Name: 작은 동물 모델에서 요로 감염: 남성 및 여성 쥐의 Transurethral 도관 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 학습하세요 수컷 및 암컷 쥐의 요도 내 도관법을 이용한 요로 감염 연구 방법을. 이 기술은 성별에 따른 면역 반응 차이를 비교 분석하고 방광 병리학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는이 프로토콜 및 프로젝트의 개발 기간 동안 원고와 그들의 도움에 대 한 수지상 Immunobiology 실험실의 중요 한 독서에 대 한 박사 Matthieu 루소를 감사합니다. 이 작품에서 유럽 연합 7 차 프레임 워크 프로그램 마리 퀴리 작업 (PCIG11-가-2012-3221170, 그리고 면역-종양학 LabEx (마이) 자금에 의해 부분적으로 지원 되었다.

마우스 실험 위원회 회의 d 프로토콜 번호 2012-0024의 승인에 따라 실시 했다 ' éthique en expérimentation animale 파리 센터 동부 유럽 지침 2010/63의 응용 프로그램에서 수 드 (동물 실험의 윤리 위원회) 유럽 연합입니다.
1입니다. 카 테 터의 준비
<ol><li>한 소아 정 맥 접근 정 감염 되는 쥐의 각 그룹에 대 한 준비. 제조업체에서 지시 inbuilt 스프링 메커니즘을 사용 하는 바늘의 각 정 박탈. 바늘만 플라스틱 정 맥 정 맥 보존을 삭제 합니다.</li>
	<li>한 자외선 (U.V.) 주기, 일반적으로 25-30 분에 대 한 층 류 두건에 카 테 터를 소독. 그러나 참고: 카 실험 그룹, 남녀, 또는 세균성 긴장 사이 새로운 카 테 터를 사용 해야 하는 더 이상 마우스에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 준비 Uropathogenic 대장균 의 감염에 대 한
<ol><li>최소 2 일 전에 행진 UPEC Luria 국물 (파운드) 한 천 격판덮개에 냉동된 세균성 주식에서 무 균 접종 루프를 사용 하 여 감염 경우 적절 한 항생제를 포함. 37 ° C에서 밤새 품 어. 플레이트 4 ° C에서 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>100 ml 무 균 삼각 플라스 크, 접종 10 ml 파운드, 파운드 격판덮개에서 단일 식민지와 적절 한 항생제를 포함 하 고 37 ° C에서 하룻밤 (약 16-18 시간) 서 품 어. 참고: 서 문화 허용 형식의 식 감염23에 필요한 1 피리. 떨고 성장 문화 비효율적 pili 식 해야한다 그리고 그러므로, 감염의 일관성 없는 요금.</li>
	<li>광학 밀도 (OD)600 의 숙박 문화를 측정 하 고 미리 결정된 성장 곡선을 사용 하 여 ml 당 박테리아의 수를 계산. 예, UPEC 긴장 UTI89,600 명이 = 0.35은 2 x 108 CFU 당 ml, 따라서, OD600 와 야간 문화 = 2.4 13.7 x 10에 해당 될 것 이라고8 CFU / ml. 사이의 관계를 경험적으로 결정은 OD600 그리고 실행 가능한 박테리아 감염에 대 한 고용 하는 모든 새로운 긴장으로.</li>
	<li>
50 μ PBS에에서 감염 되는 동물의 수를 고려 하 여 박테리아의 양이 필요 하 고 각 마우스 약 107 콜로 니 형성 단위 (CFU) 받아야 결정 합니다. 카 테 터와 주사기 덩어리는 inoculum을 결정 하는 데 필요한 100 µ l의 ~ 130 µ l 죽은 볼륨을 계산에 포함 됩니다.
	<ol>
<li>회전 탁상 microcentrifuge 17000 x g 1 분에 있는 세균 현 탁 액 그리고 2 x 108 CFU PBS에 ml 당 결과 세균성 펠 릿 resuspend. 순차적으로 희석이 현 탁 액의 경우 각 감염에 대 한 정확한 inoculum을 확인 하려면 적절 한 항생제로 파운드 agar에 접시는 약 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 ml 주사기로 세균 inoculum을 그릴 하 고 주사기의 끝에 카 테 터를 연결 합니다. 어떤 공기를 제거 하는 문제를 시작 하기 전에 테에서 죽은 공기 공간을 채우기 위해 플런저를 우울 하 게 주사기를 누릅니다.</li>
</ol>3입니다. 마우스의 준비
<ol><li>100 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine의 복 주사를 통해 마우스 anesthetize 추가 열을 제공할 수 있습니다.</li>
	<li>각 마우스 중간 압력으로 노상 강도 당기고 하 여 진정 완벽 하 게 확인 하십시오. 마우스는 완전히 반응 및 3-5 분이이 상태에 도달 하기를 요구 하지 않는 때 진정 됩니다.</li>
