Name: Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 학습하세요 단일세포 수준에서 세포 무결성과 단백질 항상성을 유지하며 고갈-구조 실험을 수행하는 방법을. 이 기술은 유사분열과 근형성성성 같은 세포 역학에서 단백질 기능과 구조적 요구사항을 분석하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research, 보조금 번호 7077), 벨리니 재단(Bellini Foundation) 및 로비 폰다지오네(Roby Fondazione)의 지원을 받았습니다.

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여기서는 화학량 론 및 단백질 복합체 및 거대 구조 역학에 영향을 미치는 단백질의 과발현에 특히 민감한 세포 생물학적 과정의 기능적 분석에 적용 가능하다 플리 구조 실험이 수행 될 수 있도록하는 방법을 설명했다. 유사 분열 세포 분열은 세포의 전체 구조에서 가장 극적이고 아름다운 변화를 포함 미세 조정 세포 morphodynamics의 극단적 인 예입니다. 세포 이미징을위한 굴지 및 tubulin의 마커의 낮은하지만 검출 양을 소개 시판 BacMam 시약과 결합 adenofection를 사용하여 적절한 유사 분열 세포 리모델링에 보호자 복잡한 BAG3-HSPB8의 기여 명확하게 입증 될 수있다. Fuchs의 외.의 최근 연구에서, 우리는 BAG3의 고갈이 불가능 관련된 스핀들 방향에 결함이 단단한 유사 분열의 굴지 피질을 설정하고 액틴이 풍부한 조립됩니다 보여 주었다후퇴 섬유 (14). 적절한 스핀들 역학은 BAG3 침묵에 따라 HSPB8 수준에서 볼 수 감소를 수정 야생형 BAG3-GFP의...

