구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

본 실험 절차의 전반적인 목표는 오일-인-워터(water in oil) 에멀젼 액적의 기하학적 구속 환경 내에서 유사 분열 방추 구조를 재구성하는 것입니다. 이 방법은 방추사가 어떻게 배치되고 조립되는지, 그리고 개별 구성 성분이 이러한 과정에 구체적으로 어떻게 기여하는지와 같은 분열 방추 조립 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분열 세포의 형태를 모방한 기하학적 구속 내에서 바텀업(bottom-up) 방식을 통해 방추 유사 구조를 재구성한다는 점입니다.

이 방법은 세포의 가둠(confinement)에 의존하는 다른 과정들을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. PDMS 전중합체 10부와 경화제 1부를 총 질량 약 40 g이 되도록 혼합합니다. 그런 다음, 기포를 제거하기 위해 혼합물을 진공 챔버에 약 30분 동안 둡니다.

그동안 몰드 주변에 알루미늄 호일을 감싸 지름 4인치, 깊이 1cm의 컵 모양을 만듭니다. 준비가 되면 PDMS 혼합물의 약 3/4을 몰드에 붓습니다. 그런 다음, PDMS를 다시 진공 챔버에 넣고 30분 동안 유지합니다.

탈기 후, 100 °C에서 1시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. 그동안 압축 공기로 먼지를 제거하여 스핀 코팅용 유리 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음, 남은 PDMS 혼합물을 슬라이드 위에 스핀 코팅합니다.

PDMS를 경화시키기 위해 이 슬라이드들을 100 °C에서 1시간 동안 큐어링합니다. 다음으로, 면도날을 사용하여 PDMS를 조심스럽게 벗겨내고, PDMS 스트립에 필요한 구멍을 뚫어 미세유체 칩을 제작합니다. 이제 미세유체 칩과 PDMS가 코팅된 유리 슬라이드를 수 초간 코로나 처리합니다.

마지막으로, 채널이 아래를 향하도록 각 유리 슬라이드 위에 마이크로플루이딕 칩을 배치하고, 100 °C에서 밤새 칩을 가열합니다. 먼저, 클로로포름으로 세척한 유리 기구를 사용하여 클로로포름에 용해된 지질 약 250 µg을 준비합니다. 불활성 가스를 이용하여 지질 혼합물을 조심스럽게 건조합니다.

그런 다음 이를 진공 챔버에 1시간 동안 둡니다. 이어서 지질을 미네랄 오일과 2.5% 계면활성제에 0.5 mg/mL 농도가 되도록 용해시키며, 이때 부피는 약 500 µL입니다. 지질을 완전히 용해시키기 위해 혼합물을 40 kHz에서 30분 동안 초음파 처리합니다.

다음으로, 현미경 대물렌즈에 맞는 두께로 커버 글라스 위에 PDMS를 스핀 코팅합니다. 그런 다음, 유리 슬라이드 위에 PDMS를 스핀 코팅합니다. 이제 PDMS가 코팅된 커버 글라스와 유리 슬라이드를 100 °C에서 1시간 동안 경화시킵니다.

그 다음, PDMS가 코팅된 유리 슬라이드 위에 실험실용 밀봉 필름을 얇게 잘라 촘촘하게 배치하여 유체 칩(flow cell)을 제작합니다. 3 mm 너비의 스트립을 약 2 mm 간격으로 배치하십시오. 그런 다음, PDMS가 코팅된 커버 슬립으로 유체 칩을 덮고, 100 °C에서 약 1분 동안 필름을 녹여 전체 조립체를 밀봉합니다.

가열 후, 커버 슬립을 부드럽게 눌러 고정하고 Valap으로 밀봉합니다. 다음으로, 장기 이미징을 위한 PDMS 컵을 준비합니다. 3 mm 두께의 PDMS 조각에 지름 4 mm의 구멍을 뚫습니다.

그 다음, PDMS 슬라이스와 PDMS가 코팅된 커버 글라스를 코로나 처리합니다. 처리가 완료되면 두 장을 서로 겹쳐 배치하고, 이 조립체를 100 °C에서 하룻밤 동안 굽습니다. 도립 명시야 현미경을 통해 액적의 형성을 관찰합니다.

지질 오일 상을 압력 조절기에 연결하고, 피크 튜브에서 오일 한 방울이 나올 때까지 압력을 높입니다. 피크 튜브를 마이크로플루이딕 칩의 두 번째 입구에 연결하십시오. 그런 다음, 두 번째 입구를 통해 지질 오일 상으로 마이크로플루이딕 칩을 완전히 채웁니다.

다음으로, 첫 번째 입구에서 MRB-80 기반의 수상을 도입합니다. 지질 오일상의 압력과 수상의 압력을 조절하여 직경이 약 15 µm인 액적을 생성함으로써 액적 크기를 제어합니다. 지질 오일상은 약 800 millibar, 수상은 200 millibar로 설정하는 것이 적절한 시작점입니다.