	<li>마우스 부정사 놓고 소변의 방광을 비우기 위하여 더 낮은 복 부에 중간 압력을 적용 합니다. 전체 방광 ileac 볏 사이 피부 아래 완두콩 같은 느낌. 그러나 참고: 흡입된 isoflurane 여성 쥐15,22catheterize 하는 데 사용 되었습니다, 그리고, 그것은 테스트 되지 않았습니다 남성 쥐 충분히 흡입된 isoflurane이 절차에 의해 마 취 여부.</li>
</ol>4. 여성 쥐의 transurethral 점
<ol><li>비 지배적인 손을 사용 하 여, 꼬리와 마우스의 복 부에 동일한 손의 손가락에 엄지손가락을 배치 하 고 반대 방향으로 단단히 자리에 마우스를 부드러운 압력을 적용.</li>
	<li>
마우스에 수직인 요도 구멍에서 카 테 터의 끝을 놓습니다. 허브 작업 표면에 평행 하 게 되도록 동시에 주사기를 낮추고 있는 동안 요도 구멍을 충족 될 때까지, 부드러운 압력으로 요도에 카 테 터를 밉니다. 테 아무 윤 활을 필요합니다. 밀거나 요도에 카 테 터를 강제로 하지 않습니다. 테는 약간 저항을 가진 요도에 원활 하 고 쉽게 슬라이드 한다.
	<ol>
<li>한번 inoculum (4.3 단계)를 주입 하기 전에 테 장소, 아주 부드럽게 비 지배적인에서 손가락으로 마우스의 머리 쪽으로 복 부 피부를 손으로 당겨는 이미 마우스 (4.1 단계)의 복 부에은. 카 테 터, 요도에 있으면 요도 구멍을 구성 하는 조직 이동 하지 것입니다, 경우 테 잘못 하지 질에, 조직 및 카 테 터에서 이동 합니다 반면. 이 급속 한 시험 각 마우스에 수행 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>카 테 터 허브 요도 구멍 때 천천히 50 µ l 세균성 inoculum의 분배. 천천히 주입 속도 신장으로 vesicoureteral 퇴조를 최소화합니다. 천천히 5 수에 누설을 방지 하기 위해 카 테 터를 제거 합니다. 부정사의 위치에서 그들의 감 금 소에 마우스를 놓습니다.</li>
</ol>5. 남자 쥐의 transurethral 점
<ol><li>두 개의 엄지 집게 마우스의 외부 생식 기 다 cranially caudally 배치 합니다. 완전히 노출 귀 두 음 경 포 피를 철회. 성 기는 외부 위치, 일단 엄지 집게를 놓습니다.</li>
	<li>부드럽게 하지만 엄격 하 게 장기를 들고 동물에 수직인 돌출 성 안정 집게를 재조 정할. 시각화 요도 도관을 신중 하 게 장기의 끝에 작은 오프닝으로 카 테 터를 소개 합니다. 부드럽게는 집게와 부드러운 긴장을 유지 하는 마우스의 몸 쪽으로 음 경으로 카 테 터를 안내. 테 아무 윤 활을 필요합니다. 성 기;으로 카 테 터를 강요 하지 마십시오 테는 정확한 위치를 나타내는 요도에 원활 하 게 슬라이드 한다.</li>
	<li>카 테 터 허브 음 경 끝, 충족 되 면 성 기의 위치를 유지 하면서 inoculum의 50 µ l를 분배 매우 느리게. 그림 2에 표시 된 같은 미리 정해진된 문제 품질 평가 점수에 따라이 이번에는 주입의 품질 기재 됩니다.</li>
	<li>5는 inoculum의 누설을 방지 하기 위해 수를 통해 천천히, 테를 철회. 부정사의 위치에서 그들의 감 금 소에 마우스를 놓습니다. 동물 마 취의 관리에 따라 30-45 분을 복구 하기 시작 한다.</li>
</ol>6입니다. 감염된 장기에서 CFU의 결정
<ol><li>미리 정해진된 시간 포인트에서 희생 마우스 사용 하 여 표준 운영 절차 (예, 자 궁 경관 탈 구 또는 이산화탄소 과다) 승인. 모피 여 오염을 최소화 하기 위해 70% 에탄올으로 깨끗이 복 부 축</li>
	<li>2 cm 이상가 위를 사용 하 여 마우스의 복 부의 더 낮은 세 번째에서 절 개를 만들고 aseptically 5 ml으로 방광 및 다른 원하는 기관를 포함 하 여 그에 국한 되지 않는, 신장, 고환, 정액 소포, 또는 preputial 동맥을 제거 1 ml 균 PBS를 포함 하는 폴 리 프로필 렌 스냅 캡 튜브. 얼음에 모든 샘플을 유지.</li>
	<li>휴대용 균질 화기와 균질 장기 거의 없는 단단한 조직 유지, 기관에 따라 약 15-60 초 때까지. 지방 잘, 균질 하지 않습니다 그리고 빛나는 베이지색 흰색 조직으로 쉽게 인식할 수 있다. 삭제 하기 전에 fat 또는 다음 균질. PBS 사이 뒤 에탄올에는 균질 화기를 씻어 각 실험 또는 기관 그룹. 참고: 일반적으로, 휴대용 균질 또는 비드 밀 균질을 사용 합니다. 이러한 시스템의 모든 감염 된 후 24 시간에서 세균 CFU의 직접적인 비교에 의해 결정으로 비슷한 결과 굴복 했다 하는 동안 세균 생존 능력을 유지 하면서 호스트 조직 균질에 최적의 조건은 결정 해야 한다 실험적으로 전에 이 프로토콜을 정기적으로 수행합니다.</li>
