Name: Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 학습하세요 FRAP 및 광활성화를 이용한 세포 이동성 단백질 역학 분석 방법을. B16-F1 및 NIH 3T3 세포에서 미세조작 기술로 사이토스켈레톤 조절 메커니즘을 실시간 관찰할 수 있습니다.

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우리는 감사 독일 연구 재단 (DFG)에 재정 지원 (Nr. RO2414/5-1 선급을 부여).

<ol><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP%2C+FLIP%2C+FLAP%2C+FRET+and+FLIM%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li>
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<li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).</li>
<li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li>
<li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li>
<li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li>
<li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li>
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<li>Small, J. V., Rottner, K. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007/978-90-481-9301-1">Actin-based Motility</a>. Carlier, M. F. , Springer. Dordrecht. (2010).</li>
<li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li>
<li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualising+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li>
<li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li>
<li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li>
<li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li>
<li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li>
<li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signalling+to+the+Arp2%2F3+complex+steers+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li>
<li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+dynamics+during+keratocyte+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li>
<li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li>
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<li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832(2017).</li>
<li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, Pt 7 1367-1377 (2001).</li>
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저자는 공개 없다.

여기 우리는 어떻게 그들이 다른 실험 조건에서 응용 프로그램에 대 한 최적화할 수 있습니다이 문서에 설명 된 기술에 중요 한 단계를 논의.
Microinjection 셀에 외 인 단백질, 억제제, 또는 약물 소개에서 인스턴트 효과 모니터링에 적용 될 수 있는 방법입니다. 그것은 특히 어려운에 단백질의 기능을 결정 하기 위한 유리한 수 transfect 세포 종류를 또는 장기 식 하지 원하는 상황에서. 그것은 특정 종류의 세포 생존에 씨를 뿌리고 기질에 따라 주목 해야 합니다. 가장 내 피, 상피, 또는 섬유 모양의 세포 유형, 심지어 작은 것 들 같은 생선 keratocytes (참조 댕 외. 21 고 앤더슨과 크로스22) 성공적으로 주입 될 수 있습니다. 그러나, 세포 이동의 우수한 모델 시스템을 구성 하지만 알 수 없는 이유로이 유형의 하 층에 주사와 호환 되지 않는 B16-F1 셀 laminin에 시드 같은 예외가 있다. NIH3T3 fibroblast 세포, 우리가 일상적으로 수행 주사 fibronectin 층, 및 추가적인 photomanipulation 기술은 졸라 (photoactivation도, 여기 B16-F1 셀에 대 한 표시) 등이 섬유 아이 세포 (참조에서에서 동일 하 게 수행할 수 있습니다. 예를 들어, Köstler 외. 3). 그것은 또한 고려 되어야 한다 그들의 기능 특성 및 실험 목표에 따라 다른 단백질 다른 양의 변경, 시간을 초에서 변화 하는 시간을 걸릴 수 있습니다. 기법의 장점은 외 인 에이전트의 복용량/농도 플라스 미드 transfection를 사용할 때 보다 예를 들어, 단일 셀 수준에서 더 정확 하 게 제어할 수는 이다. 또한, 단백질의 형광 태그 아니다 붙일 태그가 다른 단백질의 동시 다중 채널 시각화가 필요한 경우 유연성을 증가 시킬 수 있는 셀의 존재를 보장 하는 필요. Microinjection 셀 형태학 또는 (예를 들어, 당 외 골격의 동적 변화에 특정 단백질 또는 단백질 혼합물의 인스턴트 효과 분석 하는 데 특히 유용할 수 있습니다. 21 Arp2/3 복합물 억제제 Arpin에 의해 마이그레이션에 인스턴트 효과의 예). 기술의 단점은 세포 손상 또는 세포 형태에 영향을 미칠 수 있는 그것의 침해입니다. 따라서, microinjections를 수행할 때 중요 한 고려 사항은 세포 생존 능력을 모니터링입니다. 여기 소개 하는 방법은 수동 조작에 의존 합니다. Fibronectin 층에 성장 하는 섬유 아 세포 등 성공적인 주사와 호환 되는지 테스트 하는 조건에서 여기에 설명 된 수동 주입 프로토콜을 사용 하는 근처 100% 성공률; 3이전 게시 비디오 현미경 또는 FRAP를 포함 하 여 정교 하 고 시간이 걸리는 후속 실험으로이 접근을 결합할 때이 필수적입니다. 이 때때로 그를 제외 하지 않습니다, 그리고 개별 셀의 핵 및 세포질, 세포 가장자리 철회 뒤 대비의 갑작스러운 변화에 의해 안전 하 게 인식 될 수 있다 microinjection 이벤트에서 저하 될 수 있습니다. 이러한 드문 경우에 실험은 제외 하 고 따라서 추가 분석에 대 한 간주 되지 않습니다.
그러나, 반 자동 접근은 또한 일반적으로 사용, 예를 들어 빠른 채용 (< 300 ms) 컴퓨터 제어 바늘 낮추는 사출 압력 증가, 일치는 바늘만 각각 이전 각 셀 위에 위치 해야 사출입니다. 반-자동 주사의 성공률은 정의상 단순히 위에서 설명한 수동 방식 보다 낮은 속도 위해 최적화 때문에 뒤에;이 치료를 성공적으로 살아남은 여러 셀의 분석 따라서 개별 셀의 성공적인 주입에 의존 하지 않습니다. 따라서, 단일 세포 분석, 반대 반 자동 주사는 더 나은 적합 몇 백 셀, 예를 들어, 비디오 현미경 낮은 확대율에서 또는 셀 고정 및 얼룩에 의해 주입 효과 분석 합니다. 고용 하는 상세한 접근 방식에 관계 없이 microinjection 분석 결과, 끝점을 구성 하지 않습니다 하지만 다양 한 기법, FRAP 또는 photoactivation3를 포함 하 여 결합 될 수 있다.
현미경 이미징 및 설치 조건에 따라 레이저의 강도, 낙관 한다 FRAP에 의해 단백질 이직 률을 결정할 때 (확대, 목표, 등, 셀 형식, 구조, 및을 위한 형광 단백질 photobleaching)입니다. Note는 최적의 레이저 전력 효율적인 표백와 결합 가능한 최소 photodamage 수축 방지 또는 분석 (예: lamellipodia 또는 filopodia) 또는 세포 수준에서도 피해 구조 철회 완료. 이상적으로, 표백 효율의 70-80% 이상 달성 되어야, 비록 완전 한 표백 있는 경우, 50% 이상의 아무것도 또한 받아들일만 할 수는 단백질의 매우 빠른 회전율에 의해 방해 받을 수 있습니다. 주어진된 구조와 형광 염료에 대 한 최적의 표백 전원 실험적으로 시험 되어야 한다, 그것의 점진적 증가 다음 낮은 레이저 전원에서 시작. 물론, 모든 형광 염료 수 정의 표백 흥분의 절정에 가까운 빛 레이저 (488 nm FITC 또는 EGFP 같은 자주 사용된 녹색 염료에 대 한). 그러나, 근처 UV 레이저와 같은 더 짧은 파장을 가진 레이저 높은 힘을 전달 하 고 따라서 또한 사용할 수 있습니다 일반적으로 사용 되는 염료의 효율적인 표백. 우리가 일상적으로 사용 하는 405 nm 다이오드 레이저 (120 mW)와 후자 (데이터 표시 되지 않음)의 경우 약간 낮은 효율 EGFP와 (예: mCherry), 빨간색 형광 염료의 탈색. 로 405 nm 다이오드 PA-GFP (아래 참조)의 photoactivation도 사용할 수 있습니다, 그것은 최대한 유연성이 시스템을 endows.
