Name: Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 학습하세요 단일세포 수준에서 세포 무결성과 단백질 항상성을 유지하며 고갈-구조 실험을 수행하는 방법을. 이 기술은 유사분열과 근형성성성 같은 세포 역학에서 단백질 기능과 구조적 요구사항을 분석하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research, 보조금 번호 7077), 벨리니 재단(Bellini Foundation) 및 로비 폰다지오네(Roby Fondazione)의 지원을 받았습니다.

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여기서는 화학량 론 및 단백질 복합체 및 거대 구조 역학에 영향을 미치는 단백질의 과발현에 특히 민감한 세포 생물학적 과정의 기능적 분석에 적용 가능하다 플리 구조 실험이 수행 될 수 있도록하는 방법을 설명했다. 유사 분열 세포 분열은 세포의 전체 구조에서 가장 극적이고 아름다운 변화를 포함 미세 조정 세포 morphodynamics의 극단적 인 예입니다. 세포 이미징을위한 굴지 및 tubulin의 마커의 낮은하지만 검출 양을 소개 시판 BacMam 시약과 결합 adenofection를 사용하여 적절한 유사 분열 세포 리모델링에 보호자 복잡한 BAG3-HSPB8의 기여 명확하게 입증 될 수있다. Fuchs의 외.의 최근 연구에서, 우리는 BAG3의 고갈이 불가능 관련된 스핀들 방향에 결함이 단단한 유사 분열의 굴지 피질을 설정하고 액틴이 풍부한 조립됩니다 보여 주었다후퇴 섬유 (14). 적절한 스핀들 역학은 BAG3 침묵에 따라 HSPB8 수준에서 볼 수 감소를 수정 야생형 BAG3-GFP의...