	<li>무 균된 기관 정지의 직렬 희석을 수행 합니다. 플레이트 파운드 한 천 배지, 포함 하는 경우, 항생제에 희석 하 고 품 어 37 ° c.에 하룻밤 (~ 15 시간) UPEC 변종 매우 빠른 배로 시간 있고 따라서, 한다 주의 하지 개별 식민지를 계산 하는 능력을 방해 것이 있기 때문에 너무 오래 한 천 배지를 품 어.</li>
</ol>7. 방광 조직의 Cytometric 분석 흐름
<ol><li>34 단위/mL에서 콜라와 100 µ g/mL, PBS에서 DNase 들어 소화 버퍼를 준비 합니다. 얼음에 계속. 분석할 동물 당 1 개의 15 ml 원뿔 튜브와 튜브 당 aliquot 1 ml 소화 버퍼를 준비 합니다.</li>
	<li>미리 결정 된 timepoints에서 희생 마우스 사용 하 여 표준 운영 절차 (예: 자 궁 경관 탈 구 또는 이산화탄소 과다) 승인. 모피 여 오염을 최소화 하기 위해 70% 에탄올으로 깨끗이 복 부 축</li>
	<li>
2 cm 이상가 위를 사용 하 여 마우스의 복 부의 더 낮은 세 번째에서 절 개를 만들고 전체 방광을 제거. 2 크기의 조각, 일반적으로 약 8 조각 2-3 m m로 방광을 절단가 위 함께 잘 말하다.
	<ol>
<li>포함 하는 소화 버퍼 튜브 당 1 다진된 방광을 추가 합니다. 소화 버퍼에 다진된 방광 조직 씻어 흔들. 모든 방광 해 부하 고 다진 때까지 얼음에 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 손으로 활기찬 동요와 37 ° C에서 60-75 분 다진된 방광을 품 어 s 매 15 분. 조직에 젖은 휴지를 닮은 유리 투명 한 모습을 소화 완료 됩니다. 장기간된 소화 식별에 필요한 세포 표면 단백질을 제거 하 고 피해 야 한다.</li>
	<li>얼음 흐름 cytometry 버퍼 (PBS 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 0.2 m m EDTA 포함)의 2-3 mL를 추가 하 여 소화 효소를 비활성화 하 고 부드럽게 혼합. 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>단일 세포 현 탁 액을 보장 하 고 모든 결합 조직을 제거 하는 튜브의 내용을 15 mL 원뿔 튜브에 100 µ m 필터를 통과. 부드럽게 주사기 플런저의 끝으로 필터를 통해 어떤 나머지 조직을 누릅니다. 추가적인 2 mL 흐름 cytometry 버퍼와 필터를 세척. 얼음에 샘플을 계속.</li>
	<li>200 x g, 4 ° c.에 7 분 동안 원심 분리 하 여 샘플을 씻어 블록에 있는 100 µ L 흐름 cytometry 버퍼 포함 Fc, 5 µ g/mL, 96-잘 바닥판 라운드에 희석 펠 릿을 resuspend. 10-15 분 후에 각 샘플 100 µ L 원하는 항 체 칵테일을 추가 합니다. 30-45 분, 얼음, 빛 으로부터 보호에 대 한 샘플을 품 어. 참고: Fc 블록 Fc 수용 체를 표현 하는 세포에 항 체의 Fc 부분은 바인딩 방지 하기 위해 사용 하는 시 약 이다. 그것의 목적은 일반적인 항 체 바인딩을 최소화 하입니다. 사용 하는 항 체의 결정 실험에서 시험 되는 가설에 의존 되며 문학에서 입력을 선택 해야 합니다. 그림 3, 전반적인 면역 세포 침투를 측정 하는 안티 CD45 항 체 고용 되었다, 팬-면역 세포 단백질은.</li>
	<li>200 x g, 4 ° c.에 7 분 동안 원심 분리 하 여 샘플을 씻어 200 µ L 흐름 cytometry 버퍼에 셀 펠 릿 resuspend 고 교류 cytometer에서 취득 직전 5 ml 폴리스 티 렌 튜브에 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 샘플을 전달 합니다.</li>
	<li>교류 cytometer에서 전체 샘플을 수집 합니다. 좋은 소화 200000-400000 세포, 8000-10000 CD45 보장할+ 에서 순진한 마우스 bladders, 감염 된 장기 더 포함 하는 동안 면역 세포 세포16 (그림 3). 참고: 샘플 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비 CFU 평가를 사용할 수 없습니다. 증거가 보여 그 UPEC 식민 존재 또는 면역 세포 침투는 조직에 걸쳐 균일 한 방광을 두 부분으로 분할 하는 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>