B16-F1 셀 구조와 형광 단백질 photobleached 여기에 대 한 65-100 사이 405 nm 레이저 힘은 적용 되었다. 분석할 때 photobleached 지역, 그것은 보존 여부 주어진된 구조는 그것의 원래 모양에서 분석을 통해 기간을 고려 하는 것이 중요. 예를 들어, lamellipodia 끝 단백질의 매출을 분석할 때 주의 해야 lamellipodia의 곡률 크게 시간이 지남에 변경 여부로 곡률에 변화 지역/컨투어 분석 하지 않으면 부정확 한 결과으로 이어질 수도 있습니다. 완전히 각 측정 프레임에서 구조 전체를 포함 합니다. 또한, lamellipodia, microspikes, 등에 포함 된 번들 형광 강도 편차를 발생할 수 있습니다 주목 해야한다. 그림 2b (9 s 시간 프레임에 흰색 화살표)에서 볼 수 있듯이 microspike 같은 구조 측정된 photobleached 지역 옆에 위치 하 고 있습니다 하지만 외부 측정의 기간에 걸쳐 있고 따라서 모든 발생 하지 않습니다. 부정확입니다. 단백질 회전율의 분석, 지역 분석의 위치와 크기를 선택할 때 중요 한 고려는 시간이 지남에 그들의 형광 해야 하지 수 크게 영향을 변화 세포 형태학 또는 요인에 의해 다른 하드을 피하기 위해 수집 photobleaching입니다. 예를 들어, 구조 분석된 구조에 상당한 양적 기여를 제공 이동 해서는 안됩니다 측정 지역의 분석; 중 또한, 나노미터 구조 단백질을 유치 하는 등 관련 없는, 형광 엔터티 분석 중 관심 분야를 입력 하지 해야 합니다. Lamellipodial 걸 중 합 속도 결정 한다 주의 없음 제거 또는 구겨지지 (즉, 위쪽으로 접는) lamellipodia는 분석으로이 강하게 결과의 정확도 영향을 미칠 것입니다. 또한, lamellipodial 말라 합의 과대평가로 이어지는 잠재적으로 lamellipodial 지역 철회 급속 한 후방 전으로 나타날 수 있습니다. 추가 고려는 세포내 정규화 영역 (인수 photobleaching의 교정에 대 한 참조 위치로 촬영 한 것)의 거리에서 photobleaching의 실제 위치는 충분히 커야 한다 피하기 위해 직접 photobleached 영역에 의해 영향을.
PA GFP 태그 구문 photoactivation에 대 한 최적의 조건을 설정할 때, photoactivation 동안 인스턴트 표백 방지 하기 배려를 취해야 한다. 우리의 작업에서 최상의 결과 얻으려면 레이저 힘으로 가져온 EGFP의 표백에 대 한 일반적으로 고용 보다 5-10 배 낮은. Photoactivated 분자의 이미지 수집에 대 한 노출 시간 프레임 사이의 시간 간격 해야 지역 및 photoactivated 될 구조물의 크기를 고려 하 여 최적화와 photoactivated의 잠재적인 이동성 뿐만 아니라 분석 다른 subcellular 위치에 단백질입니다. 형광 이미징의 모든 유형에 서 세포 생존 능력의 유지 보수 순수 관련 결과 얻기 위해 결정적 이다.
원칙적으로, mEos 등 Dronpa 변종12 형광 단백질의 그린-레드 photoconversion 다음 역학의 동등 하 게 강력한 방법 및 subcellular 구조는 lamellipodium 등의 매출 구성 ( 예를 들어, 참조 Burnette 외. 23). PA-GFP 반대로 후자의 방법의 장점은 공동 추가 빨간색 형광 단백질을 표현 하는 필요 없이 두 가지 색상으로 변환 전후 단백질 역동성을 따라 가능성 것입니다. 그러나, 우리의 예비 실험에 대비 변경의 범위와 형광 신호 PA GFP의 photoactivation에 따라 달성의 강도 photoconverted 프로브에 비해 더 큰 아마도 레드와 그린의 우수한 스펙트럼 기능 형광 조사 (데이터 표시 되지 않음) 합니다. 어떤 경우에, lamellipodia 또는 Vaccinia 바이러스 유도 말라 꼬리 같은 셀 가장자리 돌출 말라 필 라 멘 트 매출에 대 한 상세한 연구 지금까지 출판 되었습니다 PA GFP 파생 상품5,,624를 사용 하 여.
Photoactivation에 따라 분석 하는 셀 영역을 고려할 때 여러 가지 요인 취해야 한다 계정에는 (활성화는 cytosol에 따라 셀 가장자리에 말라 단위체의 설립), 여기에 표시 된 특정 한 예를 사용 하 여 설명 하지만 다양 한 유사 과학적인 문제를 확실히 추정 될 수 있습니다. 첫째 때 측정 cytosolically photoactivated 단백질의, 예를 들어, lamellipodial 설립의 고유 실험 조건에서 (같이 Dimchev 그 외 여러분 6) 크기의 cytosolic 영역 및 lamellipodial 가장자리에 그들의 거리 실험 그룹 사이 비교 해야 합니다. 그것은 또한 photoactivating cytosolic 영역, 셀 두께 크면 위치 가까이에 핵을 고려 하는 것이 중요입니다. 두꺼운 세포 지역 활성화 활성화 될 단백질의 분포 homogenously는 cytosol에서 배포 되는 활성화 된 단백질의 더 높은 양을 발생할 수 있습니다. 마지막으로, 활성화 될 단백질의 표정 수준을 확실히 수 높은 변수 개별 셀에. 이러한 모든 고려의 다양성으로 인해 특정 지역에서 활성화 시 얻은 총 형광을 기준으로 셀에 다른 cytosolically 활성화 단백질의 통합 수준을 비교 결정적 이다.
