작은 동물 모델에서 요로 감염: 남성 및 여성 쥐의 Transurethral 도관 법

이 실험적 접근법의 전반적인 목표는 요로 감염에 대한 면역 반응을 조사하고 수컷과 암컷 동물 간의 직접적인 비교를 방지하는 것입니다. 이 방법은 남성과 여성이 요로 감염에 어떻게 반응하는지와 관련된 점막 면역학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 가장 큰 장점은 감염이 자연 뿌리를 통해 확립된다는 것입니다.

우리는 수컷 마우스의 방광 설치가 불가능하다고 얼마나 자주 언급되는지에 주목한 후 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 이 방법은 요로 감염에 대한 통찰력을 제공하지만 방광암과 같은 다른 질병 연구에도 적용할 수 있습니다. 시작하려면 감염될 각 마우스 그룹에 대해 하나의 소아 정맥 접근 캐뉼라를 준비합니다.

내장된 스프링 메커니즘을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 각 캐뉼라의 바늘을 제거합니다. 바늘은 버리고 플라스틱 정맥 주사 캐뉼라만 보존합니다. 층류 후드에서 카테터를 약 25-30분의 한 UV 사이클 동안 살균합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 요로 병원성 대장균 (UPEC)의 하룻밤 배양에 들어간 후, 1 분 동안 17, 000 회 g의 탁상용 마이크로 원심 분리기에서 박테리아 현탁액을 회전시키고 생성 된 박테리아 펠렛을 PBS에서 밀리리터 당 8 번째 CFU로 2 배 10으로 재현탁시킵니다. 현탁액의 분취액을 연속적으로 희석하고 적절한 경우 LB 한천에 항생제를 투여하여 각 감염에 대한 정확한 접종물을 결정합니다. 1ml 주사기에 세균 접종물을 뽑고 주사기 끝에 카테터를 부착합니다.

주사기를 두드려 공기를 제거하고 주입을 시작하기 전에 플런저를 눌러 카테터의 죽은 공기 공간을 채웁니다. 승인된 프로토콜에 따라 암컷 쥐를 마취한 후 동물을 누운 상태로 놓고 하복부에 중간 압력을 가하여 방광에서 소변을 비웁니다. 가득 찬 방광은 장골능 사이의 피부 아래에 있는 완두콩처럼 느껴집니다.

방광이 비어 있을 때 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 엄지손가락을 마우스의 꼬리에 놓고 같은 손의 손가락을 마우스의 복부에 놓고 반대 방향으로 부드러운 압력을 가하여 마우스를 제자리에 단단히 고정합니다. 다음으로, 카테터의 끝을 요도 구멍에서 마우스와 수직으로 놓은 다음 부드러운 압력으로 허브가 요도 구멍과 만날 때까지 카테터를 요도로 밀어 넣는 동시에 주사기를 내려 작업 표면과 평행이 되도록 합니다. 카테터가 제자리에 놓이면 마우스 복부에 올려 놓은 주로 사용하지 않는 손의 손가락을 사용하여 복부 피부를 마우스의 머리 쪽으로 매우 부드럽게 당깁니다.

요도 구멍은 움직이지 않습니다. 그러나 카테터가 질에 있으면 조직이 카테터에서 위로 이동하여 멀어집니다. 카테터의 허브를 요도 구멍에 대고 15마이크로리터의 박테리아 접종물을 천천히 분배합니다.

느린 설치 속도는 신장으로의 방광관 역류를 최소화합니다. 카테터가 누출되지 않도록 천천히 제거하십시오. 그런 다음 케이지에 있는 동물을 누운 자세로 눕힙니다.

수컷 마우스에게 접종하려면 두 개의 엄지 손가락 집게를 마우스의 외부 생식기에 두개골 및 꼬리 방향으로 놓습니다. 포피를 집어넣어 분비샘의 음경을 완전히 노출시킵니다. 그런 다음 음경이 바깥쪽에 위치하면 엄지 집게를 놓습니다.

튀어나온 음경을 동물과 수직으로 고정하기 위해 집게의 위치를 조정하고 장기를 부드럽지만 팽팽하게 잡습니다. 그런 다음 요도 고기 끝에 있는 작은 구멍을 통해 카테터를 조심스럽게 삽입하고 집게를 사용하여 부드럽게 음경으로 안내하여 부드럽게 긴장을 유지합니다. 카테터의 허브가 음경 끝과 만나면 음경의 위치를 유지하면서 50마이크로리터의 접종물을 매우 천천히 분배합니다.

여기에 표시된 것과 같이 미리 결정된 주입 품질 점수에 따라 주입의 품질을 기록하십시오. 접종물 누출을 방지하기 위해 5초에 걸쳐 카테터를 천천히 집어넣습니다. 마우스를 케이지에 넣고 누운 자세로 놓습니다.

