 소관 격자 결과 대뇌 피질의 네인의 측면 상호 작용을 신진한다. 그러나, 피질 당기는 힘은 미세 소관 8 해중합에 말에 첨부 형성 네인의 ​​기능에 의해 생성 될 수있다. 미세 소관의 수축에 의해 생성 된 에너지는 일반적으로 높은 차수의 힘으로 이어질 수있다 (~ 50 PN (15 참조 </s최대&gt;)) 개별 모터 단백질에 의해 발생되는 힘보다 (~ 7-8 PN (참조. 16)). 해중합 미세 소관에 대뇌 피질의 네인의 최종에 첨부 신진 효모 (17)와 C에 스핀들 위치를 촉진 엘레 13. 모터에 의존하는 슬라이딩 및 미세 소관 해중합 구동 모두 대뇌 피질의 당기는 힘이 협력 또는 생체 내에서 상호 배타적 수 있는지 여부는 현재 알 수없는이다. 미세 소관 가압력과 네인 매개 피질 당기는 힘 이외에, 중심체의 위치는 다수의 다른 단백질에 의해 방추사 내에서 제어된다. 키네신 -5- 모터는, 예를 들면, 외측으로 슬라이딩 힘 18-20의 발생을 초래 평행 극간 소관 링크를 교차 할 수 사량 체로서 존재한다. 키네신-5 모터 가족의 일원은 C.를 제외하고, 연구 모든 진핵 생물의 중심체 분리 및 바이폴라 스핀들 조립에 필요한 엘레<html> (참고 21에서 검토). 또한, Ase1 / PRC1 가족의 확산 가교제는 생체 내에서 체외 22-27에서 극간 미세 소관의 미세 소관 영역을 중복으로 지역화하는 것으로 알려져있다. 중복 미세 소관 영역의 Ase1 중심의 확장에 의해 생성 된 힘은 시험관 (28, 29)에 키네신-14 매개 슬라이딩 힘을 상쇄 할만큼 크다. 세포에서 Ase1 / PRC1는 스핀들 midzone 25-27,30에 미세 소관 중복 영역 확산 가교제에 의해 발생하는 힘이 크게 스핀들 조직에 기여할 수 있다는 것을 암시 안정적인 형성을 위해 필요하다. 마지막으로, 유사 분열 염색질에서 힘과 kinetochores 다양한 경로 3을 통해 유사 분열 스핀들 어셈블리 및 위치에 영향을 미친다. 이들 구성 요소는 여기에 기재된 재구성 분석법의 일부가 아닌 때문에, 상세히 설명되지 않을 것이다. jove_content &quot;&gt; 다른 이론은 위에 설명 된 다른 분자 구성 요소와 세력이 주축 조립 및 위치에서 협력하는 방법에 존재하지만, 우리는 정량적 인 이해에서 멀리 아직도이다. 또한 실험에 살아있는 세포에, 정제 된 구성 요소와 생체 외 실험은 강력한를 제공 경로가이 목표를 달성 할 수 있도록. 여기에 우리가 기본 스핀들 유 중수 에멀젼 방울에서 재구성되는 최근 발표 된 방법의 적용 및 확장 버전 (로스 등. 31)에 대한 시각적 가이드를 제공하는로 시작 마이크로 유체 기술을 이용하여 부품의 최소 개수. 구면 방울이 분열 세포에 필적 크기로 생성된다. 이러한 액적 내에 정제 중심체와 튜 불린은 미세 소관 애 역학 연구 생성 및 애 - 애 상호 작용을 강제하기 위해 결합 될 수있다.하여 대뇌 피질 (예 : 네인 등) 간 극성 (예 : 키네신-5 / Ase1) 강제 발전기를 도입, 우리생체 내 상황을 닮은 시작 점점 복잡 스핀들 형 구조를 재구성한다.