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</ol>

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Transurethral 점 남성 쥐의 방광 점 막 질병에 섹스의 영향으로 많은 새로운 연구 기회를 제공 하지만 또한 몇 가지 과제를 선물 한다. 으뜸가, 한 가지 한계는는 점 처음 카 테 터 삽입 시 과도 한 염증의 결과로, 기술적으로 어려운 증명할 수 있습니다. 기술에서 개선 에반스 블루 염료 등 컬러 솔루션으로 죽은 쥐의 주입에 의해 얻을 수 있습니다. 하는 점 성공, 방광 시각적으로 검사 해야 하 고 얻은 액체의 볼륨 투베르쿨린 주사기로 추출 하 여 평가할 수 있다. 천천히, 부드러운 움직임의 중요성을 과장 수 없습니다: 저항 힘이 초과 염증과 조직 손상에서 발생, 카 테 터를 삽입 하는 데 사용 해야. 올바르게 수행 하는 경우 카 테 터는 요도에 여유롭게 슬라이드 합니다. 만약 저항이 나 방해는, 카 테 터를 제거 하 고 삽입을 다시 시도 하 최상 이다.
세균성 부담 24 시간 게시물 감염에 기지의 품질을 연관 하 여 우리는 적은 양의 세균 inoculum 끊기면 감염의...

요로 감염 (UTI) 선진국1에서 가장 일반적인 감염 중 하나입니다. 감염 속도가 여성 및 신생아 및 노인2중 남성 사이 유사 하다. 그러나 Premenopausal 성인 여성,, 남자2,3에 비해 지역사회 획득 요로 감염의 발생률이 크게 증가 했습니다. 이 질병은 주로 여성 영향, 그 기본 및 임상 연구는 압도적으로 여성에서 요로 감염에 집중. 그러나, 남자에 요는 중요 하 고 understudied 의료 도전4. 실제로, 남자에 요 더 높은 사망률과 관련 있기 때문에,이 감염은 복잡 한4,5정기적으로 정의 됩니다.
생리학과 병 리에 섹스 편견의 중심 역할에 대 한 우리의 이해 발전, 새로운 메서드는 질병의이 이전 무시 측면을 탐구 하는 데 필요한. 성 차이에서 역할을 필수적인 면역과 감염; 여성 남성은 결핵, 말라리아, 에이즈6,7등 특정 감염에 더 취약 하는 동안 자기 면역 질환의 발생률이 높은 있다. 방광 암, 다른 비뇨기과 병 리, 여성 보다 남성에서 훨씬 더 널리 이며 여러 연구 androgens에 대 한 역할 종은8,,910,11의 개발에 ,12. 그러나 특히,, intravesical 방광 암에 대 한 치료의 조사 여성 동물, 반복적으로 남성 쥐13catheterize 하는 무 능력 때문에 독점적으로 수행 됩니다.
요로 감염 병의 연구 감염 (예를 들어, 쥐 및 쥐)의 설치류 모델에 크게 의존합니다. 요로 감염의 murine 모델을 고용할 수 있습니다 uropathogens 원래에서 고립 된 uropathogenic 대장균 (UPEC) 같은 인간 감염 Klebsiella, Enterococcus, 황색또는 프로 테우 스14. 일반적으로 박테리아의 요도 도관 법을 통해 방광으로 소개 된다. 감염, 방광 및 신장 감염, 세균성 식민, 조직 손상, 또는 호스트 면역 응답15,16등의 특정 매개 변수를 평가 하기 위해 제거할 수 있습니다. 그러나 보편적으로,, 여성 동물만 요로 연구에 사용 됩니다. 실제로, 많은 연구, 해 부의 이유로 남성 생쥐의 catheterization 아니다 가능13,17,,1819지적 했다. 더 최근에, 남성 주입 하는 수술 접근 방식을 설명 하 고에서 복 열, 방광, 복 부에 있는 개통에 부드러운 압력을 적용 하 여 외부에서 난민은 고 박테리아는20방광 주입. 이 방법은 외 과적 수술 비용 남성 감염 수 있습니다. 따라서,이 방법의 주요 경고21절 개는 항 염증 성 상처 치유 응답을 유도 하기 위해 잠재력 등 감염의 결과에서 염증의 영향을 포함 한다. 우리의 취미 성 질병에 대 한 응답에서 바이어스를 이해, 우리가 더 오래 된 비 수술 transurethral 접근 여성 설치류22에에서 사용 일치 남성 생쥐에서 세균성 intravesical 주입 하는 방법 개발 .
우리의 모델 설립된 방법에 따라 작성 하 고 직접 암컷과 수 컷 동물에 감염에 호스트 면역 반응을 비교 하는 기능을 제공 합니다. 이 방법은 감염에 섹스 기반 차이의 해 부를 허용 하 고 잠재적으로 민감성의 발음된 차이에 분자 및 세포 단서와 남녀 간의 감염에 응답을 제공. 또한,이 모델은 요로 감염 연구, 방광 암, 전립선, 아래 또는 초과 active 방광 증후군, 간 질 성 방광염 등 방광 관련 된 다른 질병을 조사 하는 모델의 설립 허용을 넘어 가치.