동물은 마취제 투여 후 30-45분 후에 회복하기 시작해야 합니다. 승인된 프로토콜에 따라 생쥐를 희생한 후 70% Epinal을 사용하여 복부를 완전히 적셔 털에 의한 오염을 최소화합니다. 가위를 사용하여 마우스의 복부 아래쪽 1/3을 2cm 절개하고 방광과 기타 원하는 장기를 무균 적으로 제거합니다.

1ml의 멸균 PBS가 들어 있는 5ml 폴리프로필렌 스냅 캡 튜브로 장기를 옮기고 모든 샘플을 얼음 위에 보관합니다. 휴대용 균질화기를 사용하여 고형 조직이 거의 남지 않을 때까지 장기를 균질화합니다. 균질화가 잘 되지 않는 반짝이는 베이지색 흰색 지방 조직은 모두 버리십시오.

그런 다음 Epinal을 사용한 다음 PBS를 사용하여 각 실험 또는 장기 그룹 간의 균질화를 세척합니다. 균질화된 장기 현탁액의 연속 희석을 준비한 후, LB 한천 플레이트에 플레이트 희석하고 적절한 경우 항생제를 투여하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 방광 조직에 대한 유세포 분석을 수행하려면 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 방광을 분리한 후 가위를 사용하여 조직을 잘 다집니다.

소화 완충액이 들어 있는 튜브당 다진 방광 1개를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 흔들어 다진 조직을 소화 완충액에서 씻고 모든 방광이 절개되고 다질 때까지 얼음 위에 두십시오. 다진 방광을 섭씨 37도에서 60-75분 동안 배양하고 15분마다 5초 동안 손으로 세게 흔듭니다.

조직이 젖은 티슈 페이퍼와 유사한 유리처럼 투명하면 소화가 완료된 것입니다. 2-3 밀리리터의 얼음처럼 차가운 유세포 분석 완충액을 첨가하여 소화 효소를 비활성화하고 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

단일 세포 현탁액을 보장하고 결합 조직을 제거하려면 15ml 원추형 튜브에 배치된 100마이크로미터 필터를 통해 튜브의 내용물을 통과시킵니다. 그런 다음 주사기 플런저 끝으로 필터를 통해 남아 있는 조직을 부드럽게 누릅니다. 추가로 2ml의 유세포 분석 버퍼로 필터를 세척하고 샘플을 얼음 위에 보관합니다.

200 시간 g 및 4 섭씨 온도에서 원심 분리로 샘플을 7 분 동안 세척합니다. 펠릿을 밀리리터당 5마이크로그램으로 희석된 Fc 블록을 포함하는 100마이크로리터의 유세포 분석 완충액에 재현탁하고 96웰 원형 바닥 플레이트로 옮깁니다. 10-15분 후 원하는 항체 칵테일 100마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다.

그런 다음 빛을 차단한 얼음 위에서 30-45분 동안 샘플을 배양합니다. 200회 g과 섭씨 4도에서 7분 동안 원심분리로 샘플을 세척합니다. 마지막으로, 세포 펠릿을 200마이크로리터의 유세포 분석 버퍼에 재현탁시키고 유세포 분석기에서 획득하기 직전에 5밀리리터 폴리스티렌 튜브의 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 샘플을 통과시킵니다.

이 그림은 24시간 동안 감염된 쥐의 대표 데이터를 보여줍니다. 박테리아 부담은 감염 후 24시간 동안 수컷과 암컷 마우스 간에 동일했습니다. 감염 당시 접종 손실이 감염 형성에 영향을 미쳤는지 여부를 확인하기 위해 각 점안은 1에서 5까지의 척도로 점수를 매겼으며 1이 가장 최적이었습니다.

박테리아 집락화는 감염 후 24시간 후에 확인되었습니다. 비모수 Kruskal-Wallis 검정으로 평가한 점안 점수가 다른 동물에서 얻은 CFU 간에 통계적으로 유의미한 차이는 발견되지 않았으며, 각 열의 평균 순위를 다른 모든 열의 평균 순위와 비교하고 Dunn의 검정을 사용하여 다중 비교를 보정했습니다. 감염 중 세균 접종물의 상당한 누출을 초래하는 차선의 점안은 24시간 시점의 세균 집락화에 큰 영향을 미치지 않는다는 결론을 내릴 수 있습니다.

중요한 것은 차선의 점안의 빈도가 연습에 따라 감소한다는 것입니다. 마지막으로, 순진한 동물에 존재하는 CD45 양성 면역 세포의 수는 암컷 마우스와 수컷 마우스 간에 차이가 없었지만, 감염된 암컷 마우스의 방광으로의 침투는 통계적으로 유의하게 증가했습니다. 카테터 삽입을 시도하는 동안 느리고 부드러운 움직임을 사용하는 것이 중요합니다.

이 기술의 개발로 수컷과 암컷 동물의 방광에서 성별에 따른 면역의 차이를 탐구하는 데 도움이 되었습니다.