우리는 설명 어떻게 microinjection 세포 형태학에 단백질의 효과 조사 도구로 사용할 수 있다 exemplified이 보여주는 NIH3T3 fibroblast 세포와 microinjected에서 lamellipodial의 강력한 유도 작은 GTPase Rac1. 우리 이전 셀 흉터/웨이브3의 C-터미널 WCA 도메인 microinjected Arp2/3 기능 방해에이 기술을 적용 했습니다. FRAP 또는 photoactivation 같은 다른 분석 실험에 의해 microinjected 세포에 다양 한 매개 변수를 분석할 수 있습니다. 우리는 어떻게 FRAP 및 photoactivation 조사 subcellular 역학과 말라 단위체의 이동성에 대 한 사용할 수 있습니다 설명 했습니다. FRAP 우리의 그룹에 의해 사용 되었습니다 이전5 VASP, Abi, cortactin, cofilin, lamellipodia를 지역화 하 고 상한 단백질, 단백질 또는 elucidating 존재에 초점 접착에서 부품의 매출에 대 한 매출을 조사 하 그리고 Rac의 부재 신호4. 또한, photobleaching EGFP 태그 β-말라5에 의해 달성 될 수 있다 걸 중 합 속도 측정 하지만 존재 하는 다른 방법. 라이브 셀 이미징 호환 프로브 셀룰러 걸 필 라 멘 트, Lifeact25, 같은 라벨 보는 형광 이질성을 추적 고용된6,26일 수도 있습니다. 여기 장점은 β-말라의 overexpression 피할 수 있다, 셀 가장자리 돌출 및 마이그레이션, 증가 수 그리고 이렇게 잠재적으로 방해 실험 질문 또는 특정 분석 결과 (참조 예를 들어, 케이지 외. 26. Peckham 외. 그러나 27). Lifeact 프로브의 뚜렷한 단점 있도록 프로브 매출에만 정보를 제공 하는 셀에 Lifeact 이라고 표시 된 걸 필 라 멘 트 구조의 표백/걸 필 라 멘 트에 바인딩의 활동 그것의 급속 한을 구성 하는, 하지만 하지 말라 필 라 멘 트, 있는 그것은 바인딩25의 회전율. 형광 이질성의 추적 고용 이전6,26 실용적인 타협에서는, 많은 유사한 형광 speckles의 널리 사용 되는 추적에 통합 filamentous cytoskeletal 구조 ( 예: 연어와 워터 맨28참조), 하지만 사용 하는 만큼 정직 하 고 F-말라 EGFP 태그 구조의 FRAP 처럼 정확 하지 않을 수 있습니다. Photoactivation으로 돌기 하는 그것의 이동성 cytosol, 실험적으로 조정된 cytosolic F 걸 레벨6의 맥락에서 전체로 서 lamellipodia, 단위체 말라 설립의 속도 추정을 위한 회사에 의해 적용 되었습니다. 기술은 cytosolic 영역 등 비교적 큰 지역에서 파생 된 이동성 및 단백질의 분포를 검사 하는 경우 유용 합니다. 그러나, 상대적으로 작은 photoactivated 구조;에서 파생 된 단백질의 분포 조사 예를 들어, 성장 콘 형광 분자 활성화의 낮은 숫자, 약한 신호를과 따라서 감도의 부족 될 수 있습니다. Photoactivation 또는 photoconversion 형광 (위 참조)의 잠재적인 대체 기술을 역 투자 수익, 형광 분자에서의 이동성을 추적 하 여 다음을 제외 하 고 전체 셀 photobleaching에 의존 FRAP 포함 될 수 있습니다. 이 지역. 기술은은 단백질의 photoactivatable 버전 overexpressing 필요 하지 않습니다 하지만 항상 잠재적으로 photodamage 등 원치 않는 부작용을 일으키는 레이저 힘의 비정상적으로 높은 복용량에 노출 포함 됩니다.
명확 하 게, photoactivation 및 FRAP 단백질 단위체, 이합체, 또는 심지어 작은 올리고, 이동 하는 그들은 추가 바인딩 파트너와 함께에서 이동 여부 및 구별할 수 없습니다. 형광 상관 분광학 기법29 또는에서 또는, FLIM 무서 워30대신 그런 종류의 정보를 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, FRAP photoactivation 직접 관심, subcellular 위치, 또는 세포 유형 공부의 단백질에 관계 없이 셀에 지역 및 글로벌 단백질 역동성을 평가 하기 위해 간단한 접근 구성.

단백질 및 살아있는 세포에서 다른 분자의 spatiotemporal 역학 모니터링 세포와 분자 생물학의 여러 분야에서 필수적인 도구가 되고있다. 고급 형광 현미경 검사 법 기술로 형광 공명 에너지 전달 (무서 워) 무서 워-형광 일생 (FLIM 무서 워), 이미징 또는 FRAP, photobleaching (플립)과 photoactivation 형광 손실 뿐만 아니라 많은 다른 사람 허용 시간적 및 공간적 확산의 속도 론 및 지역화 셀1,2에 있는 다른 단백질의 결정 뿐 아니라 단백질-단백질 상호 작용, 구조적 변화의 추적. FRAP 및 photoactivation 기술을, 특히 말라 골격 및 세포 이동의 레 귤 레이 터를 조사 하기 위한 널리 적용 됩니다. 이 기술은 또는 microinjection3, 같은 추가 micromanipulation 기술로 적용 될 수 있다 고 붙일 표시 된 단백질의 표현을 포함. 그들은 걸 부자 구조 단백질 협회의 활동의 추정 filopodia 또는 lamellipodia, 초점 접착4, 단백질의 회전율 등 셀 마이그레이션에 관련 된 또는 말라 네트워크5분기 있습니다. 그들은 또한 lamellipodial 걸 중 합 속도, 결정 단위체 말라 cytosol, subcellular 말라 단위체 전 polymerizing에서 튀어나온 걸 필 라 멘 트에의 속도 내에서 분산의 평가 가능 하 게 lamellipodia6, 그리고 다른 매개 변수입니다.
FRAP 시각화 및 원래 악 셀7에 의해 1970 년대에 개발 된 살아있는 세포 내에서 단백질의 이동성을 측정 하는 방법 이다. 붙일 표시 된 단백질으로 채워진 셀, 내 관심 (ROI) 영역 정도 높은 강도, 시간의 짧은 시간 동안이 지역에 존재 fluorophore 분자의 표백을 충분 한 레이저에 노출 됩니다. 표백, 붙일 표백, 하는 동안 투자 수익 밖에 있는 단백질 분류 확산 되며 시간이 지남에 photobleached 분자의 변위를 일으키는 그들의 spatiotemporal 역학에 따라 표백된 지역에 침투. 형광 표백된 지역에 복구 속도가 주어진된 분자의 확산의 속도 및 크기를 포함 하 여 다양 한 요인에 따라 달라 고 내는 상 상속의 회전율이 표백된 구조를 연결 하는 코스. 따라서, 수용 성 단백질 단백질 초점 유착 등 구조와 밀접 하 게 관련 된 동안 보급을 통해 급속 하 게 표백된 ROI 내에서 형광의 복구 중재할 것 이다, 그들의 형광 복구 것입니다 회전율 시간이 더 오래 있을 것 이다 모두 구조 관련 분수의 단백질과 분리 협회 활동의 녹는 분수의 보급에 따라 달라 집니다. 형광 복구는 일반적으로 취득 하 고 계량 형광의 사전 표 백제 농도의 초기 수준에 도달할 때까지. 그러나,이 경우 초기 형광 강도의 일부 확산에 의해 보충 될 수 있는 소위 움직이지 분수에 속한다 또는 모바일을 구성 하는 분자의 대부분에 비해 매우 느린 속도로 보충은 발생 하지 않습니다. 분수입니다. 단백질 회전율의 비율을 확인 하려면 FRAP 곡선 시간이 지남에 형광 복구의 범위를 나타내는 생성 됩니다. 이러한 복구 곡선에서 단백질 복구의 평균 반 시간을 계산할 수 있습니다. 생성 함으로써 평균 FRAP 데이터 및 따라서 수학적 분석의 곡선에 맞는, 그것은 또한 모바일 분수의 평균 이직 률 구성 분자의 한 균질 인구의 합성 또는 그것은으로 구성으로 추정할 수 차동 속도에서 선회 하는 분자의 두 개 이상의 모집단 양적 접근에 의해 단백질 이직 률을 추정, 뿐만 아니라 lamellipodia에 photobleached 지역의 복구를 추적 허용할 수 있다 또한 역행 흐름, 돌출, lamellipodial 운동 성 매개의 정확한 정량화 그리고 말라 중 합 속도입니다. 따라서, FRAP 살아있는 세포의 구조 내에서 다양 한 매개 변수를 평가 하기 위한 적용 되는 다양 한 도구를 구성 합니다.