<table><tbody><tr><td><강한>1. 미세유체 칩의 제조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (필름 기판에 Photomask)</td><td>Selba S.A. Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron < 1-0-0>10-20 &오메가;-cm, 500-550 &mu; m, SSP, 2 플랫 포함)</td> <td>WRS 재료</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터&nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 프리 폴리머 RVT615 A + B</td><td>윤활 본드</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>코로나 처리기</td><td>전기 기술 제품</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>2. 미세유체 설정</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-( biotinyl)))Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리관</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>진공 챔버</td><td>Kartell</td><td>폴리 프로필렌 진공 Desiccator</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>계면활성제(Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td></td><td></td><td>24mm x 60mm, 두께 1.5</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td></td><td></td><td>26mm x 76mm</td></tr><tr><td>펀처</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>실험실 밀봉 필름</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (바셀린, 라놀린, 파라핀 왁스를 동일한 농도로 녹임)</td><td></td><td></td> <td>집에서 만든</td></tr><tr><td>Brightfield Microscope</td><td>Leica</td><td>PMIRB&nbsp;</td><td>반전된 명시야면 충분합니다</td></tr><tr><td>압력 제어 장치</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tubing</td><td>Cluzeau Info. Labo, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml 및 1 ml)</td><td>VWR, 네덜란드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3. 스핀들 형성 및 위치 재구성</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, 음이온성, 고정성)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - 소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포도당 (D-(+)-포도당)</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>포도당-산화효소 (아스페르길루스 니제르의 포도당 산화효소)</td><td>시그마-알드리치</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-디티올테이톨)</td><td>시그마-알드리치</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>카탈라아제 (카탈라아제 형태 소 간)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin (소 뇌의 세뇨관)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-488/561 (돼지 뇌에서 추출한 HiLyte-488/로다민 표지 튜불린)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (구아노신-'5-트리포스페이트, 나트륨 염 수화물)</td><td>시그마-알드리치</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&kappa;-카제인(&kappa;-소 혈청 우유에서 추출한 카제인)</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>에어퓨지(공기 구동식 초원심분리기)</td><td>벡크만-콜터</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>4. 스핀들 어셈블리 팩터 소개</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP(Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Phospho (enol) pyruvic acid monosodium salt hydrate &ge; 97%(효소))시</td><td>그마-알드리치</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(토끼 근육의 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

유사분열 방추체 어셈블리, 위치 및 방향은 미세소관 역학, 미세소관 운동 단백질 및 가교자에 의해 생성된 결합된 힘에 따라 달라집니다. 성장하는 미세소관은 미는 힘을 생성할 수 있는 반면, 미세소관을 해중합하면 미세소관 수축의 에너지를 예를 들어 피질 다인이나 염색체에 부착될 때 당기는 힘으로 변환할 수 있습니다. 또한, 방추체 내의 운동 단백질과 확산성 가교제(diffusible cross-linker)는 역평행 미세소관을 연결하고 슬라이딩하여 방추체 구조에 기여합니다. 생체 내에서는 전반적인 힘의 균형에 대한 개별 플레이어의 상대적 기여도를 밝히는 것이 어렵다는 것이 입증되었습니다. 여기에서 우리는 기본 유사분열 방추체를 in vitro에서 상향식으로 재구성하기 위한 노력의 일환으로 최근에 개발한 방법을 제시합니다. 미세유체(microfluidic) 기법을 사용하여 센트로솜(centrosome)과 튜불린(tubulin)을 유속수(water-in-oil) 에멀젼 방울에 캡슐화하여 기하학적으로 제한된 (이중) 미세소관 과꽃을 형성합니다. 이 시스템은 대뇌피질에 고정된 dynein, 플러스 엔드 유도 미세소관 모터 및 확산성 가교제를 추가로 도입하여 방추형과 같은 구조를 재구성하는 데 사용됩니다. 여기에 제시된 방법은 보다 완전한 유사분열 방추체를 재구성하기 위한 시작점을 제공하여 각 개별 구성 요소의 기여도에 대한 자세한 연구를 가능하게 하고 유사분열 방추체 내의 힘-균형에 대한 통합된 정량적 관점을 얻을 수 있습니다.