포유 동물 세포에서 유전자 발현의 불 활성화 작용은 단백질의 기능을 해부 금 표준이다. 새로 아연 손가락 클레아 제와 같은 특정 사이트 클레아 제의 사용을 기반으로 게놈 편집 기술을 개발하고 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR)은 / CAS9 이제 타겟 유전자 삭제 및 돌연변이 1, 2와 세포주의 생성을 할 수 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 우리가 단백질의 기능과 인간 질병의 유전에 대한 우리의 이해를 공부하는 방법을 혁신해야합니다. 일부 경우에서, 그러나, 장기 또는 완전한 유전자 녹아웃 바람직하지 않다 이차 전지 및 보상 메커니즘을 유발할 수있다. 유전자 조작 된 세포주의 생성은 또한 제한된 증식 능력 때나 다양한 세포 유형의 돌연변이의 큰 집합의 스크리닝 받고자 일차 세포 배양 물을 처리 할 때 제한 될 수있다. 이는 종종 셀 B의 의존성을 결정하기 위해 필요한단백질의 구조적 요구 사항에 대한 학적 처리. 이를 위해 다양한 세포 배경 일시적 플리 구조 실험 있도록 RNA 간섭에 의한 가역적 최저 여전히 구조 기능 관심 3의 단백질 분석을 수행하는 간단하고 강력한 접근 남아있다. 그러나, 이러한 접근법의 주요 단점은 어려움 효율적인 침묵을 달성하고, 세포 집단의 대부분에 가까운 생리적 수준의 관심 또는 그의 변이체의 단백질을 재 도입하는 것이다. 이 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 예를 들어 세포 인구 기반 분석에서 본 것과, 단일 세포 (hypomorphic 표현형)의 수준에서 볼 기능적 효과의 상관 관계를 시도 포괄적 인 연구를 활성화하기 위해 매우 중요합니다. 고전적인 형질 전환 방법을 사용하여, 하나는 거의 세포의 큰 집단에서 외인성 단백질의 균질 낮은 발현을 달성 할 수 없다. 재조합 바이러스와 세포의 형질 도입아데노 바이러스처럼 자주 외래 단백질의 더 정규화 된 표현을 가능하게한다. 그러나 아데노 흡수는 비 - 인간 세포에서 존재하지 않거나 약하게 일부 인간 세포 유형에서 발현되는 CAR 수용체에 의해 제한된다. 또한, 아데노 바이러스의 세포 엔트리는 셀 형상 및 밀착성 4-6 조절 신호 전달 경로 활성화한다. 세포 morphodynamics의 규제 메커니즘을 연구 할 때 분명히 바람직하지 않다. 우리는 세포 분열과 굴지 역학에, 보호자 단지, BAG3 - HSPB8의 기능 분석에 착수 할 때 우리는이 문제에 직면했다. 개척 작업은 스트레스 7,8 중에 단백질 품질 관리와 자식 작용이 보호자 단지의 역할을 설명했다. 이러한 연구의 대부분은, 그러나, 일반적으로 샤페론은 스트레스를받는 동안 상향 조절되는 것으로 가정하면, 단백질의 과발현에 의존했다. 이것은 HSPB8 복잡한에 여부 BAG3의 질문에 열려있다, 일을 표현 분열하는 세포의 정상적인 작동에 기여할 수많은 암 세포 유형 9 등 ESE 샤페론. 특히, 보호자 단지는 HSPB의 보호자 및 세포 골격 역학 (10) 사이의 새로운 연결 주어진 큰 관심이었다 유사 분열 진행을 제어 액틴 기반 구조의 리모델링에 기여하는지 여부. 이 문제를 해결하기 위해 유사 분열 진행 또는 휴대 형태 방해하지 것이고, 셀 형상 변경을 규제 고분자 복합체의 역학 이차 교란을 방지하기 위해 단백질 항상성을 유지할 것이다 플리 구조 실험을위한 효과적인 방법을 개발하고자 하였다 . 따라서 이상적으로, 관심있는 유전자의 고갈 - 추가 백을 동시에 수행해야합니다. 양이온 성 지질 또는 중합체와 아데노 바이러스의 착물의 사용은 시험 관내 및 생체 11,12 유전자 전달을 촉진하기 위해 기술되었다. 예를 들어, 인산 칼슘 (CAPI)을 갖는 석출물을 보인다CAR 독립적 인 통로 (13)를 통해 바이러스 바인딩 항목을 강화 아데노 바이러스. 실제로, 우리는 양이온 성 화합물과 아데노 바이러스 계 형질 세포 및 형질 전환을 조합하면 플리 구조 실험의 효율을 향상시킬 수 있다는 것을 발견했다. 이것은 대부분의 근처 내인성 수준에서 외인성 단백질의 발현을 조절하기 위해 더 넓은 윈도우의 세포주 및 목적 유전자와 이익에 따라, 우리는 20 배로 -3-하여 바이러스의 양을 낮출 수 세포 형태에 미치는 영향을 최소화하여 원하는 세포 인구의. 이러한 조건 하에서, 또한 내인성 단백질의 발현 (&gt; 75 %)의 고효율 녹다운을 얻을 수있다. 우리는 이에 생리적 소유주의 기능을 분석하는 방법이 적합 단계에 의해 방법 단계를 설명하고 열 충격 단백질 가족의 스트레스 유발 보호자의 변경 수준에 의해 평가로 단백질 항상성이 크게 교란되지 않고 있다는 증거를 제공시간 경과 비디오 현미경에 의한 분자 보호자의 제작. 이 프로토콜은 셀 동기화 절차와 유사 분열 진행 중 정상 액틴 기반 및 스핀들 역학과 최소한의 간섭 형광 마커의 낮은 수준의 공동 발현을위한 상업적으로 이용 가능한 배큘로 바이러스의 사용 의무입니다. 우리는 또한 체외에서 myotubes에 근원 세포의 분화에 유의 한 영향을 마우스 C2C12 세포를, &quot;형질 도입하기 어렵다&quot;에 적용 할 수있는 방법의 다양성을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>C2C12 마우스 Myoblasts</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>아데노바이러스 맞춤형 설계</td><td>Welgen</td><td>맞춤형 설계</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg; Actin-GFP, BacMam 2.0</td><td>써모 피셔</td><td>C10582</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg; Tubulin-RFP, BacMam 2.0</td><td>써모 피셔</td><td>C10614</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM), High Glucose</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish, 35 mm</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-20-C Case</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-RFP-H2B</td><td>Dr Sabine Elowe의 친절한 선물, 쿠에큐트; bec, 캐나다</td><td></td><td>Klebig C et al. 2009</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum, New Zealand</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>써모 피셔</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민&reg; RNAiMAX 트랜스펙션 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Alpha</td><td>Wisent</td><td>310-101-CL</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides</td><td>Thermo Fisher</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Biobasic</td><td>S0404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>rAVCMV-LifeAct-TagGFP2</td><td>IBIDI</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>siRNA 듀플렉스</td><td>Dharmacon</td><td>맞춤형 설계</td><td></td></tr><tr><td>티미딘</td><td>시그마</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>트립신 2.5%</td><td>써모 피셔</td><td>15090-046</td><td></td></tr></tbody></table>

adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

이러한 유사 분열 및 세포 분화 등 세포 과정은 크게 세포 골격 구조의 적절한 리모델링에 의존하는 세포 모양의 변화에​​ 의해 지배된다. 이는 주어진 시간과 장소에서 고차 고분자 구조의 조립 분해, 단백질의 과발현에 의한 교란에 특히 민감한 방법을 포함한다. 근처 대 정상 세포 형태를 단백질 항상성을 유지하고 유지할 수있는 방법은 세포 과정의 넓은 범위에서 목적 단백질의 기능적 기여도를 결정하는 것이 매우 바람직하다. RNA 간섭에 기초하여 과도 플리 구조 실험은 단백질의 기능 및 구조적 요구를 분석하기위한 강력한 방법이다. 그러나, 생리 학적 수준의 최소 편차를 갖는 목적 단백질의 재 도입이 어려운 과제이다. 여기에서 우리는 분자 보호자의 역할을 연구하기 위해 개발 된 방법이라고 adenofection을 설명D 분열하는 세포의 정상적인 동작 파트너 액틴 개조와의 관계. HeLa 세포는 siRNA 이중 가닥의 3&#39;UTR 영역 타겟팅 BAG3 고갈되었다. GFP-태그 BAG3 단백질은 형질 전환 시약에 결합하는 재조합 아데노 바이러스를 사용하여 세포의&gt; 75 %로 동시에 재 도입 하였다. Adenofection는 스트레스 반응의 부재, BAG3 고갈 HeLa 세포에 가까운 생리적 수준 BAG3-GFP 단백질을 발현 할 수 있었다. 이펙트 내인성 열 쇼크 단백질 샤페론 단백질 항상성의 주요 응력 - 유도 조절기의 레벨에서 관찰되지 않았다. 또한, 세포 형질 형질시 형광 마커의 발현을 구동 배큘로 바이러스를 첨가함으로써, 시간 경과에 의해 미세한 분열 세포 역학 해부 수 정상적인 분열 진행 최소 교란으로 분석한다. Adenofection은 근육 모세포은 diff의 기능 분석을위한 하드에 감염시킬 마우스 세포에도 적용하고, 적합myotubes에 erentiation. 따라서 adenofection 구조 - 기능은 고차 세포 골격 역학에 의존하는 중요한 생물학적 과정에 관여하는 단백질의 분석을 수행하기 위해 다양한 방법을 제공한다.

양이온 성 지질을 사용하여 BAG3-GFP 플라스미드 DNA의 형질이 HeLa 세포에서 이종 발현과 관련이 매우 높은 BAG3 수준을 (그림 2A)를 베어링 거의 검출 단백질의 수준 등을 보여주는 몇 가지 세포. 이러한 세포에서 단백질 항상성의 손실은 핵 주변 집계 (그림 2A, 화살표)에 BAG3-GFP의 축적에 의해 입증되었다. 반면, BAG3-GFP를 운반하는 아데노 바이러스와 세포 전달보다 균일 한 낮은 표현과 BAG3-GFP의 정확한 현지화 (그림 2B, 혼자 감염)을 나타냈다. 놀랍게도, 아데노 바이러스 전달 중 양이온 성 지질의 추가 (즉, 아데노 바이러스 입자의 형질)은 세포 (그림 2B, Adenofection)의 대부분에 균일 한 표현을 유지 허용하면서 상당히 유사한 MOI에서 셀 당 BAG3-GFP 발현을 증가했다...

우리는 세포의 무결성과 단백질 항상성을 보존하는 고갈 구조 실험 방법을 설명합니다. Adenofection은 단일 세포 수준에서 유사분열 세포 분열 및 근육 발생과 같이 미세하게 조정된 액틴 기반 역학에 의존하는 생물학적 프로세스 내에서 단백질의 기능 분석을 가능하게 합니다.

Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

본 방법의 전반적인 목표는 단일 세포 수준에서 생물학적 과정의 기능 분석을 위해, 세포의 무결성과 단백질 항상성이 유지되는 조건 하에서 결핍 회복 실험(depletion rescue experiments)을 수행할 수 있도록 하는 것입니다.이 방법은 유사분열 및 세포 분화와 같은 세포 역학에서 단백질 기능과 구조적 요구 사항에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 단백질을 고갈시키는 동시에, 대부분의 세포 집단에서 해당 단백질의 변이체를 생리적 수준에 가깝게 재도입할 수 있다는 점입니다.먼저 유리 바닥 배양 접시를 fibronectin으로 코팅합니다. 이를 위해 1 mg/mL 농도의 fibronectin 스톡 용액을 멸균된 PBS로 1:100 비율로 희석합니다.전체 표면을 덮을 수 있도록 각 35 mL 디쉬에 1 mL를 추가합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안, 10% FBS가 첨가된 alpha MEM과 0.05% trypsin EDTA 분주액을 37 °C로 예열합니다.45분 동안 배양한 후, 세포 용액 준비를 시작합니다. HeLa-RFP-H2B 세포가 담긴 10 centimeter 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 0.05% trypsin EDTA 1.5 milliliters로 부드럽게 두 번 헹굽니다.마지막 흡입 후 플레이트에 0.5 milliliters의 trypsin EDTA를 남겨두고, 37 °C 및 5% carbon dioxide 조건에서 세포를 2~3분 동안 배양합니다.플레이트를 가볍게 두드리고 현미경으로 세포층을 관찰하여 모든 세포가 떨어져 나갔는지 확인하십시오. 그런 다음 배지 10 milliliters를 첨가하고 파이펫으로 여러 번 가볍게 섞어 세포를 분리한 후, 세포 현탁액을 15 milliliter 튜브로 옮기십시오.헤모사이토미터를 사용하여 세포 현탁액 샘플 10 µL를 계수합니다. 다음으로, 유리 바닥 배양 접시에서 피브로넥틴 용액을 흡입하여 제거합니다. 세포를 도말하기 전에 피브로넥틴이 마르지 않도록 주의하십시오.35 mm 디시당 2 mL의 배지에 1.5 × 10⁵ 개의 세포를 분주할 수 있도록 세포 현탁액을 준비합니다. 바이러스 형질전환 전의 세포 수를 측정하기 위해 실험 조건 수 외에 35 mm 플레이트 하나를 추가로 분주합니다. 30분에서 45분 동안 배양합니다. 배양 시간이 지난 후, 여기에서 보는 것과 같이 세포가 잘 분리되었는지 현미경으로 확인합니다. 플레이트를 배양기로 다시 옮겨 다음 날까지 세포를 배양합니다.분주 다음 날, 세포 밀도가 최소 50%에 도달했는지 확인하십시오. 세포 밀도가 50%보다 낮으면 바이러스 형질도입 효율이 감소하고, 세포당 단백질 발현의 변동성이 증가하며, 세포 독성이 증가합니다. 그 다음, 이전과 동일하게 추가로 분주한 디쉬에서 세포를 수확하고 세포 수를 측정하십시오. 세포의 효율적인 형질도입에 필요한 바이러스 부피를 계산하십시오. 각 조건별로 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에 라벨을 붙이고, 따뜻한 alpha MEM minus 400 microliters를 추가하십시오. 얼음 위에서 바이러스 분주액을 천천히 해동한 후, 필요한 부피의 각 바이러스를 튜브에 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하십시오. 이어서, 세포에서 배지를 흡입하여 제거한 후, 바이러스 혼합액을 방울방울 조심스럽게 추가하십시오. 세포를 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide 조건에서 배양하십시오. 한 시간 동안 15분마다 멸균 후드 내에서 플레이트를 조심스럽게 흔들어 바이러스가 세포 전체에 덮이도록 하십시오. 적은 양의 배지를 사용하면 바이러스와 세포의 접촉이 용이해집니다.배양 후, 각 플레이트에 alpha MEM minus 1.6 milliliters를 조심스럽게 피펫팅하여 총 부피를 2 milliliters로 맞춥니다. 그런 다음, 2 millimolar thymidine을 첨가하여 세포 동기화를 시작하고 세포를 2시간 동안 추가로 배양합니다.그동안 마이크로튜브에 멸균수 139 µL, 1 M 염화칼슘 50 µL, 20 µM siRNA 11 µL를 넣어 siRNA transfection 혼합물을 준비합니다. siRNA가 필요하지 않은 경우에는 siRNA 양만큼 멸균수로 대체하여 empty transfection을 수행합니다. HBSS-2X 용액을 염화칼슘 siRNA 혼합물에 천천히 한 방울씩 첨가합니다. 