Photoactivation는 단백질 또는 지정 된 세포 위치에서 발생 하는 분자의 확산을 추적 하는 데 사용 되는 방법입니다. 기술을 사용 하 여, 예를 들어, 야생-타입 녹색 형광 단백질 (GFP), 패터 슨, 리 핀 코트 요 슈워츠8, 그것의 형광에 노출 시 매우 증가 될 수 있는 방식에 돌연변이 의해 처음에 개발의 변종 자외선 (UV) (약 400 nm; 여기, 405 nm). 패터 슨 외에 의해 설명된대로., 중립 페 놀 및 생산 약 397에 주요 흡 광도 피크 음이온 phenolates의 혼합된 인구로 서 존재 하는 야생-타입 GFP chromophores nm와 475에 사소한 한 nm, 각각. 자외선과 단백질의 조사, 시는 인구 photoconversion, 음이온 양식으로 변화를 겪 습. 488 흥분 때 nm, photoconverted/photoactivated 단백질 형광, 활성화 사이 구별 및 비-활성화 GFP 높은 본질적인 배경 형광 때문에 연습 부족에 3 증가 전시. 그러나, 배경 강도 감소 GFP 시퀀스 (히스티딘 대체 위치 203)에 단일 아미노산 돌연변이 도입 하 여 달성 되었습니다. Photoactivatable-GFP (PA-GFP)는 자외선과 방사선 조사 시 이후에 488 nm 빛에 의해 흥분 하는 때 거의 약 증가 작은 피크의 흡 광도 있는 뜻깊은 감소 특징 이다로 알려져는 결과 T203H 돌연변이 체 따라서, PA GFP 태그 단백질의 overexpression 유포의 결정 및 분자의 운동 성 세포 내에서 허용 하는 널리 사용 되 접근 이다. 우리는 이전 적용 PA GFP 태그 말라 말라 단위체 cytosolic 영역에서의 분산의 비율을 결정 하는 돌기에 cytosol, 뿐만 아니라 그들의 설립 속도 내에서 그들의 이동성의 뿐만 아니라 탐사를 허용 lamellipodial 걸 네트워크6. 최근 문학 소설, 사진-컨버터블 단백질 원리에서 사용 될 수 있는 유사한 방식, 설명 합니다 하지만 사진 변환 하기 전에 이미 볼 수 있도록 잠재적인 이점을 은닉. 형광 단백질의이 그룹에 대 한 예로 Dendra2 및 mEos29,10,,1112.
이 문서에서는, 우리는 단백질 microinjecting 셀 방법론 설명. 우리 더 어떻게이 기술은 결합 될 수 있다 FRAP, 말라 골격 규제 및된 운동 성, photobleaching 단백질에 의해 어떻게 FRAP 곡선 및 하프 타임 모바일 분수의 복구의 파생 될 수 있습니다 설명 합니다. 또한, 우리는 FRAP 기술을 사용 하 여 lamellipodial 네트워크의 걸 중 합 속도 결정 하는 방법을 예를 제공 합니다. 우리는 또한 지침 및 단위체 말라의 cytosolic 이동성 및 lamellipodia로 말라 설립의 결정 하는 데 사용할 수 있습니다 photoactivation 실험을 수행 하는 방법에 대 한 도움말을 제공 합니다. 이러한 기술은 물론, 하지 않습니다만 제한 걸 골격 구성 요소를 추적 하지만 잠재적으로 필요한 적당 한 적응 또는 최적화, 널리 적용할 수 다른 세포 유형 또는 다른 단백질, 구조, 조사 하 고 매개 변수입니다.

<table><tbody><tr><td>B16-F1 마우스 피부 흑색종 세포&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td><td>CRL-6323</td><td></td></tr><tr><td>NIH-3T3 cells</td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5g/L 포도당&nbsp;</td><td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, 독일</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F-12 미디엄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8641</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청&nbsp; (증권 시세 표시기)</td><td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>F7524</td><td>Lot054M3396</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산&nbsp;</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, 독일</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-글루마틴 200mM (100x)</td><td>Life Technologiesies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep 5000 U/mL</td><td>Life technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Laminin 코팅 버퍼&nbsp;</td><td></td><td></td><td>자체 제작: 인간 플라즈마에서 추출한 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td></tr><tr><td>Fibronectin;</td><td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td><td>11 051 407 001</td><td></td></tr><tr><td>Jetpei</td><td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>JetPei buffer</td><td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td><td>702-50</td><td>150mM NaCl</td></tr><tr><td>PA-GFP-actin plasmid DNA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Koestler et al.2008</td></tr><tr><td>pEGFP-actin plasmid DNA</td><td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td><td></td><td></td></tr>에 기술됨 <tr><td>GST</td><td></td><td></td><td>태그 버전으로 정제되고 주입 전 GST에서 절단</td></tr>된 미<tr><td>세주입 완충액</td><td></td><td></td><td>자체 제작: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td><td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>현미경 원형 커버 안경 15mm, No.1&nbsp;</td><td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td><td>1001/15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5242 956 003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 그리스&nbsp;</td><td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td><td>SGM494</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 오픈 다이아몬드 욕조 이미징 챔버</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>자동 온도 컨트롤러</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>현미경: Axio Observer&nbsp;</td><td>Carl Zeiss, 예나, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap-HQ2 카메라&nbsp;</td><td>포토메트릭스, 투손, AZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG4 광원&nbsp;</td><td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 소스&nbsp;</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet 마이크로인젝터&nbsp;</td><td>에펜도르프, 함부르크, 독일</td><td></td><td>압력 공급 용 내장 압축기 포함</td></tr><tr><td>Nikon Narishige Micromanipulator 시스템</td><td>Nikon Instruments, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview 소프트웨어 v2.1.4</td><td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 소프트웨어 v7.8.10</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma Plot v.12</td><td>Systat Software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 cytoskeletal 레 귤 레이 터의

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

단백질의 spatiotemporal 역학 조사 하는 것은 다양 한 문맥에서 그들의 기능적인 중요성을 밝힐 수 있다. 이 문서에서 그것은 photobleaching (FRAP) 및 photoactivation 기술을 후 논의 어떻게 형광 복구 단백질 subcellular 위치에의 spatiotemporal 역학 공부를 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 이러한 기술을 간단한 결정 걸 cytoskeletal 레 귤 레이 션 및 세포 운동에 연결 하는 다양 한 매개 변수를 사용 하는 방법을 보여줍니다. 또한, 세포의 microinjection 또한 설명 (잠재적으로 앞 또는 상기 photomanipulation 기술을 보완) 대체 치료로 셀에 translocated 단백질의 트리거 즉각적인 효과를 형태와 기능 Micromanipulation 단백질 주입 또는 원형질 막 투과 약물 또는 cytoskeletal 억제제의 로컬 응용 프로그램과 같은 단일 세포 및 subcellular 세포 행동에 주어진된 치료의 즉각적인 결과 기록 하는 강력한 도구 역할을 할 수 있습니다. 수준입니다. 이것은 궁 행 여기 lamellipodial 셀 가장자리 돌출의 즉시 유도 의해 재조합 Rac1 단백질의 주입에 의해 4 분의 1 세기 전에 설립. 또한, 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 매출을 결정 하기 위한 프로토콜 제공-VASP는 걸 필 라 멘 트 중 합 효소 두드러지게 B16-f 1 셀의 lamellipodial 끝 축적 FRAP 고용 하 고 포함 하 여 관련 데이터 분석 및 커브 피팅입니다. 우리 또한 EGFP 태그 β-걸 표현 하는 세포에 의해 exemplified lamellipodial 말라 네트워크 중 합 속도 추정 하는 것에 대 한 지침을 제시. 마지막으로, 지시 급속 한 필 라 멘 트, lamellipodia, 돌기의 끝에와 같은 사용 하 여 어셈블리 photoactivation의 사이트에서 말라 설립 뒤 셀 세포질 내에서 말라 단위체 이동성의 비율을 조사 하는 방법에 대 한 주어 집니다. 접근 한다. 이러한 프로토콜의 구성 요소 또는 말라 골격의 레 귤 레이 터에 제한 하지만 유사한 패션 spatiotemporal 역학 및 다양 한 다른 subcellular 구조 또는 기능적 단백질의 기능에 찾아보기 쉽게 확장 될 수 있습니다. 컨텍스트입니다.