<table><tbody><tr><td>BD Insyte Autoguard 차폐 IV 카테터 24G, 외경 0.7mm, 길이 14mM</td><td>BD 의료</td><td>381811 또는 381411*</td><td>* 카탈로그 번호는 국가에 따라</td></tr><tr><td>접종 루프</td>입니다. <td>Greiner Bio-One</td><td>731171</td><td></td></tr><tr><td>LB Miller 육수</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>LB Miller 한천</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>큐벳</td><td>Bio-rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>엄지 (Adson) 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 튜브, 폴리 프로필렌</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Ruptor 일회용 프로브</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 플립 캡 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td>는 <td>분취하여 -20°C에서 보관해야 합니다. C는 반복되는 동결-해동을 피하기 위해</td></tr><tr><td>100 &마이크로; M MACS 스마트 스트레이너&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-463</td>은 <td>15ml 튜브와 호환되며</td></tr><tr><td>100 &micro를 선호합니다. M 세포 스트레이너&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>50ml 튜브와 호환, MACS 스마트 스트레이너를 사용할 수 없는 경우</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Fc 블록</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td>anti-CD16/CD32</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD45 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>561487</td><td>다양한 형광 접합 옵션을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>필터 캡이 있는 5ml 튜브 폴리스티렌</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 호모게나이저</td><td>Qiagen</td><td>9001272</td><td>TissueRuptor</td></tr><tr><td>플로우 사이토미터</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Fortessa SORP&nbsp;</td></tr><tr><td>유세포 분석 소프트웨어</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Diva</td></tr></tbody></table>

작은 동물 모델에서 요로 감염: 남성 및 여성 쥐의 transurethral 도관 법

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

요로 감염 (UTI)는 매우 일반적인 전세계 중요 한 병 적 상태 및 의료 관련 비용을 들이지. 정확 하 게 반영 질병 및 진행, 작은 동물 모델, 호스트 병원 체 상호 작용의 해 부 및 감염에 면역의 생성을 허용 합니다. 마우스에서 uropathogenic 대장균, 커뮤니티의 85% 이상에서 원인이 되는 대리인의 intravesical 점 획득 요로 감염, 인간에서 관찰 된 감염의 단계의 많은. 그러나 최근 까지는,, 요로 수만 모델링 여성 동물에서. 이 제한 요로 감염, 암 등 다른 방광 병 리에 있는 성 관련 된 다름의 연구를 방해 했다. 여기, 우리는 여성 및 남성 동물 사이의 직접 비교를 허용 하는 남성 쥐를 주입 시키고 cytometry 방광 조직 감염 호스트 응답을 이해 하는 수단으로 평가 하는 상세한 프로토콜을 제공 하는 방법을 설명 합니다. 함께, 이러한 접근은 요로 감염 및 기타 방광 관련 질병에서 관찰 하는 섹스 편견을 호스트 요인의 식별에 도움이 됩니다.

이 프로토콜의 개발, 여성 및 남성 C57Bl/6 마우스의 동료 얻은, 그리고 세균 부담 1 시간에서 30 일에 이르기까지 시간 포인트에서 방광에 평가 했다 6 ~ 8 주 세. 이러한 연구 결과 다른 상세한 (Zychlinsky Scharff 외., 보류). 여기, 우리는 24 시간 감염에서 대표적인 데이터 제시. 특히, 세균성 부담 24 시간 게시물 감염 (그림 1)에서 남성과 여성 쥐 사이 해당 했다. 세균성 짐에 작은 변화는 각 그룹 24 시간 게시물 감염, 어떤 여성 쥐15,16보고 되었습니다 비슷한 내에서 관찰 되었다.
충분히 빈 방광 감염 전에 소변을 주의 하는 경우는 inoculum의 상당한 누설 거의...

쥐의 transurethral 도관 법의 설립된 모델 등 요로 감염, 방광 병 리의 연구를 허용 하지만 여성에서 수행할 수 있습니다. 여기, 남성 transurethral 주입의 새로운 모델에는 남녀 간의 강한 임상 및 역학 다름에 의해 표시 된 지역에 연구 수 있게 된다.

