민감한 면역를 사용하여 시토신의 수정 된 형태의 검출

본 면역화학 프로토콜의 전반적인 목표는 peroxidase가 결합된 2차 항체와 tyramide 신호 증폭법을 사용하여 다양한 조직 및 세포 환경에서 시토신 변형 형태의 공간적 분포를 평가하는 것입니다. 이 방법은 시토신 변형 형태의 생물학적 기능을 이해하는 데 필요한 공간 정보가 제공되지 않는 다른 기술들의 한계를 극복합니다. 또한, 이 방법은 시토신 변형 형태를 단백질 계통 마커와 함께 공동 검출할 수 있게 하며, 이들의 핵 내 국소화를 연구하는 데 활용될 수 있습니다.

이 실험 절차를 시작하려면, 재수화된 야생형 CD1 마우스 배아 및 성체 뇌 조직 절편을 얼음처럼 차가운 4% PFA 또는 4% FA에 넣고 실온에서 15분 동안 고정합니다. 그 다음, 실온에서 PBS로 5분 동안 절편을 세척하여 과량의 고정액을 제거합니다. 이어서, PBX가 채워진 Coplin jar에 조직 절편을 넣고 실온에서 30분 동안 투과화시킵니다.

그 후, 절편을 PBT로 짧게 세척하여 과량의 PBX를 제거합니다. 이제 투과화된 절편을 DNA 탈푸린화를 위해 2 N HCl에 넣고 상온에서 60분 동안 둡니다. 그런 다음, HCl을 중화시키기 위해 절편을 10 millimolar Tris-Hcl로 옮겨 상온에서 30분 동안 둡니다.

또는, 절편을 PBS로 5분씩 세 번 세척합니다. 절편을 상온의 PBT에서 5분 동안 배양합니다. 그 후, 조직 절편 주변 영역의 액체를 조심스럽게 제거합니다.

그동안 조직 절편이 마르지 않도록 유지하십시오. 소수성 배리어 펜을 사용하여 절편에 닿지 않게 주변을 둘러쌉니다. 그 후, 습윤 챔버 내의 상온에서 100 µL의 블로킹 용액에 절편을 넣고 1시간 동안 배양합니다.

그 다음, 조직 절편을 블로킹 용액에 희석한 1:5000 배율의 마우스 단클론 항-5hmC 1차 항체 100 µL와 1:1000 배율의 토끼 다클론 항-5caC 1차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 또는, 4 °C에서 하룻밤 동안 배양을 수행할 수도 있습니다. 이어서, PBT가 채워진 Coplin jar에서 실온으로 5분씩 3회 세척하여 과잉 항체를 제거합니다.

그런 다음, 과잉의 PBT를 제거하고, PBT에 포함된 세제가 소수성 장벽을 약화시킬 수 있으므로 필요한 경우 소수성 장벽 펜으로 섹션을 다시 둘러쌉니다. 이어서, 블로킹 용액으로 goat anti-rabbit HRP-conjugated antibody를 1:400으로 희석하고 donkey anti-mouse 555-conjugated antibody를 1:400으로 희석하여 준비합니다. 그 후, 조직 섹션을 100 µL의 2차 항체 혼합액에 넣고 습윤 챔버 내 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

그 후, PBT가 채워진 Coplin jar에서 조직 절편을 상온에서 5분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 조직 절편을 tyramide signal amplification buffer로 1:200으로 희석한 tyramide 100 microliters에 옮겨 상온에서 2분 동안 반응시킵니다. 신호 강도와 tyramide 기반 신호 증폭 지속 시간 사이에 선형 관계가 관찰되므로, 배양 시간과 tyramide 용액은 사용하는 각 tyramide signal amplification kit 배치별로 실험을 통해 최적화해야 합니다.

직후에, PBT로 슬라이드를 5분씩 3회 세척하여 과잉 tyramide 용액을 제거합니다. 과잉 PBT를 조심스럽게 제거하고 즉시 절편 위에 마운팅 매질 한 방울을 떨어뜨려 덮어줍니다. 조직 절편 위에 커버 슬립을 부드럽게 얹고 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉합니다.

그 다음, 현미경 관찰 전까지 조직 절편을 4 °C에서 몇 시간 동안 보관합니다. 뇌 조직 절편 내 5hmC의 분포를 확인하기 위해, 이 후성유전학적 변형과 분열 후 뉴런 마커인 NeuN의 공동 검출을 수행했습니다. 면역조직화학 분석 결과, 뚜렷한 5hmC 염색이 NeuN 양성 세포와 공존하는 반면, NeuN 음성 글리아 세포는 게놈 5hmC 수준이 더 낮은 것으로 나타났습니다.

분화 중인 신경 줄기세포 내 5caC의 분포를 결정하기 위해, 글리아 분화 유도 3일 후 고정된 신경 줄기세포 배양물에서 이 마커와 글리아 마커인 GFAP의 공동 염색을 수행하였습니다. 신경 줄기세포나 성숙한 성상교세포와는 달리, GFAP를 발현하는 대다수의 세포에서 강한 5caC 신호가 관찰되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 약 8시간 이내에 완료할 수 있습니다.

본 절차를 수행할 때는 모든 시약과 재료를 샘플과 함께 미리 준비해 두는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에 공초점 이미징(confocal imaging)을 수행하여 변형된 시토신(cytosine)의 핵 내 분포에 관한 추가적인 의문점을 해결할 수 있으며, 이는 이들의 잠재적인 생물학적 기능을 규명하는 데 기여할 수 있습니다.

2 N HCl를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 안전 캐비닛 사용 및 보호구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.