포유 동물 세포에서 유전자 발현의 불 활성화 작용은 단백질의 기능을 해부 금 표준이다. 새로 아연 손가락 클레아 제와 같은 특정 사이트 클레아 제의 사용을 기반으로 게놈 편집 기술을 개발하고 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR)은 / CAS9 이제 타겟 유전자 삭제 및 돌연변이 1, 2와 세포주의 생성을 할 수 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 우리가 단백질의 기능과 인간 질병의 유전에 대한 우리의 이해를 공부하는 방법을 혁신해야합니다. 일부 경우에서, 그러나, 장기 또는 완전한 유전자 녹아웃 바람직하지 않다 이차 전지 및 보상 메커니즘을 유발할 수있다. 유전자 조작 된 세포주의 생성은 또한 제한된 증식 능력 때나 다양한 세포 유형의 돌연변이의 큰 집합의 스크리닝 받고자 일차 세포 배양 물을 처리 할 때 제한 될 수있다. 이는 종종 셀 B의 의존성을 결정하기 위해 필요한단백질의 구조적 요구 사항에 대한 학적 처리. 이를 위해 다양한 세포 배경 일시적 플리 구조 실험 있도록 RNA 간섭에 의한 가역적 최저 여전히 구조 기능 관심 3의 단백질 분석을 수행하는 간단하고 강력한 접근 남아있다. 그러나, 이러한 접근법의 주요 단점은 어려움 효율적인 침묵을 달성하고, 세포 집단의 대부분에 가까운 생리적 수준의 관심 또는 그의 변이체의 단백질을 재 도입하는 것이다. 이 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 예를 들어 세포 인구 기반 분석에서 본 것과, 단일 세포 (hypomorphic 표현형)의 수준에서 볼 기능적 효과의 상관 관계를 시도 포괄적 인 연구를 활성화하기 위해 매우 중요합니다. 고전적인 형질 전환 방법을 사용하여, 하나는 거의 세포의 큰 집단에서 외인성 단백질의 균질 낮은 발현을 달성 할 수 없다. 재조합 바이러스와 세포의 형질 도입아데노 바이러스처럼 자주 외래 단백질의 더 정규화 된 표현을 가능하게한다. 그러나 아데노 흡수는 비 - 인간 세포에서 존재하지 않거나 약하게 일부 인간 세포 유형에서 발현되는 CAR 수용체에 의해 제한된다. 또한, 아데노 바이러스의 세포 엔트리는 셀 형상 및 밀착성 4-6 조절 신호 전달 경로 활성화한다. 세포 morphodynamics의 규제 메커니즘을 연구 할 때 분명히 바람직하지 않다. 우리는 세포 분열과 굴지 역학에, 보호자 단지, BAG3 - HSPB8의 기능 분석에 착수 할 때 우리는이 문제에 직면했다. 개척 작업은 스트레스 7,8 중에 단백질 품질 관리와 자식 작용이 보호자 단지의 역할을 설명했다. 이러한 연구의 대부분은, 그러나, 일반적으로 샤페론은 스트레스를받는 동안 상향 조절되는 것으로 가정하면, 단백질의 과발현에 의존했다. 이것은 HSPB8 복잡한에 여부 BAG3의 질문에 열려있다, 일을 표현 분열하는 세포의 정상적인 작동에 기여할 수많은 암 세포 유형 9 등 ESE 샤페론. 특히, 보호자 단지는 HSPB의 보호자 및 세포 골격 역학 (10) 사이의 새로운 연결 주어진 큰 관심이었다 유사 분열 진행을 제어 액틴 기반 구조의 리모델링에 기여하는지 여부. 이 문제를 해결하기 위해 유사 분열 진행 또는 휴대 형태 방해하지 것이고, 셀 형상 변경을 규제 고분자 복합체의 역학 이차 교란을 방지하기 위해 단백질 항상성을 유지할 것이다 플리 구조 실험을위한 효과적인 방법을 개발하고자 하였다 . 따라서 이상적으로, 관심있는 유전자의 고갈 - 추가 백을 동시에 수행해야합니다. 양이온 성 지질 또는 중합체와 아데노 바이러스의 착물의 사용은 시험 관내 및 생체 11,12 유전자 전달을 촉진하기 위해 기술되었다. 예를 들어, 인산 칼슘 (CAPI)을 갖는 석출물을 보인다CAR 독립적 인 통로 (13)를 통해 바이러스 바인딩 항목을 강화 아데노 바이러스. 실제로, 우리는 양이온 성 화합물과 아데노 바이러스 계 형질 세포 및 형질 전환을 조합하면 플리 구조 실험의 효율을 향상시킬 수 있다는 것을 발견했다. 이것은 대부분의 근처 내인성 수준에서 외인성 단백질의 발현을 조절하기 위해 더 넓은 윈도우의 세포주 및 목적 유전자와 이익에 따라, 우리는 20 배로 -3-하여 바이러스의 양을 낮출 수 세포 형태에 미치는 영향을 최소화하여 원하는 세포 인구의. 이러한 조건 하에서, 또한 내인성 단백질의 발현 (&gt; 75 %)의 고효율 녹다운을 얻을 수있다. 우리는 이에 생리적 소유주의 기능을 분석하는 방법이 적합 단계에 의해 방법 단계를 설명하고 열 충격 단백질 가족의 스트레스 유발 보호자의 변경 수준에 의해 평가로 단백질 항상성이 크게 교란되지 않고 있다는 증거를 제공시간 경과 비디오 현미경에 의한 분자 보호자의 제작. 이 프로토콜은 셀 동기화 절차와 유사 분열 진행 중 정상 액틴 기반 및 스핀들 역학과 최소한의 간섭 형광 마커의 낮은 수준의 공동 발현을위한 상업적으로 이용 가능한 배큘로 바이러스의 사용 의무입니다. 우리는 또한 체외에서 myotubes에 근원 세포의 분화에 유의 한 영향을 마우스 C2C12 세포를, &quot;형질 도입하기 어렵다&quot;에 적용 할 수있는 방법의 다양성을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>C2C12 마우스 Myoblasts</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>아데노바이러스 맞춤형 설계</td><td>Welgen</td><td>맞춤형 설계</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg; Actin-GFP, BacMam 2.0</td><td>써모 피셔</td><td>C10582</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg; Tubulin-RFP, BacMam 2.0</td><td>써모 피셔</td><td>C10614</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM), High Glucose</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish, 35 mm</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-20-C Case</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-RFP-H2B</td><td>Dr Sabine Elowe의 친절한 선물, 쿠에큐트; bec, 캐나다</td><td></td><td>Klebig C et al. 2009</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum, New Zealand</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>써모 피셔</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민&reg; RNAiMAX 트랜스펙션 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Alpha</td><td>Wisent</td><td>310-101-CL</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides</td><td>Thermo Fisher</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Biobasic</td><td>S0404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>rAVCMV-LifeAct-TagGFP2</td><td>IBIDI</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>siRNA 듀플렉스</td><td>Dharmacon</td><td>맞춤형 설계</td><td></td></tr><tr><td>티미딘</td><td>시그마</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>트립신 2.5%</td><td>써모 피셔</td><td>15090-046</td><td></td></tr></tbody></table>

adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

이러한 유사 분열 및 세포 분화 등 세포 과정은 크게 세포 골격 구조의 적절한 리모델링에 의존하는 세포 모양의 변화에​​ 의해 지배된다. 이는 주어진 시간과 장소에서 고차 고분자 구조의 조립 분해, 단백질의 과발현에 의한 교란에 특히 민감한 방법을 포함한다. 근처 대 정상 세포 형태를 단백질 항상성을 유지하고 유지할 수있는 방법은 세포 과정의 넓은 범위에서 목적 단백질의 기능적 기여도를 결정하는 것이 매우 바람직하다. RNA 간섭에 기초하여 과도 플리 구조 실험은 단백질의 기능 및 구조적 요구를 분석하기위한 강력한 방법이다. 그러나, 생리 학적 수준의 최소 편차를 갖는 목적 단백질의 재 도입이 어려운 과제이다. 여기에서 우리는 분자 보호자의 역할을 연구하기 위해 개발 된 방법이라고 adenofection을 설명D 분열하는 세포의 정상적인 동작 파트너 액틴 개조와의 관계. HeLa 세포는 siRNA 이중 가닥의 3&#39;UTR 영역 타겟팅 BAG3 고갈되었다. GFP-태그 BAG3 단백질은 형질 전환 시약에 결합하는 재조합 아데노 바이러스를 사용하여 세포의&gt; 75 %로 동시에 재 도입 하였다. Adenofection는 스트레스 반응의 부재, BAG3 고갈 HeLa 세포에 가까운 생리적 수준 BAG3-GFP 단백질을 발현 할 수 있었다. 이펙트 내인성 열 쇼크 단백질 샤페론 단백질 항상성의 주요 응력 - 유도 조절기의 레벨에서 관찰되지 않았다. 또한, 세포 형질 형질시 형광 마커의 발현을 구동 배큘로 바이러스를 첨가함으로써, 시간 경과에 의해 미세한 분열 세포 역학 해부 수 정상적인 분열 진행 최소 교란으로 분석한다. Adenofection은 근육 모세포은 diff의 기능 분석을위한 하드에 감염시킬 마우스 세포에도 적용하고, 적합myotubes에 erentiation. 따라서 adenofection 구조 - 기능은 고차 세포 골격 역학에 의존하는 중요한 생물학적 과정에 관여하는 단백질의 분석을 수행하기 위해 다양한 방법을 제공한다.

양이온 성 지질을 사용하여 BAG3-GFP 플라스미드 DNA의 형질이 HeLa 세포에서 이종 발현과 관련이 매우 높은 BAG3 수준을 (그림 2A)를 베어링 거의 검출 단백질의 수준 등을 보여주는 몇 가지 세포. 이러한 세포에서 단백질 항상성의 손실은 핵 주변 집계 (그림 2A, 화살표)에 BAG3-GFP의 축적에 의해 입증되었다. 반면, BAG3-GFP를 운반하는 아데노 바이러스와 세포 전달보다 균일 한 낮은 표현과 BAG3-GFP의 정확한 현지화 (그림 2B, 혼자 감염)을 나타냈다. 놀랍게도, 아데노 바이러스 전달 중 양이온 성 지질의 추가 (즉, 아데노 바이러스 입자의 형질)은 세포 (그림 2B, Adenofection)의 대부분에 균일 한 표현을 유지 허용하면서 상당히 유사한 MOI에서 셀 당 BAG3-GFP 발현을 증가했다...

우리는 세포의 무결성과 단백질 항상성을 보존하는 고갈 구조 실험 방법을 설명합니다. Adenofection은 단일 세포 수준에서 유사분열 세포 분열 및 근육 발생과 같이 미세하게 조정된 액틴 기반 역학에 의존하는 생물학적 프로세스 내에서 단백질의 기능 분석을 가능하게 합니다.

Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

본 방법의 전반적인 목표는 단일 세포 수준에서 생물학적 과정의 기능 분석을 위해, 세포의 무결성과 단백질 항상성이 유지되는 조건 하에서 결핍 회복 실험(depletion rescue experiments)을 수행할 수 있도록 하는 것입니다.이 방법은 유사분열 및 세포 분화와 같은 세포 역학에서 단백질 기능과 구조적 요구 사항에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 단백질을 고갈시키는 동시에, 대부분의 세포 집단에서 해당 단백질의 변이체를 생리적 수준에 가깝게 재도입할 수 있다는 점입니다.먼저 유리 바닥 배양 접시를 fibronectin으로 코팅합니다. 이를 위해 1 mg/mL 농도의 fibronectin 스톡 용액을 멸균된 PBS로 1:100 비율로 희석합니다.전체 표면을 덮을 수 있도록 각 35 mL 디쉬에 1 mL를 추가합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안, 10% FBS가 첨가된 alpha MEM과 0.05% trypsin EDTA 분주액을 37 °C로 예열합니다.45분 동안 배양한 후, 세포 용액 준비를 시작합니다. HeLa-RFP-H2B 세포가 담긴 10 centimeter 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 0.05% trypsin EDTA 1.5 milliliters로 부드럽게 두 번 헹굽니다.마지막 흡입 후 플레이트에 0.5 milliliters의 trypsin EDTA를 남겨두고, 37 °C 및 5% carbon dioxide 조건에서 세포를 2~3분 동안 배양합니다.플레이트를 가볍게 두드리고 현미경으로 세포층을 관찰하여 모든 세포가 떨어져 나갔는지 확인하십시오. 그런 다음 배지 10 milliliters를 첨가하고 파이펫으로 여러 번 가볍게 섞어 세포를 분리한 후, 세포 현탁액을 15 milliliter 튜브로 옮기십시오.헤모사이토미터를 사용하여 세포 현탁액 샘플 10 µL를 계수합니다. 다음으로, 유리 바닥 배양 접시에서 피브로넥틴 용액을 흡입하여 제거합니다. 세포를 도말하기 전에 피브로넥틴이 마르지 않도록 주의하십시오.35 mm 디시당 2 mL의 배지에 1.5 × 10⁵ 개의 세포를 분주할 수 있도록 세포 현탁액을 준비합니다. 바이러스 형질전환 전의 세포 수를 측정하기 위해 실험 조건 수 외에 35 mm 플레이트 하나를 추가로 분주합니다. 30분에서 45분 동안 배양합니다. 배양 시간이