작은 동물 모델에서 요로 감염: 남성 및 여성 쥐의 Transurethral 도관 법

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

이 실험적 접근법의 전반적인 목표는 요로 감염에 대한 면역 반응을 조사하고 수컷과 암컷 동물 간의 직접적인 비교를 방지하는 것입니다. 이 방법은 남성과 여성이 요로 감염에 어떻게 반응하는지와 관련된 점막 면역학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 가장 큰 장점은 감염이 자연 뿌리를 통해 확립된다는 것입니다.우리는 수컷 마우스의 방광 설치가 불가능하다고 얼마나 자주 언급되는지에 주목한 후 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 이 방법은 요로 감염에 대한 통찰력을 제공하지만 방광암과 같은 다른 질병 연구에도 적용할 수 있습니다. 시작하려면 감염될 각 마우스 그룹에 대해 하나의 소아 정맥 접근 캐뉼라를 준비합니다.내장된 스프링 메커니즘을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 각 캐뉼라의 바늘을 제거합니다. 바늘은 버리고 플라스틱 정맥 주사 캐뉼라만 보존합니다. 층류 후드에서 카테터를 약 25-30분의 한 UV 사이클 동안 살균합니다.텍스트 프로토콜에 따라 요로 병원성 대장균 (UPEC)의 하룻밤 배양에 들어간 후, 1 분 동안 17, 000 회 g의 탁상용 마이크로 원심 분리기에서 박테리아 현탁액을 회전시키고 생성 된 박테리아 펠렛을 PBS에서 밀리리터 당 8 번째 CFU로 2 배 10으로 재현탁시킵니다. 현탁액의 분취액을 연속적으로 희석하고 적절한 경우 LB 한천에 항생제를 투여하여 각 감염에 대한 정확한 접종물을 결정합니다. 1ml 주사기에 세균 접종물을 뽑고 주사기 끝에 카테터를 부착합니다.주사기를 두드려 공기를 제거하고 주입을 시작하기 전에 플런저를 눌러 카테터의 죽은 공기 공간을 채웁니다. 승인된 프로토콜에 따라 암컷 쥐를 마취한 후 동물을 누운 상태로 놓고 하복부에 중간 압력을 가하여 방광에서 소변을 비웁니다. 가득 찬 방광은 장골능 사이의 피부 아래에 있는 완두콩처럼 느껴집니다.방광이 비어 있을 때 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 엄지손가락을 마우스의 꼬리에 놓고 같은 손의 손가락을 마우스의 복부에 놓고 반대 방향으로 부드러운 압력을 가하여 마우스를 제자리에 단단히 고정합니다. 다음으로, 카테터의 끝을 요도 구멍에서 마우스와 수직으로 놓은 다음 부드러운 압력으로 허브가 요도 구멍과 만날 때까지 카테터를 요도로 밀어 넣는 동시에 주사기를 내려 작업 표면과 평행이 되도록 합니다. 카테터가 제자리에 놓이면 마우스 복부에 올려 놓은 주로 사용하지 않는 손의 손가락을 사용하여 복부 피부를 마우스의 머리 쪽으로 매우 부드럽게 당깁니다.요도 구멍은 움직이지 않습니다. 그러나 카테터가 질에 있으면 조직이 카테터에서 위로 이동하여 멀어집니다. 카테터의 허브를 요도 구멍에 대고 15마이크로리터의 박테리아 접종물을 천천히 분배합니다.느린 설치 속도는 신장으로의 방광관 역류를 최소화합니다. 카테터가 누출되지 않도록 천천히 제거하십시오. 그런 다음 케이지에 있는 동물을 누운 자세로 눕힙니다.수컷 마우스에게 접종하려면 두 개의 엄지 손가락 집게를 마우스의 외부 생식기에 두개골 및 꼬리 방향으로 놓습니다. 포피를 집어넣어 분비샘의 음경을 완전히 노출시킵니다. 그런 다음 음경이 바깥쪽에 위치하면 엄지 집게를 놓습니다.튀어나온 음경을 동물과 수직으로 고정하기 위해 집게의 위치를 조정하고 장기를 부드럽지만 팽팽하게 잡습니다. 그런 다음 요도 고기 끝에 있는 작은 구멍을 통해 카테터를 조심스럽게 삽입하고 집게를 사용하여 부드럽게 음경으로 안내하여 부드럽게 긴장을 유지합니다. 카테터의 허브가 음경 끝과 만나면 음경의 위치를 유지하면서 50마이크로리터의 접종물을 매우 천천히 분배합니다.여기에 표시된 것과 같이 미리 결정된 주입 품질 점수에 따라 주입의 품질을 기록하십시오. 접종물 누출을 방지하기 위해 5초에 걸쳐 카테터를 천천히 집어넣습니다. 마우스를 케이지에 넣고 누운 자세로 놓습니다.동물은 마취제 투여 후 30-45분 후에 회복하기 시작해야 합니다. 