이전 섹션에 제시된 방법은 유 중수 에멀젼 액 적의 형상을 한정하여 복잡성이 증가함에 따라, 스핀들 형 구조의 재구성을 허용한다. 이 섹션에서는 성적이 분석의 능력을 보여 대표적인 결과를 설명합니다. 바이폴라 스핀들 조립 될 때 유사 분열 동안, 세포는 인간 세포에 대해 측정 된, 약 15 ㎛의 직경을 갖는 구체를 형성하는 라운드. 이 특성 유사 분열 세포 형태는 제한하고 모두 스핀들 크기와 방향 (35, 36)를 지시하는 기하학적 경계를 제공합니다. 미세 유체 기술은 정확하게 살아있는 세포에서 관찰 된 상황과 유사하기 때문에 체외에서 유사 분열 스핀들 상향식 재구성을 허용 기하 구속의 레벨을 제공한다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-미세 소관의 성장이 기하학적 경계에 의해 제한되는 경우 페이지 = &quot;1&quot;&gt; 미세 소관의 과꽃은 이미 그 자체로 복잡한 행동을 할 수있다. 미세 소관이 증가함에 따라, 새로운 튜 불린 이량 체의 혼입에 의해 생성 된 가압력은 에멀젼 소적의 대향 측면에 두 중심체를 구동한다. 처음에는 중심체 자유롭게 제한 볼륨 (그림 4a, 왼쪽 패널) 내에서 확산. 약 20 ~ 30 분 후, 첫 번째 미세 소관은 미세 소관은 모든 방향으로 피질에 성장 표시 및 중심체 확산이 제한된다됩니다. 중간 길이 (액적 직경의 약 50 %)의 미세 소관과 과꽃은 (입체), 다른 중심체와 피질 서로 밀어 미세 소관으로, 각각 다른 물리 칠 수 있습니다. 이것은 서로 (그림 4a, 가운데 패널)을 반대하는 두 개의 중심체 전형적인 &#39;양극&#39;스핀들과 같은 배열을 초래한다. 미세 소관은 액적 직경의 ~ 50 % 이상 증가하는 경우미터는 중심체는 방울 피질 (그림 4a, 오른쪽 패널)을 따라 성장하는 미세 소관으로, 액체 방울의 반대 경계에 더 밀어 얻을. 이들 분석에서 미세 소관 성장률 온도-tubulin의 농도 모두에 매우 민감하다는 것이 중요하다. 핵이 처음 발견 될 때 정상 상태 애 위치에 도달하면이 매개 변수는 따라서 강력하게 시간에 영향을 미칠 것입니다. 세포에서 대뇌 피질의 당기는 힘은 미세 소관 플러스 엔드 및 피질 관련 네인 사이의 부하 베어링 첨부 파일의 형성을 통해 생성된다. 동물 세포에서이 협회는 Gαi 1의 N 말단 미리 스토 일화를 통해 세포막을 대상으로하는 Gαi / LGN / NUMA 단지에 따라 달라집니다. 이러한 재구성 분석법에서 Gαi / LGN / NUMA 착물의 요구를 직접 통해서 비오틴 네인 지질에 결합하여 우회비오틴 - 스트렙 트 아비딘 - 비오틴 복합체의 형성. 이 채권은 상대적으로 안정적 (K D ~ 10 -14 M) (37)이며, 빠르게 형성 (일반적으로 미세 소관의 핵 명백한되기 전에, 에멀젼 액적 형성 후 10 분 이내) (그림 4B). 네인의 부재에서, 중심체가 액적 피질 (도 4c)의 양측에 가압되는 반면 피질 네인의 존재 중심체는 일반적 이상의 중앙 위치를 유지한다. 