침전물의 크기가 작을수록 transfection 효율이 높아지므로, 200 µL 피펫을 사용하여 공기 주입 방식으로 두 번 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 상온에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 각 플레이트에 200 µL씩 천천히 한 방울씩 첨가하고 흔들어 섞어줍니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 16시간 동안 배양합니다.다음 날, 배양 접시를 인큐베이터에서 꺼내 조직 배양 후드로 옮깁니다. 따뜻한 HEPES 2 mL로 세포를 두 번 헹군 후, alpha MEM minus 2 mL를 첨가하고 다시 인큐베이터로 넣습니다.7시간 후, 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣기 전에 2 mM thymidine을 첨가합니다. 온도 변화가 세포 주기의 길이에 영향을 미치므로 한 번에 4개의 세포 플레이트 이하로 작업하십시오. 다음 날, siRNA transfection 및 바이러스 감염 48시간 후에, 따뜻한 PBS 2 mL로 세포를 두 번 헹군 다음, 살아있는 세포 이미징을 위해 phenol red가 없는 alpha MEM 2 mL를 첨가합니다. 7시간 동안 배양합니다.가습 장치와 5% carbon dioxide 온도 조절 챔버가 장착된 도립 현미경을 사용하여 분열기 세포에 대한 단기 라이브 셀 이미징 실험을 수행합니다. 이미지 획득 전, 챔버가 37 degrees Celsius의 적절한 온도에 도달했는지 확인하십시오.배지와 온도의 적절한 평형을 이루고 온도 변화로 인한 초점 밀림을 방지하기 위해, 이미지 획득 1시간 전에 배양 접시를 현미경 챔버에 넣습니다. 세포의 유사분열 상태를 확인합니다. 이 시점에서 세포의 10~15%가 유사분열 초기 단계에 있어야 합니다.평형화 시간 동안 이전 실험에서 결정된 획득 파라미터를 설정하십시오. 광퇴색(photo-bleaching) 없이 적절한 해상도를 달성하는 것이 중요한데, 이는 광퇴색이 세포 손상을 일으키고 유사분열 진행을 방해하기 때문입니다. 획득 간격을 초과하지 않으면서 분석에 필요한 충분한 수의 세포를 확보하기 위해, 조건당 유사분열 진입 단계에 있는 세포들이 포함된 여러 시야(field)를 선택하십시오. 모든 시야 선택이 완료되면, 초점을 다시 맞추고 가능한 한 빠르게 획득을 시작하십시오.스피닝 디스크 공초점 시스템을 사용하는 일반적인 설정은 4가지의 서로 다른 조건, 플레이트당 7개의 시야, 그리고 75분 동안 1.5분에서 2분 간격의 2가지 색상 채널을 포함합니다. 사용하는 형광 마커에 따라 세포의 유사분열 표현형을 분석하기 위한 명확한 기준을 결정하십시오.왼쪽에 나타난 BAG3-GFP의 플라스미드 DNA transfection과 대조적으로, 오른쪽에 표시된 재조합 아데노바이러스를 이용한 adenofection은 낮은 감염 다중도(multiplicity of infection)에서도 대부분의 세포 집단에서 더욱 균질하고 효율적인 BAG3-GFP 발현을 가능하게 합니다. 이 대표적인 western blot은 BAG3 특이적 siRNA와 재조합 아데노바이러스 BAG3-GFP를 이용한 adenofection을 통해 내인성 BAG3를 효율적으로 제거하고, BAG3-GFP 단백질을 내인성 수준에 가깝게 재도입할 수 있음을 보여줍니다. 여기에서 보듯, proteotoxic stress 유도제인 MG132로 처리한 HeLa 세포와 달리, adenofection이 수행된 HeLa 세포에서는 스트레스 유도 열충격 단백질(heat shock proteins) 수준의 검출 가능한 증가가 없으므로 adenofection이 단백질 항상성을 유지할 수 있음을 알 수 있습니다. 대조군 siRNA와 BacMam-GFP alpha Tubulin, 그리고 BacMam-RFP Actin으로 adenofection된 HeLa 세포의 confocal time lapse 이미지에서 확인되듯이, 세포의 유사분열 진행은 adenofection에 의해 유의미하게 방해받지 않습니다.그래프는 비정상적인 유사분열을 보이는 세포의 비율을 나타냅니다. BAG3 특이적 siRNA만을 형질전환한 세포는 빨간색 막대로 표시된 바와 같이 유사분열 결함 수준이 약 2배 증가했으며, 검은색 막대로 표시된 BAG3-GFP의 재도입을 통해 대조군 세포 수준에 가깝게 회복되었습니다.이 영상을 시청하고 나면, adenofection을 이용한 결핍 구조 실험(depletion rescue experiments)을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 다양한 세포 배경에서 구조-기능 분석을 위한 하이포모픽 넉다운(hypomorphic knock-downs)을 생성할 수 있는 빠르고 간단한 시스템을 제공합니다. 이 방법을 통해 특정 기능에 필요한 표적 단백질의 핵심 구조적 요구 사항을 확인할 수 있습니다. 이후 게놈 편집의 다른 접근 방식들을 사용하여 관련된 메커니즘을 더욱 심층적으로 연구할 수 있습니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

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