승인된 프로토콜에 따라 생쥐를 희생한 후 70% Epinal을 사용하여 복부를 완전히 적셔 털에 의한 오염을 최소화합니다. 가위를 사용하여 마우스의 복부 아래쪽 1/3을 2cm 절개하고 방광과 기타 원하는 장기를 무균 적으로 제거합니다.1ml의 멸균 PBS가 들어 있는 5ml 폴리프로필렌 스냅 캡 튜브로 장기를 옮기고 모든 샘플을 얼음 위에 보관합니다. 휴대용 균질화기를 사용하여 고형 조직이 거의 남지 않을 때까지 장기를 균질화합니다. 균질화가 잘 되지 않는 반짝이는 베이지색 흰색 지방 조직은 모두 버리십시오.그런 다음 Epinal을 사용한 다음 PBS를 사용하여 각 실험 또는 장기 그룹 간의 균질화를 세척합니다. 균질화된 장기 현탁액의 연속 희석을 준비한 후, LB 한천 플레이트에 플레이트 희석하고 적절한 경우 항생제를 투여하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 방광 조직에 대한 유세포 분석을 수행하려면 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 방광을 분리한 후 가위를 사용하여 조직을 잘 다집니다.소화 완충액이 들어 있는 튜브당 다진 방광 1개를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 흔들어 다진 조직을 소화 완충액에서 씻고 모든 방광이 절개되고 다질 때까지 얼음 위에 두십시오. 다진 방광을 섭씨 37도에서 60-75분 동안 배양하고 15분마다 5초 동안 손으로 세게 흔듭니다.조직이 젖은 티슈 페이퍼와 유사한 유리처럼 투명하면 소화가 완료된 것입니다. 2-3 밀리리터의 얼음처럼 차가운 유세포 분석 완충액을 첨가하여 소화 효소를 비활성화하고 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다.단일 세포 현탁액을 보장하고 결합 조직을 제거하려면 15ml 원추형 튜브에 배치된 100마이크로미터 필터를 통해 튜브의 내용물을 통과시킵니다. 그런 다음 주사기 플런저 끝으로 필터를 통해 남아 있는 조직을 부드럽게 누릅니다. 추가로 2ml의 유세포 분석 버퍼로 필터를 세척하고 샘플을 얼음 위에 보관합니다.200 시간 g 및 4 섭씨 온도에서 원심 분리로 샘플을 7 분 동안 세척합니다. 펠릿을 밀리리터당 5마이크로그램으로 희석된 Fc 블록을 포함하는 100마이크로리터의 유세포 분석 완충액에 재현탁하고 96웰 원형 바닥 플레이트로 옮깁니다. 10-15분 후 원하는 항체 칵테일 100마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다.그런 다음 빛을 차단한 얼음 위에서 30-45분 동안 샘플을 배양합니다. 200회 g과 섭씨 4도에서 7분 동안 원심분리로 샘플을 세척합니다. 마지막으로, 세포 펠릿을 200마이크로리터의 유세포 분석 버퍼에 재현탁시키고 유세포 분석기에서 획득하기 직전에 5밀리리터 폴리스티렌 튜브의 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 샘플을 통과시킵니다.이 그림은 24시간 동안 감염된 쥐의 대표 데이터를 보여줍니다. 박테리아 부담은 감염 후 24시간 동안 수컷과 암컷 마우스 간에 동일했습니다. 감염 당시 접종 손실이 감염 형성에 영향을 미쳤는지 여부를 확인하기 위해 각 점안은 1에서 5까지의 척도로 점수를 매겼으며 1이 가장 최적이었습니다.박테리아 집락화는 감염 후 24시간 후에 확인되었습니다. 비모수 Kruskal-Wallis 검정으로 평가한 점안 점수가 다른 동물에서 얻은 CFU 간에 통계적으로 유의미한 차이는 발견되지 않았으며, 각 열의 평균 순위를 다른 모든 열의 평균 순위와 비교하고 Dunn의 검정을 사용하여 다중 비교를 보정했습니다. 감염 중 세균 접종물의 상당한 누출을 초래하는 차선의 점안은 24시간 시점의 세균 집락화에 큰 영향을 미치지 않는다는 결론을 내릴 수 있습니다.중요한 것은 차선의 점안의 빈도가 연습에 따라 감소한다는 것입니다. 마지막으로, 순진한 동물에 존재하는 CD45 양성 면역 세포의 수는 암컷 마우스와 수컷 마우스 간에 차이가 없었지만, 감염된 암컷 마우스의 방광으로의 침투는 통계적으로 유의하게 증가했습니다. 카테터 삽입을 시도하는 동안 느리고 부드러운 움직임을 사용하는 것이 중요합니다.이 기술의 개발로 수컷과 암컷 동물의 방광에서 성별에 따른 면역의 차이를 탐구하는 데 도움이 되었습니다.

