Name: 공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: 배우세요 마우스 난모세포핵에서 세포골격 기반 교단이 핵 형태와 RNA 역학에 미치는 영향을 고급 영상 기법으로 분석하는 방법을. 이 연구는 여성 생식세포 생물학과 세포 역학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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A.A.J.와 M.A.가 원고를 공동 집필했으며 모든 공동 저자가 원고에 대해 논평했습니다. M.A.는 CNRS와 "Projet Fondation ARC"(PJA2022070005322)의 지원을 받습니다.A.A.J.는 Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel 및 Fondation du Collège de France의 지원을 받습니다.

Impact of cytoskeleton on nuclear shape and condensate dynamics in mouse oocytes(생쥐 난모세포의 핵 형태 및 응축물 역학에 대한 세포골격의 영향)

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<li>Barutcu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+nuclear+domain-associated+transcripts+reveals+speckles+and+lamina+as+hubs+of+functionally+distinct+retained+introns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns.</a> Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).</li>
<li>Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+stochastic%2C+motor-driven+properties+of+the+cytoplasm+using+force+spectrum+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li>
<li>Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+and+chromatin+behavior+follow+MAP+kinase+activity+but+not+MPF+activity+during+meiosis+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).</li>
<li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APCcdh1+activity+in+mouse+oocytes+prevents+entry+into+the+first+meiotic+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division.</a> Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).</li>
<li>El-Hayek, S., Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+oocyte+growth+and+development+by+intercellular+communication+within+the+follicular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche.</a> Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).</li>
<li>Dumont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+centriole-+and+RanGTP-independent+spindle+assembly+pathway+in+meiosis+I+of+vertebrate+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes.</a> J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).</li>
<li>Kaláb, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+RanGTP-regulated+gradient+in+mitotic+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells.</a> Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).</li>
<li>Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleolus+as+a+multiphase+liquid+condensate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleolus as a multiphase liquid condensate.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).</li>
<li>Terret, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOC1R%3A+a+MAP+kinase+substrate+that+control+microtubule+organization+of+metaphase+II+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes.</a> Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).</li>
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</ol>

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜의 주요 단계에는 생존 또는 정상 기능에 영향을 미치지 않는 난모세포의 적절한 미세주입(9,10,11)과 핵 반점과 같은 관련 구조의 정확한 시각화를 가능하게 하는 사전 정의된 양의 cRNA를 미세주입하는 것이 포함됩니다.
세포질과 (내)핵 역학 사이의 연관성을 확립하는 것은 세포골격이 핵 또는 그 내부를 어떻게 교반시키는지 연구할 때 필수적입니다. 이 프로토콜은 약간의 수정을 통해 세포질 교반 강도를 핵 YFP-Rango 또는 SRSF2-GFP 액적 역학과 연관시킴으로써 이를 허용합니다(11에서와 같이). 계속 진행하려면 먼저 명시야 모드에서 120초 동안 난모세포를 촬영하여 세포질 교반을 캡처한 다음, 491nm 레이저로 즉시 120초 동안 촬영하여 핵 윤곽 또는 액적 역학을 캡처해야 합니다. 핵 SRSF2-GFP 액적의 경우, 유효 확산 계수(이 프로토콜의 7단계 참조)를 이미지 상관 분석(이 프로토콜의 4단계 참조)을 사용하여 얻은 세포질 교반의 반전된 최대 강도 값과 비교하여 상관관계를 간단히 평가할 수 있습니다. 또 다른 중요한 점은 액적 표면 변동 분석을 위해 선택한 응축수의 크기입니다. 크기가 표면 변동의 강도를 조절하므로 편향을 방지하기 위해 비교 분석을 위해 유사한 직경의 액적을 선택해야 합니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 핵 외곽선 변동 분석은 YFP-Rango 또는 NLS-GFP와 같은 전체 핵 내 염색에 의존합니다. 핵 스페클에 대한 분석의 경우, 과도한 양의 SRSF2-GFP cRNA를 미세주입하면 이전에 다른 사람들이 검토한 바와 같이 이 응축수 마커의 상 분리 특성(그림 3C)에 명백한 변화가 발생할 수 있습니다26. 따라서 외인성 단백질 발현 프로파일이 내인성 단백질 발현 프로파일과 유사한지 확인하는 것이 중요합니다. 또한 상대적으로 작은 액적(반경 <2μm)은 여기에 정의된 도구를 사용한 공간 분해능의 한계로 인해 표면 변동 분석 파이프라인에서 제외해야 합니다. 이 해상도 문제는 일반적으로 더 해상도가 높은 현미경을 사용하여 해결할 수 있으며, 예를 들어 난모세포핵 또는 체세포의 상당히 작은 핵에서 더 작은 응축수의 표면 변동을 조사하는 데 필요할 수 있습니다.
전반적으로, 이 프로토콜은 스케일에 걸쳐 마우스 난모세포 핵의 액틴 및 미세소관 세포골격 기반 교반을 포착할 수 있습니다. 특히, 세포질의 세포골격 기반 동원, 핵 윤곽 변동, 액체와 같은 핵 반점 변위 및 표면 변동을 문서화할 수 있습니다. 다른 세포 유형에 대한 일부 연구는 개별 공간 규모에서 다양한 복잡성의 별개의 프로토콜을 통해 이러한 문제 중 일부를 다루지만(38,39,40), 이 간단한 프로토콜은 단일 작업 파이프라인에서 여러 규모에 걸쳐 언급된 세포 역학을 처리하는 데 필요한 도구를 처음으로 제공합니다. 더욱이, 이러한 접근법으로부터 생성된 데이터는,10,11에서와 같이 생물물리학적 모델링으로 보완될 때, 다음의 최소 침습적 평가를 가능하게 한다: i) 핵역학의 변화10; ii) 세포질 내의 세포골격 기반 활동력이 핵(11)의 응축물로 전달되는 것; iii) 서로 다른 세포 구획에 걸친 이 활성 에너지의 소산10,11. 중요한 것은, 이 프로토콜은 뉴클레소체(nucleolus)23와 같은 다른 핵 응축물뿐만 아니라 세포골격계 및 핵 응축물 거동 모두의 변화가 문서화된 암세포와 같은 다른 세포 유형에도 적용될 수 있기 때문에 다재다능하다는 것이다17,41.