우리는이 방지하고 미세 소관 추진 세력에 대항 두 가지 효과의 결과이다 추론. (1) 네인 직접 미세 소관의 재해하여 미세 소관의 길이를 제한하는 과도한 미세 소관의 좌굴을 방지하고, (2) 대뇌 피질의 당기는 힘이 애 - 애 스터의 반발 세력에 대항 개별 과꽃 8에 그물 중심 세력으로 이어질를 촉진한다. Ase1는 F를 유도 확산 성 가교제경향 orces는 반 평행 미세 소관 (29)의 중첩 영역을 증가시킵니다. 이과 일치는, (네인 및 부재)를 Ase1의 존재 중심체는 Ase1이 극간 미세 소관 (그림 4D)를 번들로 제공하는 현지화와 가깝게 찾을 수 있습니다. 키네신-5 가족의 구성원은 (소개 참조) 스핀들 내에서 추진하는 힘을 제공하여 중심체 분리를 구동한다. Cut7합니다 (S. pombe 키네신 -5- ortholog)의 존재 하에서조차 Ase1 중심체 (도 4E)의 존재하에 에멀젼 소적의 양측에 가압된다. 피질 간 극성 동력 발전기를 결합함으로써, 복잡도의 레벨은 상기 바이폴라 결국 분열 스핀들 조립체의 포괄적 인 이해에 이르는 이들 실험에서 증가 될 수있다. 이러한 결과의 상세한 정량적 설명은 미래에 사용할 수 있습니다 (로스 외., 준비 원고). <p class="jove_content" fo:keeP-together.within 페이지는 = &quot;1&quot;&gt; 시간 고정 순간에 중심체의 위치를​​ 관찰하고, 미세 소관의 관측 길이 그들의 행동 관련 외에도 가치있는 정보를 통해 위치 결정 처리를 수행하여 얻을 수있다 시각. 노출 시간 및 레이저 강도를 감소시킴으로써, 단지 ~ 30 % 표백 적어도 1 시간 동안 2 분 간격으로 애 위치 결정을 수행하는 것이 가능하다. 이 중앙 집중화를 통해 자유롭게 확산 중심체에서 애 조립 및 위치 모니터링 (0 분). 수 (12 분.) 분산 과꽃 (36 분 추가) (도 5c)에. 이것은 정상 상태 동작과 스핀들 조립 속도론 모두의 연구를 용이하게한다. 동일한 샘플의 서로 다른 내용으로 방울을 조합함으로써, 예를 들면, 가능한 직접 (도 5b)와 피질 힘 발생기 않고 물방울 중심체 위치 스핀들 조립체 동력학과 비교된다. 그림 1 : 힘은 유사 분열 스핀들에 작용하는 여러 힘 생성 분자는 스핀들 형성 및 위치를 촉진하기 위해 유사 분열 스핀들의 미세 소관에 작용한다.. 셀 피질로 성장 미세 소관은 중심체의 미는 힘을 생성합니다. (보라색) 두피 네인은 해중합 미세 소관을 캡처하고 중심체에 당기는 힘을 생성합니다. PRC1 / Ase1 가족의 가교제가 힘을 슬라이딩 바깥쪽으로 반대 생성하는 반면, 스핀들 내에서 키네신-5 / Cut7 모터 단백질, 반 평행 미세 소관에서 바깥쪽으로 슬라이딩 힘을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> 그림 2 :. 4 마이크로 유체 칩을 포함하는 4 인치 포토 마스크의 미세 유체 칩 설계 (A) 디자인. (B)는 단일 칩의 상세한 표현. 칩은 하나의 출구 채널 및 먼지 필터 뒤에 세 개의 유입 채널을 포함한다. 