그림 1 g h 단계 이전 NIH3T3 fibroblast 세포 이미지와 10 분 후 microinjection은 복잡 한 파와의 상호 작용을 통해 lamellipodia 형성 유도 능력이 작은 Rho 가족 GTPase Rac1의 표시. 셀은 먼저 그것의 생존 능력 및 형태, 예를 들어, lamellipodia의 부족을 확인 microinjection (그림 1g), 전에 시각화 됩니다. 10 분 후 microinjection에서 셀 명확 하 게이 치료에서 예상 되며 성공적인 주입 (그림 1h) 나타냅니다의 형태를 변경 했습니다.
단순 하 고 선명도, 우리는 다음 또한 microinjected 하지가지고 셀에서 FRAP 및 photoactivation 분석을 위한 모범적인 결과 제공.
Lamellipodium 끝에 VASP EGFP 태그의 회전율의 분석 그림 2a ~ f에 표시 됩니다. Note VASP 또한 초기 및 초점 유착, 셀 내부18,19에 작고 길쭉한 점을 대상. 끝에 분명 VASP 누적 된 lamellipodial 영역의 형광 강도 표백 이었고, 중, 전과 후는 lamellipodium 돌출 전달으로 표백 투자 수익의 윤곽에 따라 각 기간에 대 한 측정. 표백된 EGFP VASP 단백질 비 표백 분자가이 사이트에서 재생 되는,으로 형광의 점진적인 회복 (그림 2b) 관찰 된다. 이 방식 하 고 사전 표 백제 농도 (1로 표현)으로 정규화 FRAP 복구 곡선 그림 2c에서 볼 수 있습니다. Photobleaching 효율과 다를 수 있습니다 표백이 예제에서 t 0에 있는 값에서 결정 하기 전에 값의 약 20%는 (photobleaching 후 첫 번째 프레임). 형광의 증가 고원 예 전에 표백 형광의 약 80%에 도달 합니다. 초점 접착 등 실험의 시간 과정 동안 정적 구조 사전 표 백제 강도와 고원 형광의 차이 도달 후 복구 움직이지 분수 (IF, 빨간색 화살표 그림 2에서로 정의 됩니다. c, e), 형광의 양을 사이 표백 하 고 완전 한 회복의 시간 복구 하는 반면 모바일 분수 (녹색 양방향 화살표 그림 2c, e)로 정의 됩니다. Lamellipodium 팁 여기 분석 등 동적으로 변화 하는 구조에서 IF의 범위 수 있습니다 뿐만 아니라 움직이기 힘 드는 분자를 대표 하지만 EGFP VASP 강도이 의존 알려져 있다 또한 돌출 속도의 감소에서 파생 매개 변수18. 복구의 하프 타임을 계산 하려면 시그마 플롯 (그림 2d)에 맞는 곡선을 만들었습니다. 해결 하는 방정식 2 에서 추출 된 "b" 매개 변수 값은이 경우에, 0.0754 때 적용 로그 함수 (식 4) 9.19의 복구의 결과 약된 반 시간에 (그림 2d , 맨 오른쪽 패널), 이전5에 게시는 상대적으로 평균에 비해 특정 셀이에 빨리. 그것은 그 복구-시간 달라질 수 있습니다 때로는 크게 셀에서 동일한 인구 내의 주목 해야 합니다. 따라서, 대표적인 결과 얻기 위해 적어도 15-20 셀에서 평균으로이 매개 변수를 확인 것이 좋습니다. 분산, 15 셀에서 평균 EGFP VASP 복구의 산술 방법의 정도 설명 하기 위해 각 시간-포인트 생성된 (그림 2e), 그리고 평균 곡선에 맞는 만든 유사한 패션 (그림 2 에 표시 f)입니다.
Lamellipodial 걸 네트워크의 중 합 속도 앞으로 네트워크 돌출 및 역행 흐름의 합으로 구성 됩니다. FRAP β-말라 EGFP 태그와 photobleaching 튀어나온 lamellipodial 지역 (그림 2g)와 (이 경우 F1 B16)에서 transfecting 셀 여 걸 중 합 속도 측정 하는 데 적용할 수 있습니다. Lamellipodial 걸 네트워크 중 합의 분석, 대 한 β-말라 EGFP 태그의 표백 시 형광 회복 시간이 지남에 평가. (이 모든 전면20쪽으로 포인트) lamellipodial 걸 필 라 멘 트의 가시 끝에 말라 단위체 진행의 합으로 네트워크 이며 끊임없이 translocated rearwards 전달, 진행 속도 쉽게 될 수 있습니다. photobleaching에 따라 형광의 편광된 복구 통해 얻은. lamellipodium의 형광 복구 완료 되 면 최대한 빨리 표백된 영역에는 lamellipodium의 뒤쪽 부분과 더 수평으로 배열 된 필 라 멘 트 번들의 낮은 밀도 의해 특징입니다 얇은 판자 사이 전환 영역에 도달 했습니다. 선회는 lamellipodium에서 무엇을 관찰 하는 것 보다 훨씬 더 느리게. 그림 2g에서 볼 수 있듯이 형광 복구 수평 가장자리를 돌출 고 (개별적으로 나타나는 퇴행 성 흐름의 거리 측정을 허용 하는 얇은 판자 쪽으로 거꾸로 흐르는 선으로 구상 될 수 있다 주황색과 빨간색 양방향 화살표로 그림 2g 의 맨 오른쪽 패널에서 각각).
