Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

FRAP 및 광활성화와 같은 미세 조작과 광학 현미경 기술의 조합을 사용하는 전반적인 목표는 뚜렷한 조건 또는 신호 경로 의존적 방식으로 세포골격 조절 및 이동에 관여하는 단백질의 공간측두 역학을 모니터링하는 것입니다. 여기에서 논의된 미세 조작 방법은 모든 유형의 분자를 세포로 직접 전달하고 정의된 세포 내 위치 내에서 단백질 활성을 빛으로 유도하여 조작하는 데 유용합니다. 따라서 여기에 제시된 기술의 주요 장점은 단백질이 세포에 가하는 즉각적인 효과를 결정하고 세포 전체의 이동성을 추적할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하기 위해, 이전에 성장시킨 B16-F1 세포를 1-5 비율로 3cm 플라스틱 접시에 계대배양합니다. 세포 배양 배지를 흡인합니다. PBS로 세포를 세척하고 PBS를 흡인하고 트립신 EDTA를 첨가하여 세포를 분리합니다.

트립신화된 세포에 세포 배양 배지를 추가합니다. 이 원심분리기를 1000rpm에서 3-5분 동안 동안 재현탁하고 매관으로 세포를 다시 현탁시키고 옮깁니다. B16-F1 세포를 3cm 접시에 넣고 최소 6시간 동안 퍼뜨린 후, 150밀리몰의 염화나트륨을 함유한 용액에 500나노그램의 DNA 구조체와 1마이크로리터의 형질주입 시약의 혼합물을 첨가하여 B16-F1 세포를 형질주입합니다.

B16-F1 세포의 경우 150마이크로리터의 라미닌 용액으로 15mm 커버 슬립을 코팅하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. NIH 3T3 세포의 경우 피브로넥틴 용액으로 커버 슬립을 코팅하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 라미닌과 피브로넥틴을 세척하고 PBS로 배양한 커버 슬립을 세척한 다음 PBS를 흡인합니다.

NIH 3T3 섬유아세포 2밀리리터를 합류 접시에서 1-20 비율로 피브로넥틴 코팅된 커버 슬립에 파종합니다. 2밀리리터의 형질주입된 B16-F1 세포를 1:30 비율로 라미닌 코팅된 덮개로 피펫을 주입합니다. 그 후, 세포가 라미닌과 피브로넥틴으로 코팅된 커버에 퍼질 수 있도록 하고, 현미경 검사 전에 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 미끄러집니다.

셀 면이 위로 향하도록 커버 유리를 열 전도성 RC-26 알루미늄 이미징 챔버에 놓습니다. 그런 다음 커버 유리 위에 플라스틱 실러를 놓아 커버 슬립과 챔버 사이를 단단히 밀봉하고 매체 누출을 방지하기 위해 챔버의 슬라이딩 클램프로 플라스틱 실러를 나사로 고정합니다. 이제 피펫은 섭씨 37도의 피펫으로 현미경 매체를 중앙 영역으로 예열했습니다.

챔버의 지정된 슬롯에 열 감지기를 삽입하고 챔버의 전극을 섭씨 324도의 일정한 온도를 유지하는 TC-37B 자동 온도 조절기에 연결합니다. microinjection 모세관에서 존재하는 경우에 바늘 막기로 이끌어 낼 수 있는 단백질 응집체를 제거하기 위하여 10, 적어도 30 분 동안 000G에 이전에 해동된 단백질 해결책을 분리기로 만드십시오. 유연한 피펫 팁을 사용하여 뒷면에서 1마이크로리터의 단백질 용액을 마이크로 주입 바늘에 넣습니다.

바늘 끝에 기포가 있으면 바늘 바닥을 가볍게 두드려 제거합니다. 그런 다음 micromanipulation 장치의 바늘 홀더를 조심스럽게 조정합니다. 미세주입 바늘을 바늘 홀더에 조일 때 바늘 끝을 세포 배양 배지에 전배치하기 전에 미세주입 압력 장치를 사용하여 바늘에 압력을 가합니다.

다음으로, 저배율 대물렌즈를 사용하여 시야에 바늘을 배치한 다음 관심 세포를 찾고 세포 위로 바늘을 서서히 내립니다. 미세주입의 경우, 세포를 관통하기에 충분하거나 현미경 설정을 매우 부드럽게 두드려 일시적인 막의 파열을 도울 수 있는 세포의 원형질막을 부드럽게 만집니다. 세포로의 흐름이 보이는 즉시 바늘 끝을 배지 안으로 이동하여 주입 과정을 중단합니다.

레이저를 트리거하기 전에 GFP 채널로 전환하고 이미지 타임 랩스 획득을 시작하십시오. 그런 다음 view디스플레이를 보는 동안 GFP 채널에서 광표백할 영역을 그립니다. 이미지 획득 시작 후 최소 3-4프레임 후에 405 나노미터 레이저의 수동 트리거로 광표백을 시작합니다.

소프트웨어에서 GFP 488 나노미터 이미지 획득을 500밀리초 노출 및 1500밀리초 시간 간격으로 설정합니다. 그런 다음 파장 시리즈를 정사각형으로 표시하고 파장 획득 메뉴에서 원하는 채널 수를 선택하여 듀얼 채널 또는 트리플 채널 타임랩스 동영상을 획득하기 위한 소프트웨어 설정을 조정합니다. 레이저를 트리거하기 전에 이미지 타임랩스 획득을 시작하고 view디스플레이를 보는 동안 위상차 채널에서 광활성화될 영역을 그립니다.