입구 채널 (1)이 물 단계를 포함 지질 / 오일 상 및 제 3 채널이 채널은 추가적인 지방 / 오일 상으로 형성된 방울을 희석 할 수있다. (C) (상단과 하단에서 오는) 지질 / 오일 위상 (왼쪽에서 오는) 물 위상에 맞는 접합의 상세한 표현입니다. 교차로에서 물방울이 형성되고 오른쪽에있는 출구 통로쪽으로 흐른다. (D) 2 μm의 채널 먼지 필터의 상세한 표현입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> 그림 3 :. 유 중수 에멀젼 액적 형성을위한 방법론 (A) 밝은 필드 현미경 미세 유체 칩과 마이크로 유체 관. 모두 물과 지방 / 오일 상 관이 각각 칩 입구 (1)과 (2)에 접속된다. 발수 지질 / 오일 위상이 충족 마이크로 유체 칩 (B) 제한. 압력을 변화시킴으로써, 소적 크기는 조절 될 수있다. PDMS 코팅 플로우 셀 (C) 설계. 플로우 셀에 방울을 넣은 후, 구단은 추가 Valap 폐쇄된다. (D)의 액적 형성의 회로도. 방울 중심체, 튜 불린 및 방추사 형성에 필요한 추가의 성분을 캡슐화하는데 사용된다. 대뇌 피질의-네인 타겟팅 (E) 도식. 바이오틴 (바이오) 네인은 스트렙 타비 딘 (STRP)를 통해 바이오틴 지질을 대상으로한다. <a= &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;HREF&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> 그림 4 :. 복잡성 증가와 스핀들 - Reconstitutions의 대표 결과 (A), 짧은 중간, 긴 미세 소관의 예를 보여주는 두 개의 중심체가 포함 된 물방울의 최대 강도 예측. 중심체와 미세 소관은 10 % HiLyte 488 튜 불린 표지의 첨가에 의해 가시화된다. 스케일 바는 10 μm의 =. (- 왼쪽)와 스트렙 타비 딘 (STRP)의 존재 (+, 오른쪽)이 없을 GFP - 비오틴 네인 - TMR의 (B) 버전. 대뇌 피질의 GFP - 비오틴 - 네인 - TMR의 (오른쪽 +,) - (왼쪽) 또는 존재 (C) 미세 소관의 애의 부재에 위치. (D) 미세 소관의 애 (왼쪽 패널, GREEN Ase1의 존재) 위치 (가운데 패널, 레드). Ase1 및 Cut7 (키네신-5) (중간 패널, 레드)의 존재 (E) 미세 소관의 애 (왼쪽 패널, 녹색) 위치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> 그림 5 : 체외에서 이미징 애 위치 역학 (A) 몇 시간까지 액적 이미징을 할 수있는 PDMS 컵의 디자인.. (B) 생성, 저장 및 액적 이미징 형광 덱스 트란의 부재 (왼쪽) 포함 (우) (알렉사 647)에 의해 도시 된 다른 내용을 포함하는 (송신). (C) 60 분의 시간 경과의 단일 평면 이미지 (2 분 간격) 광고의 Z-스택 (2 μm의 거리)에서 촬영하나의 중심체를 포함 roplet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