우리는 또한 photoactivation PA-GFP-말라 말라 단위체는 cytosol 내에서 이동성 및 lamellipodia 튀어나온 내에서 그들의 설립의 속도 추적 하을 transfected B16-F1 셀에 적용 했습니다. 그림 3a, b에서 볼 수 있듯이 cytosolic 영역 405 nm 레이저에 노출에 의해 photoactivated, 이미지는 GFP에 인수 했다 하는 동안 채널 모든 1.5 GFP 태그, photoactivated 말라의 분포를 시각화에 대 한 s. 그림 3bcytosolic 지역의 확산 Photoactivated GFP-걸을 볼 수 있습니다. Photoactivated cytosolic 영역에서 형광 강도 감소의 속도 (t0)에서 초기 휘도의 비율로 표시 됩니다 (첫 번째 photoactivation; 후 프레임 그림 3 c). Photoactivated 말라 또한 새로운 걸 단위체의 돌출 하는 동안 걸 필 라 멘 트를 elongating 성장 가시 끝에 추가 됩니다 lamellipodia의 끝에 통합. Lamellipodial 설립의 속도 예상 하려면 우리는 약 5 µ m 폭에서 및 높이; 1 µ m의 2 차원 윤곽선/지역 시간이 지남에 형광 강도 측정 지역 끊임없이 다시 protruded 그것으로 lamellipodium의 끝에 위치 했다. 말라 설립 (t0)에서 photoactivated cytosolic 영역의 형광 강도의 비율로 표현 되었다 (그림 3d). 말라 필 라 멘 트의 연신 율 진행, 새로운 걸 단위체 lamellipodial 앞에 통합 했다. 이러한 걸 단위체의 분수 확률론 단위체 photoactivated을 했다 cytosolic 풀에서 파생 되었다. 첫 번째 20에 lamellipodia에 형광의 급속 한 증가에이 결과 후 photoactivation s. 로 새로운 단위체 퇴행 성 흐름으로는 얇은 판자 쪽으로 필 라 멘 트와 함께 이전 법인된 걸 단위체 흐름 lamellipodial 앞에 추가 되 고 있습니다. 시간, ROI 완전히 채워집니다 형광 단위체 및 형광에 대 지에 도달 하면 (그림 3d). 형광에 있는 점차적인 하락 다음 때, 셀에 걸쳐 photoactivated 단위체의 확산에 따라 관찰, 비 photoactivated 걸 단위체는 점점 추가 되 고 다시 lamellipodial 앞에. 형광이이 감소는 새로운 고원, photoactivated 및 photoactivated 비 단위체 사이 전체 셀에 균형 (데이터 표시 되지 않음)에 도달할 것입니다 발견할 것 이다.
cytosol에 걸쳐 걸 단위체의 이동성 distally ( 그림 3는 색상 코드 영역 표시에 exemplified photoactivated 지역에서 위치 하는 같은 크기의 영역에서 형광 강도 측정 하 여 파생 되었다 R1-R5). 이 지역의 각각에서 형광 강도에서 점차 감소e 그림 3볼 수 있듯이 cytosolically photoactivated 지역, photoactivated 말라 단위체의 일부분으로 된다 점점 희석 비 활성화 (즉, 비-형광 성) 단위체. 또한, 형광의 피크에 도달 하면 나중: 더 먼 측정된 영역은 위치 photoactivated 지역에서이 지역으로 확산 말라 단위체에 필요한 더 이상 시간. 각 지역에 말라 단위체 침투의 정도 대 한 대표적인 값 형광 고원 도달의 하프 타임을 측정 하 여 파생 될 수 있습니다. 더 먼 지역, 더 오래 걸리는 photoactivated 말라, 그것으로 무마 하 고 따라서 더 많은 시간 필요 도달 될 형광 고원 궁극적으로 더 높은 t1/2 값 (그림 3e)로 이어지는.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg"> 그림 1 : 챔버 어셈블리 및 microinjection 절차를 이미징. (한) 이미징 약 실 구성 요소입니다. (b) 실리콘 그리스는 신중 하 게 플라스틱 마감재의 오프닝의 주위 발 랐 습. (c)는 coverslip 셀-면 열고 이미징 챔버의 중앙에 배치 됩니다. (d)는 보안 물개는 coverslip 위에 플라스틱 날 인자를 배치 하 여 고 사이드 클램프를 강화 하 여 설정 됩니다. (e) 현미경 중간 챔버 슬롯에 pipetted입니다. (f) 이미징 챔버가 현미경 스테이지에 배치, 열 탐지기 및 전극 미리 37 ° C로 설정 하는 난방 장치에 연결 되 고 셀 현미경 시작 하기 전에 적어도 30 분에 대 한 적응을 사용할 수 있습니다. 이 예제에서 현미경 단계 또한 갖춘 한 micromanipulator microinjections, 수행 하 고 microinjection 바늘 이미징 챔버에 셀 레이어를 취재 하는 매체에 담근. (g)는 NIH3T3 fibroblast 세포 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 microinjection 전에 시각 이다. Perinuclear 구획에 적십자 부피가 큰 핵에 가까운 근접 때문에 높은 세포질 영역에 해당 하는 미래 microinjection의 위치를 나타냅니다. (h) 다음 10 분 Rac1와 microinjection, 셀 (녹색 화살표로 표시 됨) 전체 셀 주위 lamellipodia의 저명한 형성에 의해 반응. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg"> 그림 2: FRAP 단백질 회전율 또는 lamellipodial 걸 중 합 속도 결정할 수 있습니다. B16-F1 셀 표시 lamellipodial 지역의 photobleaching 전에 EGFP VASP를 표현 (한) 대표 예. 서로 다른 색된 윤곽 또는 모양 어떤 지역 시간이 지남에 형광 강도 측정을 위한 고려 되었다 나타내는 레이블이 지정 됩니다. 참고 빨간색 윤곽선 레이블 cytosolic 영역 여러 소포 및 셀 표면 주름을 포함 하는 지역에 위치 하는 느낌표와 함께 표시. 이 같은 동적 영역으로 그들은 잠재적으로 부정확 한 결과가 발생 하는 형광의 강한 단기 변동에 의해 특징 이다 형광 참조의 영역을 선택 하는 데 피해 야 한다. (b) Lamellipodial photobleaching 전후 EGFP VASP 표현 세포의 영역입니다. 형광 신호 지역 내에서 photobleaching 자주색으로 표시 된 후의 복구 시간이 지남에 시각 이다. 