핵 포지셔닝은 여러 세포 및 발달 기능에 필수적이다 1,2,3,4,5. 난모세포(oocyte)라고 불리는 포유류 암컷 생식세포는 크기가 비대칭적으로 분할됨에도 불구하고 세포질을 리모델링하여 세포중심에 핵을 위치시키는데, 이는 후속 염색체의 중심에서 벗어난 염색체에 의존합니다6(그림 1). 이러한 핵의 중심화는 생쥐와 인간에서 성공적인 난모세포 발달을 예측하며, 7,8 따라서 배아 형성 잠재력을 예측합니다(그림 1).
마우스 난모세포의 세포질 리모델링은 주로 악토미오신 세포골격(actomyosin cytoskeleton)9에 의해 주도됩니다(그림 2). 그 활동은 핵(10)을 교반하고, 재배치하고, 관통하는 기계적 힘을 발생시킨다(그림 2). 결과적으로, 이러한 세포질-핵질 힘 전달은 생체 분자 응축물 12,13,14,15,16으로 알려진 핵의 여러 막이 없는 소기관 중 하나인 핵 스페클 11이라고 불리는 핵 메신저 RNA 처리 소기관의 역학을 조정합니다(그림 2).
실시간 이미징은 핵 교반의 기능적 의미를 해독하는 데 결정적인 역할을 했습니다. 액틴 메쉬(actin mesh)와 벌크 세포질(bulk cytoplasm)에 대한 시간적 해상도가 높은 영상뿐만 아니라, 몇 시간에 걸친 핵 이동에 관한 영상은 서로 다른 시간 척도를 연결하는 핵 위치 결정(nuclear positioning)에 대한 이론적 모델을 정교화하는 데 크게 기여했다9. 또한, 세포질, 핵 윤곽 및 염색질 및 핵 응축물과 같은 핵 구성 요소의 높은 시간 해상도 동영상은 쥐 난모세포에서 RNA 처리 및 유전자 발현에 대한 핵의 세포골격 기반 교반의 역할을 강조하여 세포 내의 다양한 시공간 규모를 연결했습니다10,11. 전체적으로, 실시간 이미징을 기반으로 한 이러한 스케일 교차 접근 방식은 핵의 세포골격 교반과 난모세포의 발달 성공을 연결하는 첫 번째 이론적 근거를 제공했습니다.
이 프로토콜은 생쥐 난모세포의 핵 및 내부 구성 요소로의 세포질 힘(주로 F-액틴에 의해 생성되고 부분적으로 미세소관에 의해 생성됨)의 전달을 연구하는 데 사용되는 이미징 및 이미지 분석 파이프라인을 제공합니다. 이러한 실험의 결과는 최근 두 가지 연구10,11에서 볼 수 있듯이 세포질의 세포골격에서 핵 내부에 이르기까지 공간적 규모에 걸쳐 힘의 연속체를 포착하는 것이며, 이는 세포질 활성 운동, 핵 윤곽의 변동, 단일 유형의 핵 생체 분자 응축물의 움직임 및 표면 변동 사이의 연관성을 확립했습니다. 핵 얼룩. 동일한 접근법이 악성 암세포(17)의 맥락에서와 같이 세포질 힘이 변화할 것으로 예상되는 다른 모델 시스템에도 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1-M1 회전 디스크</td><td>요코가와</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMI6000B 현미경&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet 마이크로인젝터</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터 휠</td><td>Sutter Instruments Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorodish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 소프트웨어&nbsp;</td><td>유니버설 이미징,&nbsp;</td><td></td><td>버전 7.7.9.0</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OF1 및 C57BL/6 마우스&nbsp;</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) 테일링 키트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Retiga 3 CCD 카메라&nbsp;</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAeasy 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SC35 항체</td><td>Abcam</td><td>ab11826</td><td>핵 반점 항체; 마우스 IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)</td></tr><tr><td>SRSF2-GFP 플라스미드;</td><td>&nbsp; OriGene Technologies</td><td>MG202528</td><td>NM_011358</td></tr><tr><td>스트리퍼 마이크로피펫</td><td>&nbsp; XLAB 난</td><td>자 수집에 특화된</td>솔루션 <td></td></tr><tr><td>T3 mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1384&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage mMachine&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM13344</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 챔버</td><td>생명 이미징 서비스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows Excel</td><td>Windows</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