유사분열 방추체의 조립 및 위치는 미세소관 역학, 운동 단백질 및 가교제에 의해 생성된 결합된 힘에 따라 달라집니다. 여기에서 우리는 구형 에멀젼 방울의 기하학적 구속이 기본 유사 분열 방추체의 상향식 재구성에 사용되는 최근에 개발 된 방법을 제시합니다.

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 오일-인-워터(water in oil) 에멀젼 액적의 기하학적 구속 환경 내에서 유사 분열 방추 구조를 재구성하는 것입니다. 이 방법은 방추사가 어떻게 배치되고 조립되는지, 그리고 개별 구성 성분이 이러한 과정에 구체적으로 어떻게 기여하는지와 같은 분열 방추 조립 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분열 세포의 형태를 모방한 기하학적 구속 내에서 바텀업(bottom-up) 방식을 통해 방추 유사 구조를 재구성한다는 점입니다.이 방법은 세포의 가둠(confinement)에 의존하는 다른 과정들을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. PDMS 전중합체 10부와 경화제 1부를 총 질량 약 40 g이 되도록 혼합합니다. 그런 다음, 기포를 제거하기 위해 혼합물을 진공 챔버에 약 30분 동안 둡니다.그동안 몰드 주변에 알루미늄 호일을 감싸 지름 4인치, 깊이 1cm의 컵 모양을 만듭니다. 준비가 되면 PDMS 혼합물의 약 3/4을 몰드에 붓습니다. 그런 다음, PDMS를 다시 진공 챔버에 넣고 30분 동안 유지합니다.탈기 후, 100 °C에서 1시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. 그동안 압축 공기로 먼지를 제거하여 스핀 코팅용 유리 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음, 남은 PDMS 혼합물을 슬라이드 위에 스핀 코팅합니다.PDMS를 경화시키기 위해 이 슬라이드들을 100 °C에서 1시간 동안 큐어링합니다. 다음으로, 면도날을 사용하여 PDMS를 조심스럽게 벗겨내고, PDMS 스트립에 필요한 구멍을 뚫어 미세유체 칩을 제작합니다. 이제 미세유체 칩과 PDMS가 코팅된 유리 슬라이드를 수 초간 코로나 처리합니다.마지막으로, 채널이 아래를 향하도록 각 유리 슬라이드 위에 마이크로플루이딕 칩을 배치하고, 100 °C에서 밤새 칩을 가열합니다. 먼저, 클로로포름으로 세척한 유리 기구를 사용하여 클로로포름에 용해된 지질 약 250 µg을 준비합니다. 불활성 가스를 이용하여 지질 혼합물을 조심스럽게 건조합니다.그런 다음 이를 진공 챔버에 1시간 동안 둡니다. 이어서 지질을 미네랄 오일과 2.5% 계면활성제에 0.5 mg/mL 농도가 되도록 용해시키며, 이때 부피는 약 500 µL입니다. 지질을 완전히 용해시키기 위해 혼합물을 40 kHz에서 30분 동안 초음파 처리합니다.다음으로, 현미경 대물렌즈에 맞는 두께로 커버 글라스 위에 PDMS를 스핀 코팅합니다. 그런 다음, 유리 슬라이드 위에 PDMS를 스핀 코팅합니다. 이제 PDMS가 코팅된 커버 글라스와 유리 슬라이드를 100 °C에서 1시간 동안 경화시킵니다.그 다음, PDMS가 코팅된 유리 슬라이드 위에 실험실용 밀봉 필름을 얇게 잘라 촘촘하게 배치하여 유체 칩(flow cell)을 제작합니다. 3 mm 너비의 스트립을 약 2 mm 간격으로 배치하십시오. 그런 다음, PDMS가 코팅된 커버 슬립으로 유체 칩을 덮고, 100 °C에서 약 1분 동안 필름을 녹여 전체 조립체를 밀봉합니다.가열 후, 커버 슬립을 부드럽게 눌러 고정하고 Valap으로 밀봉합니다. 다음으로, 장기 이미징을 위한 PDMS 컵을 준비합니다. 3 mm 두께의 PDMS 조각에 지름 4 mm의 구멍을 뚫습니다.그 다음, PDMS 슬라이스와 PDMS가 코팅된 커버 글라스를 코로나 처리합니다. 처리가 완료되면 두 장을 서로 겹쳐 배치하고, 이 조립체를 100 °C에서 하룻밤 동안 굽습니다. 도립 명시야 현미경을 통해 액적의 형성을 관찰합니다.지질 오일 상을 압력 조절기에 연결하고, 피크 튜브에서 오일 한 방울이 나올 때까지 압력을 높입니다. 피크 튜브를 마이크로플루이딕 칩의 두 번째 입구에 연결하십시오. 그런 다음, 두 번째 입구를 통해 지질 오일 상으로 마이크로플루이딕 칩을 완전히 채웁니다.다음으로, 첫 번째 입구에서 MRB-80 기반의 수상을 도입합니다. 지질 오일상의 압력과 수상의 압력을 조절하여 직경이 약 15 µm인 액적을 생성함으로써 액적 크기를 제어합니다. 지질 오일상은 약 800 millibar, 수상은 200 millibar로 설정하는 것이 적절한 시작점입니다.원하는 액적 크기를 얻은 후, 유동 셀을 액적으로 완전히 채웁니다. 이 액적들은 소량의 수상을 사용하여 형성됩니다. 