구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

이 절차의 전반적인 목표는 오일 에멀젼 방울에서 물의 기하학적 구속 내에서 유사 분열 방추체와 같은 구조를 재구성하는 것입니다. 이 방법은 유사 분열 스핀들 조립 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 스핀들이 어떻게 배치되고 조립되는지, 이러한 프로세스에 대한 개별 구성 요소의 구체적인 기여는 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 상향식 접근 방식을 사용하여 유사 분열 세포의 모양을 모방하는 기하학적 구속 내에서 방추형과 같은 구조를 재구성

이 방법은 세포 감금에 의존하는 다른 과정을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. PDMS 프리폴리머 10부와 경화제 1부를 총 질량 약 40g으로 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 진공 챔버에 약 30분 동안 넣어 기포를 제거합니다.

한편, 알루미늄 호일을 금형에 감아 직경 4인치의 1cm 깊이의 컵을 만듭니다. 준비가 되면 PDMS 믹스의 약 3/4을 금형에 붓습니다. 그런 다음 PDMS를 진공 챔버에 다시 30분 동안 다시 넣습니다.

탈기 후 섭씨 100도에서 한 시간 동안 PDMS를 경화합니다. 한편, 압축 공기로 먼지를 털어내어 스핀 코팅을 위한 일부 유리 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 나머지 PDMS 믹스를 슬라이드에 스핀 코팅합니다.

PDMS를 강화하기 위해 섭씨 100도에서 한 시간 동안 이 슬라이드를 경화시킵니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 PDMS를 부드럽게 벗겨내고 PDMS 스트립에서 필요한 구멍을 뚫어 미세유체 칩을 만듭니다. 이제 코로나는 미세유체 칩과 PDMS 코팅된 유리 슬라이드를 몇 초 동안 처리합니다.

마지막으로, 채널이 아래를 향하도록 각 유리 슬라이드에 미세유체 칩을 놓고 섭씨 100도에서 밤새 칩을 굽습니다. 먼저 클로로포름으로 세척된 유리 제품을 사용하여 약 250마이크로그램의 클로로포름 용해 지질을 준비합니다. 불활성 가스와 지질 혼합물을 조심스럽게 건조시킵니다.

그런 다음 한 시간 동안 진공 챔버에 두십시오. 그런 다음 미네랄 오일과 2.5% 계면활성제에 지질을 약 500마이크로리터인 밀리리터당 0.5밀리그램으로 용해시킵니다. 지질을 완전히 용해시키려면 40킬로헤르츠에서 30분 동안 혼합물을 초음파 처리합니다.

다음으로, 현미경 대물렌즈와 일치하는 두께의 커버 유리에 PDMS를 스핀 코팅합니다. 그런 다음 PDMS를 유리 슬라이드에 스핀 코팅합니다. 이제 PDMS 코팅된 커버 안경과 유리 슬라이드를 섭씨 100도에서 한 시간 동안 경화시킵니다.

그런 다음 PDMS 코팅된 유리 슬라이드에 얇은 실험실 밀봉 필름 조각을 밀접하게 배치하여 플로우 셀을 만듭니다. 3mm 스트립을 약 2mm 간격으로 배치합니다. 그런 다음 PDMS 코팅된 커버 슬립으로 플로우 셀을 덮고 섭씨 100도에서 1분 동안 필름을 녹여 어셈블리를 밀봉합니다.

가열되면 덮개를 부드럽게 누르고 Valap으로 밀봉합니다. 다음으로, 장기 이미징을 위한 PDMS 컵을 준비합니다. 3mm 두께의 PDMS 슬라이스에 직경 4mm의 구멍을 뚫습니다.

그런 다음 PDMS 슬라이스와 PDMS 코팅 커버 유리를 코로나 처리합니다. 처리가 완료되면 서로 위에 놓고 섭씨 100도에서 밤새 어셈블리를 굽습니다. 도립 명시야 현미경(inverted brightfield microscope)에서 액적 형성을 모니터링합니다.

지질 오일 상태를 압력 컨트롤러에 연결하고 피크 튜빙에서 오일 한 방울이 나올 때까지 압력을 높입니다. 피크 튜빙을 미세유체 칩의 2번 입구에 연결합니다. 그런 다음 미세유체 칩을 주입구 2의 지질 오일 상으로 완전히 채웁니다.

다음으로, 유입구 1에서 MRB-80 기반 수상을 도입합니다. 지질 유상과 수상 압력을 변경하여 약 15미크론 직경의 액적을 생성하여 액적 크기를 제어합니다. 지질유상의 경우 약 800mbar, 수계의 경우 200mbar가 좋은 시작점입니다.

