Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

이 방법의 전반적인 목표는 세포 무결성과 단백질 항상성을 보존하는 조건에서 고갈 구조 실험을 수행할 수 있도록 하는 것입니다. 단일 세포 수준에서 생물학적 과정의 기능 분석용. 이 방법은 유사분열 및 세포 분화와 같은 세포 역학에서 단백질 기능 및 구조 요구 사항에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 관심 단백질을 고갈시키고 동시에 세포 집단의 측정에서 신 생리학적 수준에서 이 단백질의 변이체를 재도입하는 것입니다. 유리 바닥 접시에 프리브로넥틴을 코팅하는 것으로 시작합니다. 이렇게하려면 밀리리터 피르 브로 넥틴 스톡당 1 밀리그램을 멸균 PBS로 1에서 100으로 희석하십시오.

각 35 밀리리터 접시에 1 밀리리터를 첨가하여 전체 표면을 덮습니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 기간 동안 예열 알파 MEM은 10% FBS와 0.05% 트립신 EDTA의 분취액을 섭씨 37도까지 보충했습니다.

45분 배양 후 세포 용액 준비를 시작합니다. HeLa RFP H2B 세포의 10cm 플레이트에서 배지를 흡인합니다. 그리고 1.5ml의 0.05%트립신 EDTA로 두 번 부드럽게 헹굽니다.

마지막 흡인 후 플레이트에 0.5ml의 트립신 EDTA를 남겨둡니다. 그리고 섭씨 37도에서 2-3분 동안 세포를 배양합니다. 그리고 5%의 이산화탄소.

접시를 부드럽게 두드립니다. 그리고 현미경으로 세포층을 관찰하여 모든 세포가 분리되었는지 확인합니다. 그런 다음 10ml의 배지를 추가하고 여러 번 부드럽게 피펫하여 세포를 분리하고 15ml 튜브에 세포 현탁액을 전달합니다.

혈구계를 사용하여 세포 현탁액의 10마이크로리터 샘플을 계산합니다. 다음으로, 유리 바닥 접시에서 피브로넥틴 용액을 흡인합니다. 세포 도금 전에 피브로넥틴이 건조되지 않도록 하십시오.

세포 현탁액을 2밀리리터의 배지에 35mm 접시당 5번째 세포에 1.5배 10배로 플레이트화할 세포 현탁액을 준비합니다. 바이러스 형질주입 전에 세포 수를 계수하기 위해 조건 수에 추가된 35mm 플레이트 1개를 플레이트합니다. 30-45분 동안 배양합니다.

배양 시간이 경과한 후 현미경으로 세포를 확인하여 세포가 잘 분리되어 있는지 확인합니다. 여기에서 볼 수 있듯이. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 다음 날까지 세포를 성장시킵니다.

도금 다음 날에는 세포가 최소 50%의 밀도에 도달했는지 확인하십시오.세포 밀도가 50% 미만이면 바이러스 전달 효율이 저하됩니다. 세포당 단백질 발현의 변동이 증가하고 세포 독성이 증가합니다. 그런 다음 이전과 같이 추가 도금 접시에서 세포를 수확합니다.

그리고 세포의 수를 세십시오. 세포의 효율적인 형질도입에 필요한 바이러스의 양을 계산합니다. 각 조건에 대해 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙입니다.

그리고 400 마이크로 리터의 따뜻한 알파 MEM 마이너스를 추가하십시오. 얼음에서 바이러스의 분취액을 천천히 해동한 후 각 바이러스의 필요한 양을 튜브에 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 다음으로, 세포에서 배지를 흡인 한 후, 바이러스 믹스를 현명하게 부드럽게 첨가하십시오.

섭씨 37도에서 세포를 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 1 시간 동안 15 분마다 멸균 후드 아래에서 플레이트를 조심스럽게 교반하여 세포를 바이러스로 덮습니다. 소량의 배지를 사용하면 바이러스와 세포의 접촉을 용이하게 할 수 있습니다.

배양 후, 각 플레이트에 1.6 밀리리터의 알파 MEM 마이너스를 부드럽게 피펫팅하여 총 2 밀리리터의 부피를 얻습니다. 그런 다음 2시간 동안 세포를 더 배양하기 전에 2밀리몰의 티미딘을 추가하여 세포 동기화를 시작합니다. 한편, 마이크로튜브에 139 마이크로리터의 멸균수, 50 마이크로리터의 1몰 염화칼슘, 11 마이크로리터의 20 마이크로몰 siRNA를 첨가하여 siRNA transfection mix를 준비합니다.

siRNA가 필요하지 않은 경우 siRNA의 양을 멸균수로 대체하여 빈 transfection을 수행합니다. 염화칼슘 siRNA 혼합물에 HBSS2X 용액을 천천히 떨어뜨립니다. 200마이크로리터 피펫을 사용하여 공기 주입으로 두 번 부드럽게 혼합합니다.

침전물이 작을수록 transfection 효율이 향상됩니다. 그런 다음 실온에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다. 배양 후 각 플레이트에 200 마이크로 리터를 천천히 떨어 뜨리고 섞기 위해 교반합니다.