그 후, 이미지 획득이 시작된 후 최소 3-4 프레임에서 405 나노 미터 레이저의 수동 트리거에 의해 광 활성화를 시작합니다. FRAP 결과를 분석하려면 VisiView에서 파생된 타임랩스 동영상을 MetaMorph 소프트웨어에서 엽니다. MetaMorph를 사용하여 각 영역을 수동으로 그려 형광 복구의 각 시점에 대한 광표백 영역의 강도 값을 도출합니다.

광표백 영역의 전체 또는 일부를 덮는 얇은 층상궁의 끝에 모양을 그리고 필요한 경우 후속 프레임에서 위치를 수동으로 조정하여 전진 팁의 변위 동안 시간이 지남에 따라 각 영역의 층상 강도의 변화를 추적합니다. 배경 보정과 광표백 획득을 위해 각각 세포의 외부와 내부 영역을 분석합니다. 관심 영역이 선택되면 메뉴 측정 영역 측정을 사용하여 MetaMorph에서 해당 강도 값을 추출합니다.

Configure 메뉴에서 Lapsed time 및 average intensity 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다. 로그 열기를 클릭하고 동적 데이터 교환을 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 Excel 스프레드시트를 열고 로그 열기 버튼을 다시 클릭하여 MetaMorph 값을 Excel에 붙여넣습니다.

MetaMorph에서 파생된 강도 값을 사용하여 적절한 수식이 포함된 Excel 스프레드시트에 강도 값을 붙여넣어 FRAP 형광 회수 곡선을 계산합니다. 광퇴색된 영역의 형광 회복은 배경 및 내부 영역으로 정규화됩니다. 형광 회수의 절반 시간을 계산하기 위해 해당 시간과 함께 형광 회수 곡선 값을 SigmaPlot에 붙여넣은 다음 동적 맞춤 마법사 지수 상승 to maximum 도구를 사용하여 곡선 맞춤을 수행하고 최상의 곡선 맞춤에 따라 모노 또는 이중 지수 함수를 선택합니다.

선택한 함수를 해결하여 얻은 매개변수는 각각의 절반 복구 시간을 초 단위로 계산할 수 있는 적절한 공식이 포함된 Excel 스프레드시트에 붙여넣을 수 있습니다. 활성화 시 광활성성 액틴의 확산과 박판과 같은 특정 영역 내에서의 축적을 측정하기 위해 MetaMorph를 사용하여 정규화를 위한 배경 형광을 결정하기 위해 세포 외부뿐만 아니라 각 영역에서의 시간 경과에 따른 강도를 측정합니다. 광활성성 액틴이 활성화 영역에서 멀어지는 정확한 전위 속도 또는 층상 내 통합 속도를 조사하기 위해 이전에 MetaMorph에서 파생된 데이터로부터 형광 곡선을 생성합니다.

정규화에 사용되는 배경 영역, 광활성 세포질 영역 또는 조사할 층상 영역에 대한 강도 값을 적절한 공식이 포함된 Excel 스프레드시트에 붙여넣습니다. 소형 GTPase Rac1의 미세주입 전후의 NIH 3T3 섬유아세포 세포의 얼굴 대비 이미지가 여기에 나와 있습니다. 미세주입 후 약 12분이 지나면 세포의 형태가 변하여 성공적인 주입을 나타냅니다.

층상족 팁에서 표백되지 않은 분자에 의한 표백된 EGFP VASP의 재활용이 여기에 나와 있습니다. 이 특정 예에서 회수율 형광은 표백 전 형광의 약 80%에서 안정 상태를 유지합니다. 광활성화가 되면 광활성화된 GFP 액틴이 세포질 영역 밖으로 빠르게 확산됩니다.

광활성화된 액틴 단량체의 일부가 앞쪽으로 전위되어 층판에서 형광의 빠른 폭발을 생성합니다. 형광의 통합은 광활성화 액틴 단량체의 분획이 세포질을 통한 여정에서 불활성 단량체로 희석되기 때문에 광활성화 영역과 멀리 떨어진 lamellipodia에서 맛있게 더 낮습니다. 광활성 GFP 액틴은 시간이 지남에 따라 광활성화 영역에서 멀어지면서 비광활성 비형광 액틴으로 지속적으로 대체됩니다.

이 영역의 형광 강도가 점진적으로 감소하는 것이 관찰됩니다. 시간이 지남에 따라 세포질 활성화 영역에 가까운 얇은 판족은 빠르게 형광 액틴을 통합합니다. 다음과 같은 형광 감소는 단순히 액틴 해중합 및 단량체 확산이 lamellipodium에서 멀어지기 때문입니다.

따라서 단일 현미경 시스템에서 실험을 수행할 때 조사된 단백질의 특성에 따라 미세 주입과 FRAP 또는 광활성화 기술의 조합이 사실적으로 몇 분 만에 수행될 수 있습니다. 미세 조작 전, 도중, 후에 또는 레이저 광에 노출된 후에 자신을 행복하게 유지하는 것을 항상 기억하십시오. FRAP 및 광활성화의 경우 선택한 영역이 영화 상영 시간 동안 구조적 무결성을 유지하는 것이 특히 중요합니다.

미세주입 절차는 세포 내 수준에서 주어진 치료의 즉각적인 결과를 해결하기 위해 원형질막 투과성 약물 또는 세포골격 억제제의 국소 적용으로 보완될 수 있습니다. 미세조작 기법은 세포골격 구성 요소 및 복합체의 확산 특성과 세포 내 역학을 탐구하고 세포 형태 형성을 조절하는 간접 경로를 이해할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포질 단백질의 시공간 역학, 세포골격 내부 또는 다른 세포 내 소기관에 상주하는 단백질의 시공간 역학을 추적하고 모니터링하여 궁극적으로 세포 조절의 동역학을 밝히는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.