투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현은 포유 동물 숙주 세포에서 분비 세균 독소의 효과를 연구하기

이 투과성 멤브레인 삽입 기반 감염 시스템의 전반적인 목표는 감염 중 분비된 박테리아 독소가 숙주 세포에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이 방법은 박테리아 감염 중 특정 분비 박테리아 성분이 숙주 세포 반응에 어떻게 기여하는지와 같은 숙주-병원체 상호 작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분비된 박테리아 구성 요소를 연구할 수 있고 인간 감염의 맥락에서 생리학적으로 관련된 숙주 병원체 환경을 보다 밀접하게 모델링할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 선임 대학원생인 Rebecca Flaherty입니다. 동종 야생형 그룹 A 연쇄상구균(GAS) 및 GAS M1T1 5448 돌연변이 균주를 준비하려면 5-10ml의 Todd Hewitt 육수를 접종하고 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양하여 하룻밤 동안 액체 배양을 시작합니다. 하룻밤 동안 박테리아 배양물을 원심 분리하고 원래 부피의 신선한 박테리아 배지를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 동일한 OD600에 도달하기 위해 재부유 배양물을 추가 배지에서 희석하여 박테리아 배양물을 동일한 시작 농도로 정규화합니다. 신호 분석 및 ATP 측정 분석을 수행하기 위한 용해물을 수집하려면 6웰 접시에 HaCaT 세포를 웰당 5번째 세포에서 10까지 약 3배의 좌석 밀도로 플레이트화하고 90% 합류점까지 배양합니다. 에티듐 호모다이머 막 투과화 및 젖산 탈수소효소 방출 분석을 수행하려면 24웰 접시에 HaCaT 세포를 웰당 4번째 세포까지 약 5배 10의 좌석 밀도로 플레이트화하고 90% 합류점까지 성장시킵니다.

치료 직전에 1x PBS를 사용하여 세포를 세척하십시오. 그런 다음 약물 처리 유무에 관계없이 2ml의 신선한 성장 배지를 6웰 플레이트에 적용하거나 0.5ml의 배지를 24웰 플레이트의 웰에 적용합니다. 다음으로, 층류 후드 아래에서 멸균 집게를 사용하여 멸균 0.4 미크론 투과성 멤브레인 인서트를 각 웰에 조심스럽게 놓습니다.

감염 준비 중 투과성 삽입물을 부드럽고 멸균적으로 취급하는 것은 이 과정에서 멤브레인이 손상되거나 오염되는 것을 방지하는 데 매우 중요합니다. 제조업체의 지침에 따라 각 웰의 상부 챔버에 신선한 세포 배양 배지를 적용합니다. 그런 다음, 정규화된 박테리아 배양액을 적절한 부피의 투과성 멤브레인 삽입 시스템의 상부 챔버에 적용하고 박테리아 배지를 대조 웰에 적용합니다.

실험 설정 중에 박테리아가 하부 챔버를 오염시키지 않도록 하는 것이 중요하기 때문에 상부 챔버에 박테리아를 조심스럽게 추가하고 감염된 세포를 인큐베이터로 부드럽게 운반하는 것이 중요합니다. 분비된 숙주 단백질을 평가하려면 멸균 집게를 사용하여 투과성 멤브레인 삽입물을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 세포의 단층을 방해하지 않으면서 하부 챔버의 배지를 1.5 밀리리터 튜브로 수집합니다.

14, 000 RCF 및 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다. 그런 다음 50마이크로리터를 제외한 상층액을 모두 제거하고 새 1.5ml 튜브에 옮겨 담아 영하 20도에서 보관하거나 즉시 사용하십시오. 숙주 세포 용해물을 평가하려면 숙주 세포를 방해하지 않고 단층 위의 배지를 부드럽게 흡인합니다.

그런 다음 PBS를 사용하여 세포를 한 번 헹굽니다. PBS를 부드럽게 흡인하고 즉시 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 대량으로 적용하여 예를 들어 밀리리터당 0.5 - 1.5 밀리그램의 단백질 농도를 달성합니다. 그런 다음 얼음 위에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.

다음으로, 셀 스크레이퍼를 사용하여 각 웰의 플레이트 표면에서 셀을 분리하고 각 웰의 전체 내용물을 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 14, 000 RCF 및 섭씨 4도에서 20분 동안 샘플을 원심분리합니다. 용해성 용해 성분을 평가하려면 상층액을 새 튜브로 옮기고 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 즉시 사용하십시오.

핵 또는 기타 불용성 용해물 성분을 평가하려면 펠릿을 보관하고 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 즉시 사용하십시오. 면역형광 이미징을 통한 평가를 위해 배지를 흡인하고 1x 차가운 PBS를 사용하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 4% PFA 및 PBS로 밤새 세포를 고정합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 추가 분석을 수행합니다. 여기에 표시된 웨스턴 블롯 데이터는 스트렙톨리신 S 또는 SLS 생성 가스 균주가 존재할 때 p38 MAP 키나아제 활성화 및 각질세포가 크게 향상되었음을 보여주며, 이는 이 시스템이 접촉 독립적 숙주 신호 단백질의 활성화 변화를 평가하는 데 사용될 수 있음을 나타냅니다. 이 그림에서는 활성화 시 세포질에서 핵으로 전위되는 주요 염증 매개체인 핵 인자인 카파 B의 SLS 의존적 활성화가 표시되어 있으며, 이는 이 시스템이 면역형광 현미경 접근법을 사용하여 숙주 단백질 반응에 대한 분비된 박테리아 인자의 영향을 시각화하는 데 사용될 수 있음을 나타냅니다.

여기서, 감염되지 않은 세포 또는 SLS 결핍 균주에 노출된 세포에 비해 SLS 생성 가스 균주에 노출된 후 막 투과화와 숙주 세포로부터의 LDH 방출이 모두 크게 증가하는 것으로 입증되었습니다. 이러한 결과는 이 시스템이 숙주 세포 독성의 독소 의존성 변화를 평가할 수 있음을 나타냅니다. 이 실험에서는 각질세포의 ATP 수치와 가스 감염에 대한 반응을 측정했습니다.

감염 후 16시간 후에 ATP의 현저한 감소가 관찰되었으며, ATP의 손실은 SLS가 있을 때 더 두드러졌는데, 이는 숙주 스트레스 반응 신호 및 독성의 독소 의존성 증가와 일치했습니다. 일단 확립되면 이 기술은 다양한 숙주 세포 유형에서 분비된 미생물 인자의 특정 반응을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 실행하는 동안 실험 설정 단계 전반에 걸쳐 멸균 기술을 연습하고 초기 설정 중과 샘플 수집 중에 투과성 멤브레인 인서트를 주의 깊게 취급하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 웨스턴 블로팅(western blotting), 면역형광 이미징 및 멤브레인 투과화 분석과 같은 방법을 수행하여 관심 박테리아 인자가 신호 캐스케이드의 변화에 어떻게 기여하고 감염 중 전반적인 세포 독성에 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 특정 분비 관심 박테리아 인자에 노출된 후 다양한 숙주 세포 반응을 평가하기 위해 숙주 세포 샘플을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 박테리아 병원체와 같은 생물학적 유해 물질을 취급하려면 특정 안전 고려 사항이 필요하다는 것을 잊지 마십시오.

이러한 실험을 안전하게 수행하기 위해서는 보안경, 장갑 및 실험복의 적절한 사용과 생물 안전 후드의 적절한 사용이 필요합니다.