urinary-tract-infection-small-animal-model-transurethral

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 transurethrally 마우스 요로 감염을 유발하고 결과 감염의 범위를 정할 방법을 보여 것입니다.

마우스 요로 감염의 Transurethral 유도

출처: Luyts, N. 외. 생체발광 영상을 이용한 요로 감염 및 그 치료에 대한 종단 추적 관찰. J. Vis. 경험 (2021).이 영상은 방광에 주입된 생물발광성 대장균 을 이용해 쥐 모델에서 요로 감염을 유도하고 추적하는 과정을 시연하며, 박테리아의 부착, 침입, 세포 내 복제가 이루어집니다. 생물발광 오페론에서 방출되는 빛은 감염 진행 중 박테리아 부하를 실시간으로 측정하는 지표 역할을 합니다.

생물발광을 이용한 쥐 모델에서 요로 감염의 시각화

출처: Conover, M. S. 외, J. 쥐 모델에서 요로감염 및 CAUTI의 확립 및 특성화. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 암컷 쥐에 경요도 카테터를 조립하고 이식한 후 박테리아 접종을 통해 카테터 관련 요로 감염을 확립하고 바이오필름 매개 숙주-병원체 상호작용을 조사하는 절차를 시연합니다.

마우스 모델에서의 카테터 관련 요로 감염

이 비디오에서는 생쥐에서 요로 감염 모델을 생성하기 위해 요로병원성 박테리아의 방광 내 투여 기술에 대해 설명합니다. 이 모델은 비뇨기계 내 요로병원성 세균 감염의 확산과 요로감염 감수성을 결정하는 메커니즘을 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

요로 감염 생성 모델: 요로 감염 모델을 개발하기 위해 마우스에 요로병원성 박테리아를 투여하는 기술

이 비디오는 경요도 카테터 점안을 통해 암컷 마우스 방광에서 요병원성 대장균 감염이 확립되는 것을 보여줍니다. 주입된 박테리아는 방광 내에서 요로 감염을 성공적으로 확립하여 요로와 관련된 의료 관련 질병을 연구하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다.

경요도 카테터 삽입 및 세균 접종을 통해 수컷 마우스에서 요로 감염 모델을 생성하다

암컷 마우스의 요로 감염 모델 구축

이 비디오는 마우스 방광암 모델에서 Helicobacter pylori 호중구 활성화 단백질(HP-NAP)의 항종양 활성을 평가하는 기술을 보여줍니다. HP-NAP는 종양세포 호중구와 상호 작용하여 전염증성 사이토카인을 생성함으로써 미접촉 T 세포를 1형 T helper(Th1) 및 1형 세포독성(Tc1) T 세포 표현형으로 분화시킵니다. Th1 및 Tc1 세포는 인터페론-감마를 분비하여 종양 혈관 신생을 억제하고 세포독성 T 세포 매개 종양 파괴를 촉진하여 종양 부피를 감소시킵니다.

Evaluating the anti-tumor efficacy of a bacterial immunomodulatory protein in a murine model(쥐 모델에서 박테리아 면역조절 단백질의 항종양 효능 평가)

요로 감염(UTI)을 모델링하는 능력은 박테리아 발병 기전을 이해하고 새로운 치료법의 개발을 촉발할 수 있도록 하는 데 매우 중요합니다. 이 작업의 목표는 인간에서 관찰된 결과를 요약하고 예측하는 실험적 요로감염 및 카테터 관련 요로감염의 마우스 모델을 시연하는 것입니다.

마우스 모델의 설립 및 요로 감염 및 CAUTI의 특성

Transurethral 점 도전 절차 이며 문학에서 잘 설명 되어 있다. 이 원고의 목적은 transurethral 방광 및/또는 성인 남성 생쥐에서 전립선으로 활성 물질과 액체의 intravesical 전달 카 테 터 삽입에 대 한 기술을 설명 하는 것입니다.

성인 남성 마우스 transurethral 주입 절차

재발성 UPEC UTI를 유도하기 위해 잠복성 세포내 방광 저장소와 G. 질리스에 대한 후속 방광 노출을 확립하는 비뇨병원성 대장균(UPEC) 경요도 접종의 마우스 모델이 입증된다. 또한 박테리아의 열거, 소변 세포학 및 주사 전자 현미경을위한 현장 방광 고정 및 처리가 입증되었습니다.

재발 성 에스케리치아 콜라 이 요로 감염 Gardnerella 질 방광 노출에 의해 유발 마우스에서

이 원고는 생물 발광 이미징을 사용하여 세균 부하의 생체 내 분석에서 마우스의 요로 감염을 유도하기 위해 호화 요법 을 가진 비뇨기과 박테리아의 내막 투여를 설명합니다.

요로 감염의 세로 후속 및 생물 발광 이미징을 사용하여 마우스에서의 치료

학습하세요 수컷 및 암컷 쥐의 요도 내 도관법을 이용한 요로 감염 연구 방법을. 이 기술은 성별에 따른 면역 반응 차이를 비교 분석하고 방광 병리학 연구에 활용할 수 있습니다.

작은 동물 모델에서 요로 감염: 남성 및 여성 쥐의 Transurethral 도관 법

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