플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 16시간 동안 배양합니다. 다음 날, 인큐베이터에서 접시를 꺼내 조직 배양 후드로 운반합니다. 따뜻한 히피스 2ml로 세포를 두 번 헹군 후 인큐베이터로 돌아가기 전에 알파 MEM 마이너스 2ml를 추가합니다.

7시간 후, 인큐베이터에 다시 넣기 전에 플레이트에 2밀리몰의 티미딘을 추가합니다. 한 번에 4개 이하의 세포 플레이트로 작업하면 온도 변화가 세포 주기의 길이에 영향을 미치므로 작업하십시오. 다음 날, siRNA transfection 및 바이러스 감염 후 48시간이 지난 후 2ml의 따뜻한 PBS로 세포를 두 번 헹구고 라이브 셀 이미징을 위해 페놀 레드가 없는 알파 MEM 2ml를 추가합니다.

7시간 동안 배양합니다. 가습된 5% 이산화탄소 열 조절 챔버가 장착된 도립 현미경을 사용하여 유사분열 세포에 대한 단기 라이브 셀 이미징 실험을 수행합니다. 획득하기 전에 챔버가 섭씨 37도의 적절한 온도에 도달했는지 확인하십시오.

획득하기 1시간 전에 배양된 접시를 현미경 챔버에 놓아 배지의 적절한 평형을 유지하고 온도 변화로 인한 초점 이동을 방지합니다. 세포의 유사분열 상태를 검사합니다. 이 시점에서.

세포의 10-15%는 유사분열의 초기 단계에 있어야 합니다. 평형 시간 동안 이전 실험에서 결정된 대로 획득 매개변수를 설정합니다. 광표백 없이 적절한 해상도를 얻는 것이 중요합니다.

이것은 세포 손상을 일으키고 유사 분열 진행을 방해하기 때문입니다. 조건별로 유사분열 진입 위치에 있는 세포를 포함하는 여러 필드를 선택하여 획득 간격을 초과하지 않고 분석할 상당한 수의 세포를 얻습니다. 모든 필드가 선택되면 초점을 재설정하고 가능한 한 빨리 획득을 시작합니다.

회전하는 디스크를 사용하면 시스템에 초점을 맞출 수 있습니다. 일반적인 설정에는 네 가지 조건이 포함됩니다. 플레이트당 7개의 필드.

및 75분 동안 1.5 내지 2분 간격으로 2개의 컬러 채널을 포함하는 것을 특징으로 하는 채널. 사용되는 형광 마커에 따라 달라지는 세포의 유사분열 표현 유형을 분석하기 위해 잘 정의된 기준을 결정합니다. BAG3 GFP의 transfection과 대조적으로, 왼쪽에서 볼 수 있듯이 plasmic DNA는 오른쪽에 표시된 recompetent adenovirus를 사용한 아데노펙션을 통해 BAG3 GFP의 보다 균일하고 효율적인 발현을 가능하게 합니다.

대부분의 세포 집단에서 감염의 다양성이 낮습니다. 이 대표적인 웨스턴 블롯은 BAG3 특이적 siRNA와 재등성 아데노바이러스 BAG3 GFP를 사용한 아데노펙션이 내인성 BAG3를 효율적으로 고갈시키고 BAG3 GFP 단백질을 거의 내인성 수준으로 재도입할 수 있음을 보여줍니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 아데노펙션은 아데노펙션된 HeLa 세포에서 스트레스로 인한 열 충격 단백질의 수치가 감지할 수 있는 증가가 없기 때문에 단백질 항상성을 보존할 수 있습니다.

단백질 독성 스트레스 유도제인 MG132로 처리된 HeLa 세포와는 대조적입니다. 여기서 우리는 대조군 siRNA 및 BacMam GFP 알파 튜불린으로 아데노펙팅된 HeLa 세포의 이러한 콘 포컬 타임 랩스 이미지에서 볼 수 있듯이 유사분열을 통한 세포의 진행이 아데노펙션에 의해 크게 교란되지 않음을 알 수 있습니다. 및 BacMam FRP 액틴.

그래프는 비정상적인 유사분열을 가진 세포의 비율을 나타냅니다. BAG3 특이적 siRNA만으로 아데노펙션된 세포는 유사분열 결함 수준이 약 2배 증가한 것으로 나타났습니다. 빨간색 막대로 표시된 대로.

검은색 막대로 표시된 BAG3 GFP의 재도입에 의해 대조군 세포 수준 근처로 복원되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 아데노펙션을 사용하여 고갈 구조 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 여러 세포 배경에서 구조 기능 분석을 위한 hypomorphic knock down을 생성하는 빠르고 간단한 시스템을 제공합니다.

이 방법에 따라, 주어진 기능을 위한 관심있는 단백질에 중요한 구조상 필요조건은 확인될 수 있습니다. 그런 다음 게놈 편집의 다른 접근 방식을 사용하여 관련된 메커니즘을 심화할 수 있습니다.