원하는 액적 크기를 얻은 후 플로우 셀을 액적으로 완전히 채웁니다. 이 물방울은 소량의 물 상태를 사용하여 형성됩니다. 이것은 정확한 크기의 작은 물방울이 형성되기 전에 전체 물 단계를 잃지 않기 위하여 microfluidic 체제가 빨리 달릴 필요가 있다는 것을 의미합니다.

주입이 완료되면 Valap을 사용하여 플로우 셀의 끝을 조심스럽게 닫습니다. 물방울이 움직임을 멈추지 않으면 밀봉이 완료되지 않았거나 기포가 유입되었을 수 있습니다. 장기 이미징을 위해 액적을 PDMS 컵으로 옮기고 오일 지질 혼합물 층으로 덮습니다.

실온에서 센트로솜을 해동하고 적절한 미세소관 핵형성을 보장하기 위해 섭씨 37도에서 20분 동안 둡니다. 기다리는 동안 얼음에서 분석 혼합물을 준비합니다. 여기에는 튜불린, GTP, 산소 제거제 시스템, 미세소관 가교제와 같은 분자력 발생기, ATP 및 ATP 재생 시스템이 포함되어야 합니다.

혼합이 완료되면 냉각된 Airfuge 로터에서 3분 동안 30psi로 샘플을 회전시킵니다. 그런 다음 예열된 센트로솜을 혼합물에 추가합니다. 방울당 하나 또는 두 개의 중심체를 얻기 위해 추가된 중심체의 양을 최적화합니다.

그런 다음 이 혼합물을 사용하여 앞서 설명한 대로 에멀젼 방울을 생성합니다. 액적 피질에서 비오틴화된 지질로 dynein을 모집하려면 GFP-dynein TMR 및 streptavidin을 수상에 포함하십시오. 회전 디스크 컨포칼 현미경에서 섭씨 26도에서 30분 후 미세소관 성장을 시각화합니다.

이미징하는 동안 온도를 섭씨 28도 또는 30도까지 높여 미세소관 성장을 촉진할 수 있습니다. Z-투영의 경우 1미크론 간격으로 스택을 가져오며, 이 경우 액적당 약 20개의 이미지가 필요합니다. 메인 카메라 패널로 이동하여 Z 편집을 클릭하고 Z 단계를 1.0으로 설정합니다.

다음을 클릭하여 설정을 저장합니다. 다음으로, Acquisition 패널에서 Camera(카메라) 탭을 클릭하고 EM Gain bar를 300으로 밀어 최대 선형 EM Gain을 설정합니다. 그런 다음 동일한 탭에서 노출 시간을 200밀리초로 설정합니다.

기록을 클릭하여 설정을 저장합니다. 라이브 이미징 실험의 경우 노출 시간을 약 100밀리초로 줄이고 Z 간격을 2미크론으로 늘려 2시간 동안 2분마다 Z 프로젝션을 만듭니다. 라이브 이미징 실험의 경우, 샘플의 고정화를 극대화하기 위해 일반 플로우 셀 대신 PDMS 컵을 사용하십시오.

설명된 프로토콜을 사용하여 중심체를 포함하는 물 및 오일 에멀젼 방울에서 과꽃 형성을 연구했습니다. 처음에는 중심체가 제한된 부피 내에서 자유롭게 확산됩니다. 약 20-30분 후, 첫 번째 미세소관이 보이기 시작하고, 미세소관이 피질에 대해 모든 방향으로 성장함에 따라 중심솜 확산이 제한됩니다.

미세소관이 액적 직경의 절반 이상으로 자라면 중심소관은 반대쪽 경계로 밀려나고 미세소관은 액적 피질을 따라 자랍니다. 스트렙타비딘이 없으면 다이메인이 액적 내에 확산됩니다. 그러나 스트렙타비딘을 사용하면 방울이 형성된 지 약 10분 이내에 다인이 비오틴화된 지질과 연결됩니다.

피질 다인(cortical dynein)이 있는 상태에서 형광 튜불린(fluorescent tubulin)을 볼 때, 중심체(centrosomes)가 중앙에 위치하는 것이 분명합니다. 반면에 dynein이 없으면 중심체는 액적의 반대쪽으로 밀려납니다. 이것은 아마도 dynein이 미세소관 재앙과 피질 당기는 힘을 촉진하여 과꽃의 중심을 잡기 때문일 것입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 미세 유체 기술을 사용하여 구형 에멀젼 액적에서 방추형과 같은 구조를 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면 액적 형성 및 이미징은 적절하게 수행될 경우 2-3시간 내에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 사용하면 다른 스핀들 어셈블리 계수를 캡슐화하여 스핀들 형태 및 포지셔닝에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다.

클로로포름 또는 PDMS를 사용하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.