화살표 걸 필 라 멘 트의 높은 밀도 인해 가능성이 VASP 위한 농축 한 microspike의 끝을 나타냅니다 polymerizing 거기19. (c)는 FRAP의 예를 들어 복구 곡선으로 b 레드 photobleached lamellipodium (보라색 컨투어)의 형광 강도 측정 하는에서 파생 하 고 오른쪽에 녹색 선, 각각, 부동 및 모바일 분수를 나타냅니다. (d) A c (왼쪽된 패널) FRAP 복구 곡선 및 복구 30 시간 (오른쪽 패널)를 파생 하는 데 사용 하는 계산 방법의 예의에 맞게. (e) FRAP 복구의 예 곡선 샘플 인구 내의 가변성의 정도 나타내는 SEM 바 15 셀의 형광 복구 곡선을 평균에서 파생. (f)는 곡선 맞추기 FRAP 복구 곡선 맞는 복구 반 시간 (오른쪽 패널)를 파생 하는 데 사용 하는 계산 방법의 예를 들어 15 셀 (왼쪽된 패널)의 평균에서 파생. (g) lamellipodium lamellipodial 지역의 표백으로 뒤는 lamellipodium에서 형광 복구 시간이 지남에 전후 EGFP 태그 β-걸 표현 B16-f 1 셀의 돌기의 시간 경과 패널. 맨 오른쪽 패널에서 값 돌출에 대 한 측정 및 역행 거리 제공 됩니다 (오렌지와 레드, 각각). 이미지 패널 아래 계산 돌출 및 역행 거리의 합 lamellipodial 말라 네트워크의 중 합 속도 파생 시키는 데 사용 하는 방법 공개. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg"> 그림 3: 의 PA-GFP-말라 단위체 셀 전체 추적에 대 한 Photoactivation. 빨간색 동그라미 (PA)에 표시 된 대로 cytosolic 영역에서 photoactivation를 실행 하기 전에 PA-GFP-걸 표현 B16-f 1 셀의 (a) A 대표적인 예. 서로 다른 색된 윤곽 어느 지역 시간이 지남에 형광 강도 측정을 위한 고려 되었다 나타내는 표시 됩니다. (b) PA-GFP-걸 다음의 시간적 분포의 그림 photoactivation. Photoactivated 걸 멀리 확산으로 photoactivated, cytosolic 영역 (빨간색 동그라미)에 형광의 점진적 감소를 note. 앞을 네트워크에 그들의 보급으로 인해 photoactivated 걸 단위체 lamellipodia (사이안 지역) 및 거리 및 시간에 따라 패션에 cytosol (다른 색으로 구분 된 지역)에 걸쳐 점차적으로 강화 된다. (c) 대표, 일시적인 감소 photoactivated cytosolic 영역 (빨간색 윤곽선 b에서) 형광의. (d) 측 변화 lamellipodial 지역 (시안색 컨투어 b에서) 형광 강도. (e) 형광 강도의 cytosolic 영역 (b에서 색) photoactivation의 지역에서 가변 거리에 위치 때문에 시간적 변화의 대표적인 곡선. 어떻게 반-시간 형광의 고원 참고 (오른쪽에 범례에 표시)의 거리 증가 지역 photoactivation의 영역에, 주어진 증가와 연관 가능성이 시간에 말라 단위체의 보급에 필요한는 해당 지역입니다. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

FRAP 및 광활성화와 같은 미세 조작과 광학 현미경 기술의 조합을 사용하는 전반적인 목표는 뚜렷한 조건 또는 신호 경로 의존적 방식으로 세포골격 조절 및 이동에 관여하는 단백질의 공간측두 역학을 모니터링하는 것입니다. 여기에서 논의된 미세 조작 방법은 모든 유형의 분자를 세포로 직접 전달하고 정의된 세포 내 위치 내에서 단백질 활성을 빛으로 유도하여 조작하는 데 유용합니다. 따라서 여기에 제시된 기술의 주요 장점은 단백질이 세포에 가하는 즉각적인 효과를 결정하고 세포 전체의 이동성을 추적할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시작하기 위해, 이전에 성장시킨 B16-F1 세포를 1-5 비율로 3cm 플라스틱 접시에 계대배양합니다. 세포 배양 배지를 흡인합니다. PBS로 세포를 세척하고 PBS를 흡인하고 트립신 EDTA를 첨가하여 세포를 분리합니다.트립신화된 세포에 세포 배양 배지를 추가합니다. 이 원심분리기를 1000rpm에서 3-5분 동안 동안 재현탁하고 매관으로 세포를 다시 현탁시키고 옮깁니다. B16-F1 세포를 3cm 접시에 넣고 최소 6시간 동안 퍼뜨린 후, 150밀리몰의 염화나트륨을 함유한 용액에 500나노그램의 DNA 구조체와 1마이크로리터의 형질주입 시약의 혼합물을 첨가하여 B16-F1 세포를 형질주입합니다.B16-F1 세포의 경우 150마이크로리터의 라미닌 용액으로 15mm 커버 슬립을 코팅하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. NIH 3T3 세포의 경우 피브로넥틴 용액으로 커버 슬립을 코팅하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 라미닌과 피브로넥틴을 세척하고 PBS로 배양한 커버 슬립을 세척한 다음 PBS를 흡인합니다.NIH 3T3 섬유아세포 2밀리리터를 합류 접시에서 1-20 비율로 피브로넥틴 코팅된 커버 슬립에 파종합니다. 2밀리리터의 형질주입된 B16-F1 세포를 1:30 비율로 라미닌 코팅된 덮개로 피펫을 주입합니다. 그 후, 세포가 라미닌과 피브로넥틴으로 코팅된 커버에 퍼질 수 있도록 하고, 현미경 검사 전에 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 미끄러집니다.셀 면이 위로 향하도록 커버 유리를 열 전도성 RC-26 알루미늄 이미징 챔버에 놓습니다. 그런 다음 커버 유리 위에 플라스틱 실러를 놓아 커버 슬립과 챔버 사이를 단단히 밀봉하고 매체 누출을 방지하기 위해 챔버의 슬라이딩 클램프로 플라스틱 실러를 나사로 고정합니다. 이제 피펫은 섭씨 37도의 피펫으로 현미경 매체를 중앙 영역으로 예열했습니다.챔버의 지정된 슬롯에 열 감지기를 삽입하고 챔버의 전극을 섭씨 324도의 일정한 온도를 유지하는 TC-37B 자동 온도 조절기에 연결합니다. microinjection 모세관에서 존재하는 경우에 바늘 막기로 이끌어 낼 수 있는 단백질 응집체를 제거하기 위하여 10, 적어도 30 분 동안 000G에 이전에 해동된 단백질 해결책을 분리기로 만드십시오. 유연한 피펫 팁을 사용하여 뒷면에서 1마이크로리터의 단백질 용액을 마이크로 주입 바늘에 넣습니다.바늘 끝에 기포가 있으면 바늘 바닥을 가볍게 두드려 제거합니다. 그런 다음 micromanipulation 장치의 바늘 홀더를 조심스럽게 조정합니다. 미세주입 바늘을 바늘 홀더에 조일 때 바늘 끝을 세포 배양 배지에 전배치하기 전에 미세주입 압력 장치를 사용하여 바늘에 압력을 가합니다.다음으로, 저배율 대물렌즈를 사용하여 시야에 바늘을 배치한 다음 관심 세포를 찾고 세포 위로 바늘을 서서히 내립니다. 미세주입의 경우, 세포를 관통하기에 충분하거나 현미경 설정을 매우 부드럽게 두드려 일시적인 막의 파열을 도울 수 있는 세포의 원형질막을 부드럽게 만집니다. 세포로의 흐름이 보이는 즉시 바늘 끝을 배지 안으로 이동하여 주입 과정을 중단합니다.레이저를 트리거하기 전에 GFP 채널로 전환하고 이미지 타임 랩스 획득을 시작하십시오. 그런 다음 view디스플레이를 보는 동안 GFP 채널에서 광표백할 영역을 그립니다. 이미지 획득 시작 후 최소 3-4프레임 후에 405 나노미터 레이저의 수동 트리거로 광표백을 시작합니다.