이는 적절한 크기의 액적이 형성되기 전에 모든 수상을 소모하지 않도록 마이크로 유체 장치를 빠르게 작동시켜야 함을 의미합니다.충전이 완료되면 Valap을 사용하여 플로우 셀의 양 끝을 조심스럽게 닫습니다. 액적의 이동이 멈추지 않는다면 씰링이 제대로 되지 않았거나 기포가 유입되었을 가능성이 있습니다. 장기 이미징을 위해서는 액적을 PDMS 컵으로 옮기고 오일 지질 혼합물 층으로 덮습니다.중심체를 실온에서 해동하고, 미세소관 핵형성이 적절히 이루어질 수 있도록 37°C에서 20분 동안 둡니다. 기다리는 동안, 얼음 위에서 분석 혼합물을 준비합니다. 여기에는 tubulin, GTP, 산소 제거 시스템, 미세소관 가교제와 같은 분자 힘 생성기, ATP 및 ATP 재생 시스템이 포함되어야 합니다.혼합 후, 냉각된 Airfuge 로터를 사용하여 30 psi에서 3분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 그런 다음, 미리 가열된 중심체를 혼합물에 첨가합니다. 물방울당 하나 또는 두 개의 중심체가 포함되도록 첨가하는 중심체의 양을 최적화하십시오.그 다음, 이 혼합물을 사용하여 앞서 설명한 대로 에멀젼 액적을 생성합니다. 액적 피질의 비오틴화 지질로 다이네인을 모집하기 위해, 수상에 GFP-dynein TMR 및 streptavidin을 포함시킵니다. 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 26 °C에서 30분 후의 미세소관 성장을 시각화합니다.이미징 중에 온도를 28°C 또는 30°C까지 높이면 미세소관의 성장을 촉진할 수 있습니다. Z-프로젝션을 위해 1 µm 간격으로 스택을 촬영하며, 이는 드롭렛당 약 20장의 이미지가 필요합니다. 메인 카메라 패널로 이동하여 Edit Z를 클릭하고 Z Step을 1.0으로 설정하십시오.Next를 클릭하여 설정을 저장합니다. 다음으로, Acquisition 패널의 Camera 탭을 클릭하고 EM Gain 바를 300으로 슬라이드하여 최대 선형 EM Gain을 설정합니다. 그 다음, 동일한 탭에서 Exposure Time을 200 milliseconds로 설정합니다.Record를 클릭하여 설정을 저장하십시오. 라이브 이미징 실험의 경우, 노출 시간을 약 100 milliseconds로 줄이고 Z 간격을 2 microns로 늘려 2시간 동안 2분마다 Z Projections를 수행하십시오. 라이브 이미징 실험 시에는 시료를 최대한 고정하기 위해 일반 유동 셀 대신 PDMS 컵을 사용하십시오.설명된 프로토콜을 사용하여 중심체(centrosome)를 포함하는 수중유형(water-in-oil) 에멀젼 액적에서 방사형 미세소관(aster) 형성을 연구하였습니다. 초기에는 중심체가 제한된 부피 내에서 자유롭게 확산됩니다. 약 20~30분 후에 첫 번째 미세소관들이 보이기 시작하며, 미세소관이 모든 방향으로 피질(cortex)을 향해 성장함에 따라 중심체의 확산이 제한됩니다.미세소관이 액적 지름의 절반보다 더 길게 성장하면, 중심체는 서로 반대편 경계로 밀려나며 미세소관은 액적 피질을 따라 성장합니다. streptavidin이 없을 때 dynein은 액적 내에 확산되어 있습니다. 하지만 streptavidin이 있는 경우, 액적 형성 후 약 10분 이내에 dynein이 biotinylated lipid에 결합됩니다.피질 다이닌(cortical dynein)이 존재하는 상태에서 형광 튜불린(tubulin)을 관찰하면 중심체(centrosomes)가 중앙에 위치함이 분명하게 나타납니다. 반면 다이닌이 없을 때는 중심체가 액적의 반대 방향으로 밀려납니다. 이는 아마도 다이닌이 미세소관의 파괴(microtubule catastrophes)와 피질 견인력을 촉진하여 성상체(asters)를 중앙으로 집중시키기 때문인 것으로 보입니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 미세유체 기술을 사용하여 구형 에멀젼 액적 내에 방추사 모양의 구조를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙달되면, 적절한 수행 시 액적 형성 및 이미징은 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 통해 다른 방추사 조립 인자들을 캡슐화하여 방추사 형태 및 위치에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다.chloroform 또는 PDMS를 사용할 때는 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 지질 이중층으로 코팅된 미세구에서 셉틴 단백질 어셈블리를 연구하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 곡면에 있는 단백질의 곡률 의존적 어셈블리를 이해하는 데 도움이 됩니다.