여성 불임의 원인을 이해하는 데 있어 가장 큰 어려움은 난모세포라고 하는 여성 생식세포의 발달을 관장하는 메커니즘을 밝히는 것입니다. 난모세포의 발달은 세포 성장과 후속 분열로 특징지어지며, 난모세포가 정자와 융합하여 배아 발생을 시작할 수 있도록 준비하는 두 가지 중요한 단계입니다. 성장하는 동안 난모세포는 세포질을 재조직하여 세포중심에 핵을 위치시키는데, 이는 생쥐와 인간의 성공적인 난모세포 발달을 예측하여 배아 생성 가능성을 예측하는 사건입니다. 쥐 난모세포에서 이러한 세포질 재편성은 세포골격에 의해 주도되는 것으로 나타났으며, 세포골격의 활동은 핵을 교반하고, 재배치하고, 관통하는 기계적 힘을 생성합니다. 결과적으로, 이 세포질에서 핵질로의 힘 전달은 생체 분자 응축물로 알려진 핵 RNA 처리 소기관의 역학을 조정합니다. 이 프로토콜은 높은 시간적 해상도로 생쥐 난모세포의 공간 규모에 걸쳐 세포골격이 핵에 미치는 영향을 문서화할 수 있는 실험적 프레임워크를 제공합니다. i) 난모세포 세포질의 세포골격 활성, ii) 난모세포핵의 세포골격 기반 교반, iii) 난모세포 핵의 생체 분자 응축물 역학에 미치는 영향을 평가하는 데 필요한 이미징 및 이미지 분석 단계와 도구를 자세히 설명합니다. 난모세포 생물학 외에도, 여기에 설명된 방법은 체세포에서 사용하여 규모 전반에 걸쳐 핵 역학의 세포골격 기반 조정을 유사하게 해결할 수 있습니다.