원하는 액적 크기를 얻은 후, 유동 셀을 액적으로 완전히 채웁니다. 이 액적들은 소량의 수상을 사용하여 형성됩니다. 이는 적절한 크기의 액적이 형성되기 전에 모든 수상을 소모하지 않도록 마이크로 유체 장치를 빠르게 작동시켜야 함을 의미합니다.

충전이 완료되면 Valap을 사용하여 플로우 셀의 양 끝을 조심스럽게 닫습니다. 액적의 이동이 멈추지 않는다면 씰링이 제대로 되지 않았거나 기포가 유입되었을 가능성이 있습니다. 장기 이미징을 위해서는 액적을 PDMS 컵으로 옮기고 오일 지질 혼합물 층으로 덮습니다.

중심체를 실온에서 해동하고, 미세소관 핵형성이 적절히 이루어질 수 있도록 37°C에서 20분 동안 둡니다. 기다리는 동안, 얼음 위에서 분석 혼합물을 준비합니다. 여기에는 tubulin, GTP, 산소 제거 시스템, 미세소관 가교제와 같은 분자 힘 생성기, ATP 및 ATP 재생 시스템이 포함되어야 합니다.

혼합 후, 냉각된 Airfuge 로터를 사용하여 30 psi에서 3분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 그런 다음, 미리 가열된 중심체를 혼합물에 첨가합니다. 물방울당 하나 또는 두 개의 중심체가 포함되도록 첨가하는 중심체의 양을 최적화하십시오.

그 다음, 이 혼합물을 사용하여 앞서 설명한 대로 에멀젼 액적을 생성합니다. 액적 피질의 비오틴화 지질로 다이네인을 모집하기 위해, 수상에 GFP-dynein TMR 및 streptavidin을 포함시킵니다. 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 26 °C에서 30분 후의 미세소관 성장을 시각화합니다.

이미징 중에 온도를 28°C 또는 30°C까지 높이면 미세소관의 성장을 촉진할 수 있습니다. Z-프로젝션을 위해 1 µm 간격으로 스택을 촬영하며, 이는 드롭렛당 약 20장의 이미지가 필요합니다. 메인 카메라 패널로 이동하여 Edit Z를 클릭하고 Z Step을 1.0으로 설정하십시오.

Next를 클릭하여 설정을 저장합니다. 다음으로, Acquisition 패널의 Camera 탭을 클릭하고 EM Gain 바를 300으로 슬라이드하여 최대 선형 EM Gain을 설정합니다. 그 다음, 동일한 탭에서 Exposure Time을 200 milliseconds로 설정합니다.

Record를 클릭하여 설정을 저장하십시오. 라이브 이미징 실험의 경우, 노출 시간을 약 100 milliseconds로 줄이고 Z 간격을 2 microns로 늘려 2시간 동안 2분마다 Z Projections를 수행하십시오. 라이브 이미징 실험 시에는 시료를 최대한 고정하기 위해 일반 유동 셀 대신 PDMS 컵을 사용하십시오.

설명된 프로토콜을 사용하여 중심체(centrosome)를 포함하는 수중유형(water-in-oil) 에멀젼 액적에서 방사형 미세소관(aster) 형성을 연구하였습니다. 초기에는 중심체가 제한된 부피 내에서 자유롭게 확산됩니다. 약 20~30분 후에 첫 번째 미세소관들이 보이기 시작하며, 미세소관이 모든 방향으로 피질(cortex)을 향해 성장함에 따라 중심체의 확산이 제한됩니다.

미세소관이 액적 지름의 절반보다 더 길게 성장하면, 중심체는 서로 반대편 경계로 밀려나며 미세소관은 액적 피질을 따라 성장합니다. streptavidin이 없을 때 dynein은 액적 내에 확산되어 있습니다. 하지만 streptavidin이 있는 경우, 액적 형성 후 약 10분 이내에 dynein이 biotinylated lipid에 결합됩니다.

피질 다이닌(cortical dynein)이 존재하는 상태에서 형광 튜불린(tubulin)을 관찰하면 중심체(centrosomes)가 중앙에 위치함이 분명하게 나타납니다. 반면 다이닌이 없을 때는 중심체가 액적의 반대 방향으로 밀려납니다. 이는 아마도 다이닌이 미세소관의 파괴(microtubule catastrophes)와 피질 견인력을 촉진하여 성상체(asters)를 중앙으로 집중시키기 때문인 것으로 보입니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 미세유체 기술을 사용하여 구형 에멀젼 액적 내에 방추사 모양의 구조를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙달되면, 적절한 수행 시 액적 형성 및 이미징은 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 통해 다른 방추사 조립 인자들을 캡슐화하여 방추사 형태 및 위치에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다.

chloroform 또는 PDMS를 사용할 때는 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.