Spherical Supported Lipid Bilayer Assay: 마이크로스피어에서 Septin 어셈블리를 관찰하는 기술

고도로 채워진 마이크로미터 크기의 구성 요소를 포함하는 거대한 소포는 유용한 세포 모델입니다. 유중수(water-in-oil) 에멀젼 원심분리 방법은 캡슐화된 물질로 거대한 소포를 준비하기 위한 간단하고 강력한 도구입니다.

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

현재 작업 micellar 나노, nanobiomaterials의 신흥 주요 클래스를 조작 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 자기 조립, 탑-다운 분무, 상향식을 결합 및 용 매 기반 구조 제어. 제조 방법은 크게 연속, 높은 품질의 제품을 생산할 수 있는 이며 구조 제어에의 한 저렴 한 수단을 보유 하 고.

구형 및 벌레 모양의 Micellar 나노 자기 조립, 분무, 결합 하 여 용 매 기반 구조 제어의 제조

달걀 추출 물 물에서 기름 microemulsions에서 Xenopus laevis 의 캡슐화 하 여 방법을 생체 외에서 자기 지속적인된 mitotic 진동 단일 세포 수준에서의 세대를 위한 선물이.

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

물방울 분석은 분석 화학, 효소 진화 및 단일 세포 분석에 유용하지만 일반적으로 액적을 형성하기 위해 미세 유체학이 필요합니다. 여기서는 액적 저술을 수행하기 위한 미세유체없는 접근 방식인 입자 템플릿 유화제를 설명합니다.

입자 템플릿 유화제를 통해 미세 유체가 없는 물방울 분석을 가능하게 합니다.

여기에서 정의 된 프로테오올리포솜의 완전히 정제 된 구성 요소로 Msp1 추출 활동을 재구성하기위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

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여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

이 프로토콜은 생쥐 난모세포 시스템의 핵 모양과 내부 막이 없는 세포 소기관에 대한 세포골격의 물리적 영향을 문서화하기 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 이 프레임워크는 다른 세포 유형 및 컨텍스트에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.

공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처

이 기사에서는 상으로 분리된 거대 소포 내부의 세포골격 네트워크의 간단한 원팟 재구성을 소개합니다. 이 방법은 일반화되어 광범위한 생체 분자의 캡슐화 또는 제한에 적용될 수 있습니다.

시험관 내 상분리된 거대 단일층 소포(GUV) 내부 세포골격 네트워크의 재구성

배우세요 물-오일 에멀젼 방울 내에서 유사 분열 스핀들 구조를 재구성하는 방법을 통해 세포 분열 메커니즘을 연구하세요. 이 기법은 개별 구성 요소의 역할과 스핀들 역학을 밝히는 데 활용됩니다.

구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

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