도 3의 이미지 패널은 전형적인 완전히 성장한 난모세포(그림 3A), YFP-Rango를 발현하는 완전히 성장한 난모세포의 핵질(그림 3B), 올바르게 발현하는 완전히 성장한 난모세포의 핵질(왼쪽 패널; 그림 3C) 또는 과도한(오른쪽 패널; 그림 3C) SRSF2-GFP cRNA의 투여량과 SC35 항체를 사용하여 완전히 성장한 난모세포에서 핵 반점의 면역염색(그림 3D). 마이크로주입에 대한 SRSF2-GFP cRNA의 정확한 투여량은 SRSF2-GFP의 발현 프로파일과 핵 반점의 내인성 프로파일 간의 시각적 비교를 기반으로 정의되었습니다.
STICS 벡터 맵과 이미지 상관 분석(9 및11 참조)을 사용한 실험실의 이전 연구에서 알 수 있듯이 난모세포의 세포질 교반력은 유전적(예: FMN2 돌연변이 마우스) 및 화학적(예: Cytochalasin D) 세포골격 섭동에 의해 감소할 수 있습니다. 대조군 난모세포의 STICS 맵은 높은 유속을 나타내는 색상과 함께 수많은 벡터를 표시하는 반면, 세포골격력이 파괴된 난모세포 맵은 낮은 유속을 나타내는 색상으로 더 적은 벡터를 표시합니다. 마찬가지로, 이미지 상관관계는 세포골격 힘이 파괴된 난모세포에 비해 대조군 난모세포에서 매우 빠르게 손실됩니다. 이는 상관 곡선에서 관찰할 수 있으며, 세포골격력이 파괴된 난모세포에 비해 대조군 난모세포에 대한 곡선이 더 빨리 감소하거나9 곡선이 반전될 때 더 빠르게 증가한다11.
세포골격은 핵과 내부 소기관, 특히 핵 반점10,11과 같은 핵 응축물을 동요시킵니다. 그림 4A에서 대조군 난모세포의 핵은 중요한 말초 변동을 받으며, 이는 핵 프로브 YFP-Rango를 사용하여 볼 수 있습니다. 세포골격력이 파괴된 난모세포의 핵 모양은 시간이 지남에 따라 안정적입니다(그림 4C). 핵 윤곽 변동 분석은 교반을 정확하게 정량화하는 데 중요합니다. 핵 중심에서 주변부까지의 거리 분산(r-R)2(그림 4B)을 측정하여 변동을 정량화할 수 있으며, 핵 교반은 세포골격력이 파괴된 난모세포보다 대조군 난모세포에서 6배 더 높다는 것을 보여줍니다10. 그림 5A-B에서 핵 스페클(SRSF2-GFP+ 액적)은 높은 시간 분해능에서 세포질 힘의 제어 및 교란 컨텍스트에 표시됩니다. 대조군에서 액적 표면은 세포질력이 파괴된 난모세포의 액적 표면보다 훨씬 더 많이 변동하며, 이는 Radioak32 플러그인을 사용하여 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 시각적으로 녹색과 빨간색(그림 5A-B의 하단 이미지에서 볼 수 있는 Radioak 출력)은 플러그인이 연속된 이미지 사이의 표면 변화를 감지한 각도를 나타내고 흰색은 표면 변화가 없음을 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig01.jpg"> 그림 1: 후기 생쥐 난자형성과 초기 배아형성의 그림. 난모세포 성장 후반에 발생하는 핵 센터링, 난모세포 분열 중에 발생하는 염색체 오프 센터링, 배아 발생의 초기 단계(1세포 및 2세포 단계)의 그림. 여성 게놈(난모세포핵과 암컷 전핵)은 분홍색, 남성 전핵은 파란색입니다. 배아 핵(부모 게놈의 융합 후)은 보라색입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig02.jpg"> 그림 2: 성장하는 쥐 난모세포의 규모에 따른 세포질 및 핵 리모델링의 그림. 이 그림은 9,10,11의 주요 결과를 요약한 것입니다. 시공간 규모에 걸친 세포질의 악토미오신 기반 리모델링, 핵 교반 및 기능적 핵 생체 분자 응축물 리모델링의 그림. 핵 반점의 스케일 크로싱 리모델링은 그 기능과 관련된 생체 분자 반응(즉, pre-mRNA의 스플라이싱)을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 모든 이미징이 이미지 프레임 간에 0.5초의 동일한 시간적 해상도로 수행되기 때문에 공간 규모에 대해서만 핵 교반을 평가할 수 있지만 시간적 규모는 평가할 수 없습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig03.jpg"> 그림 3: 완전히 성장한 난모세포와 핵형질의 샘플 이미지. (A) 핵소체를 둘러싸고 있는 염색질(청록색)을 보여주는 완전히 성장한 난모세포의 명시야 이미지. 점선으로 된 흰색 원이 핵의 윤곽을 그립니다. (B) YFP-Rango를 발현하는 살아있는 난모세포핵; 핵소체에 형광이 없다는 점에 유의하십시오. (C) 정확한 용량의 cRNA(왼쪽 패널) 또는 고용량의 cRNA(오른쪽 패널)를 미세주입한 후 SRSF2-GFP를 발현하는 살아있는 난모세포핵의 예; 왼쪽에는 응축(물방울) 및 용해된 단계가 있고 오른쪽에는 조건이 없습니다. (D) 고정된 난모세포에서 핵 스페클 면역염색; C (왼쪽 패널)에 있는 것과 비교할 수 있는 내생 표현 프로파일에 주목하십시오. 스케일 바 = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig04.jpg"> 그림 4: 제어 및 교란된 핵 윤곽 변동의 플러그인 출력. (A) YFP-Rango(위)를 발현하는 대조군 난모세포핵과 Ovocyte_nucleus 플러그인에 의해 생성된 해당 이진 마스크(아래)의 타임랩스. (B) 핵 외곽선 변동의 원리 시간 경과에 따른 및 주어진 방향으로의 측정. 방향은 0°에서 360°까지 1°씩 증가하는 회전 각도 θ로 정의됩니다. t=0초(노란색) 및 t=135초(보라색)에 있는 두 개의 대표적인 모양이 표시됩니다. 파란색 모양은 시간 경과에 따른 평균 모양에 해당합니다. (C) F-액틴(FMN2 돌연변이 마우스)과 미세소관(노코다졸 처리,10에서와 같이)의 파괴로 인해 세포골격력이 감소한 난모세포에서 핵의 핵 윤곽 변동. 스케일 바 = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig05.jpg"> 그림 5: 제어 및 중단된 액적 표면 변동의 플러그인 출력. (A) 프레임당 500ms로 이미징되고 LUT(Ice Look Up Table)에 표시된 대조군 SRSF2-GFP 핵 방울의 크롭(상단); 피지(Fiji)에 의해 생성된 동일한 물방울의 바이너리 마스크(중앙); 및 Radioak 플러그인은 액적(하단)의 표면 변동을 분석한 후 출력하며, 녹색과 빨간색은 플러그인이 연속된 이미지 사이의 표면 변화를 감지한 각도를 나타내고 흰색은 표면 변화가 없음을 나타냅니다. (B) F-액틴과 미세소관의 파괴로 인해 세포골격력이 감소한 난모세포에서 핵 방울의 표면 변동(11에서와 같이). 스케일 바 = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: Ovocyte_nucleus 플러그인 분석 출력의 예. 그림 4A에 표시된 것과 동일한 핵이 분석되었습니다. 세타(θ)는 각도(도)이고 t1에서 t600은 프레임 번호에 해당하며 시간으로 변환할 수 있습니다. 반지름은 μm 단위입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%201_Ovocyte_nucleus%20output%20example.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 2: 핵 윤곽 변동을 계산하는 데 사용되는 샘플 스프레드시트. 그림 4A에 표시된 것과 동일한 핵이 분석되었습니다. 세타(θ)는 각도(도)이고 t1에서 t600은 프레임 번호에 해당하며 시간으로 변환할 수 있습니다. 탭 원시 및 평균: 반지름은 μm 단위입니다. 탭 r-R: r-R 거리는 μm 단위입니다. 표 (r-R)2: 변동 값은μm2 단위입니다. 탭 x와 y는 원시 및 평균 탭의 반지름에 대한 데카르트 좌표에 해당합니다. 그들은 평균 모양 탭에서 시간 경과에 따른 핵의 평균 모양을 그릴 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%202_Nuclear%20outline%20fluctuations%20analysis%20example_RE.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 3: Radioak 플러그인 분석 출력의 예. 그림 5A에 표시된 것과 동일한 액적을 분석했습니다. 뚜렷한 시점과 각도에서 측정된 반경이 표시됩니다. 반지름은 μm 단위입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%203_%20Radioak%20output%20example.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 4: 핵방울 표면 변동을 계산하는 데 사용되는 샘플 스프레드시트. 그림 5A에 표시된 것과 동일한 액적을 분석했습니다. 세타(θ)는 각도(도)이고 t1에서 t600은 프레임 번호에 해당하며 시간으로 변환할 수 있습니다. 탭 원시 및 평균: 반지름은 μm 단위입니다. 탭 r-R: r-R 거리는 μm 단위입니다. 표 (r-R)2: 변동 값은μm2 단위입니다. 탭 x와 y는 원시 및 평균 탭의 반지름에 대한 데카르트 좌표에 해당합니다<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%204_Droplet%20fluctuations%20analysis%20example_RE.xlsx" target="_blank">. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 생쥐 난모세포 시스템의 핵 모양과 내부 막이 없는 세포 소기관에 대한 세포골격의 물리적 영향을 문서화하기 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 이 프레임워크는 다른 세포 유형 및 컨텍스트에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...