adenofection-method-for-studying-role-molecular-chaperones-cellular

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.

세포 Refolding 분석

출처: Dahl, J. 외 시험관 및 생체 내에서 대장균 샤페론 HdeB의 pH 의존성 활성 검출. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 산성 및 열 스트레스 하에서 기질 단백질에 대한 샤페론 활성을 평가하기 위한 형광 분광광도계 기반 분석법을 시연합니다. 이 문서는 빛 산란을 통한 기질 전개 및 집적 모니터링 단계, 인솔이 있는 상태와 없는 상태 비교를 설명합니다.

모델 단백질의 열 전개를 통한 박테리아 샤페론 활성 평가

이 문서에서는 조사 반딧불 루시 페라 제 - GFP 융합 단백질의 사용을...

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

단백질 발현을 제어하는 것은 살아있는 모든 유기체에 필수적일 뿐만 아니라 세포 모델에서 단백질 기능을 조사하는 중요한 전략이기도 합니다. 제시된 프로토콜은 1차 해마 뉴런을 포함한 포유류 세포에 대한 항체 간섭의 적용을 보여주고 단백질 기능 연구에서 3차원 재구성의 사용을 보여줍니다.

공부 단백질 기능 및 항체의 간섭과 3 차원 재건에 의해 변경 단백질 발현의 역할

이 연구는 산성 pH 조건 하에서 대장균 HdeB의 보호자 활동을 특성화, 생물 물리학, 생화학 및 분자 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 성공적 HdeA 다른 산 보호 샤페론에 적용되었고, 다른 보호자 스트레스 조건 작동하도록 변경 될 수있다.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

유기 체는 그들의 일생 동안 발생 하는 가장 어려운 스트레스 조건 중 하나에 oxidants의 축적을 포함 한다. 산화 스트레스, 동안 셀 무 겁 게 의존 분자 보호자. 여기, 우리는 HDX MS를 사용 하 여 보호자 기능을 경 세 하는 구조적인 변화를 모니터링으로 redox 규제 안티 집단 활동, 또한 조사 하는 데 사용 하는 방법 제시.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

이 프로토콜은 히스톤 샤페론 올리고머화 및 안정성을 연구하기 위한 분석 크기 배제 크로마토그래피, 히스톤 샤페론-히스톤 상호작용을 밝히기 위한 풀다운 분석, 단백질 복합체의 화학량론을 분석하기 위한 AUC, 추정 히스톤 샤페론을 시험 관 내에서 기능적으로 특성화하기 위한 히스톤 샤페로닝 분석을 포함하는 일련의 방법을 설명합니다.

체외 분석, 풀다운 및 샤프롱 분석을 사용한 히스톤 샤페론의 특성 분석

고처리량 단일 분자 이미징 기술인 DNA 커튼은 다양한 단백질-DNA 상호 작용의 실시간 시각화를 위한 플랫폼을 제공합니다. 본 프로토콜은 DNA 커튼 기술을 활용하여 Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase인 Abo1의 생물학적 역할과 분자 메커니즘을 조사합니다.

DNA 커튼 기법에 의한 히스톤 조립의 분자 메커니즘 해독

학습하세요 단일세포 수준에서 세포 무결성과 단백질 항상성을 유지하며 고갈-구조 실험을 수행하는 방법을. 이 기술은 유사분열과 근형성성성 같은 세포 역학에서 단백질 기능과 구조적 요구사항을 분석하는 데 활용됩니다.

Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

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