소프트웨어에서 GFP 488 나노미터 이미지 획득을 500밀리초 노출 및 1500밀리초 시간 간격으로 설정합니다. 그런 다음 파장 시리즈를 정사각형으로 표시하고 파장 획득 메뉴에서 원하는 채널 수를 선택하여 듀얼 채널 또는 트리플 채널 타임랩스 동영상을 획득하기 위한 소프트웨어 설정을 조정합니다. 레이저를 트리거하기 전에 이미지 타임랩스 획득을 시작하고 view디스플레이를 보는 동안 위상차 채널에서 광활성화될 영역을 그립니다.그 후, 이미지 획득이 시작된 후 최소 3-4 프레임에서 405 나노 미터 레이저의 수동 트리거에 의해 광 활성화를 시작합니다. FRAP 결과를 분석하려면 VisiView에서 파생된 타임랩스 동영상을 MetaMorph 소프트웨어에서 엽니다. MetaMorph를 사용하여 각 영역을 수동으로 그려 형광 복구의 각 시점에 대한 광표백 영역의 강도 값을 도출합니다.광표백 영역의 전체 또는 일부를 덮는 얇은 층상궁의 끝에 모양을 그리고 필요한 경우 후속 프레임에서 위치를 수동으로 조정하여 전진 팁의 변위 동안 시간이 지남에 따라 각 영역의 층상 강도의 변화를 추적합니다. 배경 보정과 광표백 획득을 위해 각각 세포의 외부와 내부 영역을 분석합니다. 관심 영역이 선택되면 메뉴 측정 영역 측정을 사용하여 MetaMorph에서 해당 강도 값을 추출합니다.Configure 메뉴에서 Lapsed time 및 average intensity 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다. 로그 열기를 클릭하고 동적 데이터 교환을 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 Excel 스프레드시트를 열고 로그 열기 버튼을 다시 클릭하여 MetaMorph 값을 Excel에 붙여넣습니다.MetaMorph에서 파생된 강도 값을 사용하여 적절한 수식이 포함된 Excel 스프레드시트에 강도 값을 붙여넣어 FRAP 형광 회수 곡선을 계산합니다. 광퇴색된 영역의 형광 회복은 배경 및 내부 영역으로 정규화됩니다. 형광 회수의 절반 시간을 계산하기 위해 해당 시간과 함께 형광 회수 곡선 값을 SigmaPlot에 붙여넣은 다음 동적 맞춤 마법사 지수 상승 to maximum 도구를 사용하여 곡선 맞춤을 수행하고 최상의 곡선 맞춤에 따라 모노 또는 이중 지수 함수를 선택합니다.선택한 함수를 해결하여 얻은 매개변수는 각각의 절반 복구 시간을 초 단위로 계산할 수 있는 적절한 공식이 포함된 Excel 스프레드시트에 붙여넣을 수 있습니다. 활성화 시 광활성성 액틴의 확산과 박판과 같은 특정 영역 내에서의 축적을 측정하기 위해 MetaMorph를 사용하여 정규화를 위한 배경 형광을 결정하기 위해 세포 외부뿐만 아니라 각 영역에서의 시간 경과에 따른 강도를 측정합니다. 광활성성 액틴이 활성화 영역에서 멀어지는 정확한 전위 속도 또는 층상 내 통합 속도를 조사하기 위해 이전에 MetaMorph에서 파생된 데이터로부터 형광 곡선을 생성합니다.정규화에 사용되는 배경 영역, 광활성 세포질 영역 또는 조사할 층상 영역에 대한 강도 값을 적절한 공식이 포함된 Excel 스프레드시트에 붙여넣습니다. 소형 GTPase Rac1의 미세주입 전후의 NIH 3T3 섬유아세포 세포의 얼굴 대비 이미지가 여기에 나와 있습니다. 미세주입 후 약 12분이 지나면 세포의 형태가 변하여 성공적인 주입을 나타냅니다.층상족 팁에서 표백되지 않은 분자에 의한 표백된 EGFP VASP의 재활용이 여기에 나와 있습니다. 이 특정 예에서 회수율 형광은 표백 전 형광의 약 80%에서 안정 상태를 유지합니다. 광활성화가 되면 광활성화된 GFP 액틴이 세포질 영역 밖으로 빠르게 확산됩니다.광활성화된 액틴 단량체의 일부가 앞쪽으로 전위되어 층판에서 형광의 빠른 폭발을 생성합니다. 형광의 통합은 광활성화 액틴 단량체의 분획이 세포질을 통한 여정에서 불활성 단량체로 희석되기 때문에 광활성화 영역과 멀리 떨어진 lamellipodia에서 맛있게 더 낮습니다. 광활성 GFP 액틴은 시간이 지남에 따라 광활성화 영역에서 멀어지면서 비광활성 비형광 액틴으로 지속적으로 대체됩니다.결과적으로, 이 영역의 형광 강도가 점진적으로 감소하는 것이 관찰됩니다. 시간이 지남에 따라 세포질 활성화 영역에 가까운 얇은 판족은 빠르게 형광 액틴을 통합합니다. 다음과 같은 형광 감소는 단순히 액틴 해중합 및 단량체 확산이 lamellipodium에서 멀어지기 때문입니다.따라서 단일 현미경 시스템에서 실험을 수행할 때 조사된 단백질의 특성에 따라 미세 주입과 FRAP 또는 광활성화 기술의 조합이 사실적으로 몇 분 만에 수행될 수 있습니다. 미세 조작 전, 도중, 후에 또는 레이저 광에 노출된 후에 자신을 행복하게 유지하는 것을 항상 기억하십시오. FRAP 및 광활성화의 경우 선택한 영역이 영화 상영 시간 동안 구조적 무결성을 유지하는 것이 특히 중요합니다.미세주입 절차는 세포 내 수준에서 주어진 치료의 즉각적인 결과를 해결하기 위해 원형질막 투과성 약물 또는 세포골격 억제제의 국소 적용으로 보완될 수 있습니다. 미세조작 기법은 세포골격 구성 요소 및 복합체의 확산 특성과 세포 내 역학을 탐구하고 세포 형태 형성을 조절하는 간접 경로를 이해할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포질 단백질의 시공간 역학, 세포골격 내부 또는 다른 세포 내 소기관에 상주하는 단백질의 시공간 역학을 추적하고 모니터링하여 궁극적으로 세포 조절의 동역학을 밝히는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 글로벌 또는 지역화된 스트레인 응용 프로그램에 대한 응답으로 하나의 살아있는 자기편 세포에서 유도된 핵 및 cytoskeletal deformations을 측정하기 위해 두 개의 독립적인, 현미경 기반의 도구를 제시한다. 이러한 기술은 핵 강성 (즉, deformability)을 확인하고 핵과 cytoskeleton 세포 사이에 강제로 전송을 탐사하는 데 사용됩니다.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

빛으로 작은 GTPase 활동 spatio-시간적 제어를위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 rapamycin-유도 FKBP-FRB의 heterodimerization 및 사진 caging 시스템을 기반으로합니다. 빛을 조사의 최적화는 subcellular 수준에서 작은 GTPases의 spatio-temporally 제어 활성화를 가능하게합니다.

리빙 셀의 Subcellular 수준과 초 Timescale에 작은 GTPase 활동의 Spatio-시간적 조작

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