이 연구실은 마우스 난모세포 모델 시스템을 사용하여 유성 종의 번식에 필수적인 암컷 영역의 양 획득과 관련된 메커니즘을 더 잘 이해하는 것을 목표로 합니다. 최근에 우리는 핵과 그 내용물의 교반을 촉진하여 마우스 난모세포에서 모계 RNA의 미세 조절로 이어지는 새로운 기계적 형질 전달 과정을 확인했습니다. 이 프로토콜에 제시된 이미징 및 이미지 분석 파이프라인을 통해 세포질에서 핵 및 그 구성 요소(마우스 난모세포의 핵 RNA 처리 본체 포함)에 이르는 규모에 걸쳐 연속체로서 세포골격력의 전달을 강조할 수 있습니다.이 프로토콜은 단일 파이프라인에서 여러 세포 규모에 걸친 첫 번째 전송을 처음으로 처리할 수 있는 간단한 도구를 제공합니다. 생물물리학적 모델링으로 보완된 이 프로토콜은 핵 역학의 변화와 세포 구획에 걸친 에너지 소실을 해결하기 위한 비침습적 기술을 구성합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Oocytes는 meiotic 성숙하는 동안 염색체 분리의 오류로 인해 aneuploidy하는 경향이 있습니다. Aneuploid 계란은 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애를 일으킬 수 있습니다. 여기서 우리는 oocytes과 meiotic 성숙을 연구하고 ploidy 평가 방법에 선택의 자료를 소개하는 방법을 설명합니다.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다.

