민감한 면역를 사용하여 시토신의 수정 된 형태의 검출

이 면역화학 프로토콜의 전반적인 목표는 과산화효소 접합 2차 항체 및 티라마이드 신호 증폭의 사용을 기반으로 다양한 조직 및 세포 맥락에서 변형된 형태의 시토신의 공간 분포를 평가하는 것입니다. 이 방법은 변형된 형태의 시토신의 생물학적 기능을 이해하는 데 필요한 공간 정보를 제공하지 않는 다른 기술의 한계를 극복합니다. 또한 이 방법은 단백질 계통 마커와 변형된 형태의 시토신을 공동 검출할 수 있으며 핵 국소화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 야생형 CD1 마우스 배아와 성인 뇌 조직의 재수화된 조직 절편을 실온에서 15분 동안 얼음처럼 차가운 4% PFA 또는 4% FA에 넣어 고정합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 PBS로 섹션을 세척하여 여분의 정착제를 제거합니다. 다음으로, PBX로 채워진 Coplin 병에 실온에서 30분 동안 조직 단면을 투과화합니다.

그런 다음 PBT에서 섹션을 간단히 세척하여 초과 PBX를 제거합니다. 이제 DNA 탈정제를 위해 실온에서 60분 동안 투과화된 절편을 2N HCl에 놓습니다. 그런 다음 절편을 실온에서 30분 동안 10밀리몰 Tris-Hcl로 옮겨 HCl을 중화합니다.

또는 PBS에서 각각 5분씩 섹션을 세 번 세척합니다. PBT에서 절편을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 조직 부분을 둘러싼 영역에서 액체를 조심스럽게 제거하십시오.

그 동안 조직 부분을 촉촉하게 유지하십시오. 소수성 장벽 펜을 사용하여 섹션을 건드리지 않고 둘러쌉니다. 그 후, 100 마이크로 리터의 차단 용액에 절편을 습한 챔버의 실온에서 1 시간 동안 배양합니다.

그런 다음 100 마이크로리터의 마우스 단클론 항-5hmC 1차 항체와 1:1000 희석된 토끼 다클론 항-5caC 1차 항체를 차단 용액에 100 마이크로리터로 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양을 수행합니다. 다음으로, PBT를 채운 Coplin 병에 실온에서 각각 5분씩 3회 세척하여 과도한 항체를 제거합니다.

그런 다음 과도한 PBT를 제거하고 필요한 경우 PBT에는 소수성 장벽을 약화시킬 수 있는 세제가 포함되어 있으므로 소수성 장벽 펜으로 섹션을 다시 둘러쌉니다. 그 후, 염소 항토끼 HRP-접합 항체를 1:400 희석하고 당나귀 항-마우스 555-접합 항체를 차단 용액에 1:400 희석합니다. 그런 다음 2차 항체 혼합물 100마이크로리터에 조직 절편을 습한 챔버의 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 PBT를 채운 Coplin 병에 조직 부분을 넣고 실온에서 각각 5분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 조직 절편을 100마이크로리터의 티라마이드로 옮기고 티라미드 신호 증폭 버퍼에서 1:200으로 희석하여 실온에서 2분 동안 이동합니다. 배양 시간은 티라미드 용액이 신호 강도와 티라미드 기반 신호 증폭 지속 시간 사이의 선형 관계가 관찰되는 티라미드 신호 증폭 키트의 각 개별 배치에 대해 실험적으로 최적화되어야 한다는 것이었습니다.

그 직후, PBT에서 슬라이드를 각각 5분씩 3회 세척하여 과도한 티라마이드 용액을 제거합니다. 여분의 PBT를 조심스럽게 제거하고 즉시 장착 매체 한 방울로 섹션을 덮습니다. 티슈 부분에 커버 슬립을 부드럽게 놓고 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉합니다.

그런 다음 현미경 검사 전에 몇 시간 동안 조직 절편을 섭씨 4도로 유지하십시오. 뇌 조직 절편에서 5hmC의 분포를 결정하기 위해, 이 후성유전학적 변형의 동시 검출은 유사분열 후 뉴런에 대한 마커인 NeuN과 함께 수행되었습니다. 면역조직화학 분석을 통해 두드러진 5hmC 염색이 NeuN 양성 세포와 공동 국소화된 반면, NeuN 음성 신경교세포는 더 낮은 수준의 게놈 5hmC를 가지고 있는 것으로 나타났습니다.

신경 줄기세포 분화에서 5caC의 분포를 결정하기 위해, 신경교세포 분화 유도 3일 후 신경 줄기세포의 고정 배양액에 대해 이 마커인 GFAP를 사용하여 이 마커를 코staining했습니다. 신경 줄기세포나 성숙한 성상세포와 달리 GFAP를 발현하는 많은 세포에서 강력한 5caC 신호가 관찰되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 8시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 모든 시약과 재료를 샘플과 함께 준비해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 변형된 형태의 시토신의 핵 분포에 대한 추가 질문에 답하기 위해 컨포칼 이미징을 수행할 수 있습니다. 이것은 그들의 잠재적인 생물학적 기능을 해독하는 데 기여할 수 있습니다.

2N Hcl로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 안전 캐비닛 및 보호복과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.