siRNA를 매개 음소거로 마우스 난 모세포의 감수 스핀들 평가

우리는 성숙한 초파리 난모세포의 수집, 준비 및 이미징을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 방법을 사용하면 염색체 거동과 방추체 조립 및 감수분열 중 기능을 시각화할 수 있습니다.

고정의 이미지 Prometaphase 및 중기 감수 분열의 I위한 기술<em&gt; 초파리</em&gt; 난 모세포

여기, 선물이 oocyte 발달 능력 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포에서 분열 II 단계 동안 수행의 비-침략 적 평가 대 한 프로토콜. 이 방법은 입자 이미지 velocimetry (PIV)와 신경망 분석 시간 경과 영상을 결합합니다.

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Drosophila에서,oocyte 핵은 oogenesis 도중 microtubule 의존적인 이주를 겪습니다. 여기서, 우리는 계란 챔버 전 vivo에라이브 이미징을 수행하여 마이그레이션을 따라 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 우리의 절차는 회전 디스크 공초점 현미경 검사를 사용하여 다중 위치 3D 타임 랩스 영화를 취득하기 위해 12 시간 동안 살아있는 계란 챔버를 유지합니다.

드로소필라 오키테의 핵 이주

근적외선 펨토초 레이저를 사용하여 중기 I 동안 마우스 난 모세포에서 세포질 미세 소관 조직 중심의 고갈을 가능하게하는 최적화 된 프로토콜이 제시됩니다.

마우스 난모세포에서 세포질 미세소관 조직 센터의 다광자 레이저 제거

염색체 분리의 오류는 난 모세포에서 공통적 인 특징입니다. 따라서 스핀들 어셈블리 체크 포인트를 연구하면 건강한 알을 생산하는 데 필요한 메커니즘에 대한 중요한 단서를 얻을 수 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 난모세포에서 스핀들 어셈블리 체크포인트 무결성을 평가하기 위한 세 가지 보완 분석을 설명합니다.

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

난소암의 Orthotopic 동물 모델은 더 나은 인간의 질병을 복제하기 때문에 암 진행 및 치료 종양 반응의 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 마우스 모델 루시페라제 - 표현 난소 종양 세포의 intrabursal 주사를 받게됩니다. 치료는 경구 gavage를 통해 관리합니다. 종양 성장에 의해...

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

배우세요 마우스 난모세포핵에서 세포골격 기반 교단이 핵 형태와 RNA 역학에 미치는 영향을 고급 영상 기법으로 분석하는 방법을. 이 연구는 여성 생식세포 생물학과 세포 역학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처

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