Name: 효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 학습하세요 293F 세포를 이용한 포유 동물 당단백질 발현 및 단일 단계 정화 방법을 통해 구조 생물학 연구에 적합한 고품질 단백질을 효율적으로 생산하는 기술을 익히세요.

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이 연구는 NIH R01-HL119813(T.J.B.), 미국 폐 협회 RG-196051(T.J.B.), CIMED 파일럿 및 타당성 보조금(T.J.B.), 미국 심장 협회 박사 전 펠로우십 14PRE19970008(Z.Y.) 및 15PRE22110004(D.L.K.)의 지원을 받았습니다.

대규모 과도 형질에 대한 플라스미드 DNA의 밀리그램 수량 1. 생산 <ol><li> 제한 부위 클로닝, 또는 다른 적절한 기술을 사용하여 높은 카피 수 포유 동물 발현 벡터에 목적 단백질을 복제. <ol><li> 최적의 결과를 가지고 pHLsec 7 벡터를 사용하는 내장 된 C- 말단 6His 태그, 강력한 프로모터 코작 순서 및 최적화 분비 신호. </li></ol></li><li> 적격 세포에 플라스미드를 변형. <ol><li> 플라스미드 DNA의 1 μg의 관할에 대장균의 20 μl를 첨가하고 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 42 ℃에서 열 쇼크 셀 35 초 후, 2 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 미생물 성장 매체 (SOC)의 300 μl를 추가하고 220 rpm으로 떨고, 45 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 적절한 항생제 선택과 한천 플레이트에 플레이트 세포. <ol><li> 플라스미드 pHLsec 벡터의 경우 100 μg의 / mL의 카르 베니 실린을 사용하여. </li></ol></li></ol></li><li> 루리아 국물 (LB) 미디어 250 ml의 문화 식민지는 220 rpm으로 흔들어, 37 ° C에서 100 μg의 / ㎖ 항생제 (카르 베니 실린) O / N로 보충. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 고속 플라스미드 맥시 키트를 사용하여 문화의 DNA를 정화. <ol><li> 대신 버퍼 TE의 버퍼 EB (10 mM 트리스 - CL, 산도 8.5)에서 DNA를 용출. </li><li> -20 ° C에서 형질 전환 및 저장에 필요한 양의 정제 된 플라스미드를 나누어지는. </li></ol></li></ol> 293F 세포의 2. 대규모 문화와 과도 형질 <ol><li> 10 글루타민 ㎖의 5 ml의 펜 / 연쇄상 구균 (둘 다 100 배)와 보충 1 L 293F 미디어. 4 ℃에서 보관하십시오. 5 ㎖ 펜 / 스트렙토 단백질 수율을 향상 무 혈청 조건으로 환원 항생제 농도가 형질 중에 세포 생존을 개선에 충분한 강도이다. </li><li> 1 리터의 폴리 카보네이트 300 ml의 미디어 문화 293F 세포는 배출 캡으로 삼각 플라스크를 당황8 % CO 2와 37 ° C에서의 표준 조직 문화 인큐베이터에 떨고있다. </li><li> 세포에 5 × 105 / ㎖ 밀도 형질 전에 하루 희석. </li><li> 293F 세포 미디어 부스트 V / w 2 %의 10 % 부피를 첨가하여 형질 감염, 보충 배지 날. <ol><li> 500 밀리그램 / dL로의 글루코스 농도를 달성하기 위해 필요에 따라 제조자의 지시 및 사용에 따른 보충 글루코스 모니터를 이용하여 글루코스 농도를 측정한다. </li></ol></li><li> 단백질 당화을 제어하는​​이 단계에서 kifunensine (1 μg의 / ml의 최종 농도)를 추가합니다. </li><li> DNA의 계산 볼륨 1 × 10 6 세포 당 1 μg의 플라스미드 필요합니다. 멸균 조건하에, 5 ㎖의 무 혈청 배지에서 희석 DNA. </li><li> 형질 전환 시약 μL 2 당 1 μg의 플라스미드에 필요한 형질 전환 시약의 양을 계산합니다. 멸균 조건하에, 5 ㎖의 무 혈청 배지에서 형질 전환 시약 (PEI-TMC-25)를 희석한다. </li><li> 더하다1 ml의 단위로 DNA 용액으로 형질 전환 시약, 부드럽게 혼합. 형성 시약-DNA 복합체에 대한 RT에서 30 분 동안 배양한다. 이어서 적가 방식으로 셀에 용액을 추가한다. </li><li> 형질 세포는 72-96 시간 동안 단백질을 발현하도록 허용합니다. ~ 10 % 볼륨 셀 부스트 매일 미디어, 또는 필요에 보충은 혈당이 400 ~ 600 밀리그램 / DL을 읽고 유지합니다. </li></ol> 3. 정제 <ol><li> 세포를 펠릿 화하고 상층 액을 수집 1,300 XG에서 20 분 동안 원심 분리기로 원심 분리 플라스크 배양을 경사 분리한다. 필요하다면, 두 번째 회전 및 / 또는 상등액을 명확히 0.22 μm의 필터를 사용한다. </li><li> 10 %의 10 배 부피의 Ni-NTA 추가 결합 완충액 (1.5 M의 NaCl, 0.5 MK 2 HPO 4, 0.1 M 트리스 pH가 8.5, 50 mM의 이미 다졸). </li><li> 열에서의 Ni-NTA 슬러리 2 ㎖를 추가하고 1X 바인딩 버퍼의 10 열 볼륨 (CV)로 평형화하여 중력 열을 준비합니다. 가능하면, 4 ° C를 방에서 모든 열 단계를 수행. Alternativ엘리, 진정 단백질 및 열 단계 전에 얼음에 모든 버퍼 및 단백질을 유지하고 수집 흐름을 통해 얼음에. 주 : 니켈 NTA 슬러리를 50 체적 %의 수지 및 제조의 명시 결합능은 50 ㎎ / ㎖이다. NI-NTA 비드 여러 용도로 재충전 될 수있다 </li><li> 수지 위에 뜨는 흐름과 흐름을 통해 수집합니다. 이 단계를 반복합니다. </li><li> 세척 버퍼의 10 CV로 세척 (300 mM의 염화나트륨, 50 mM의 K 2 HPO 4, 20 mM의 이미 다졸 산도 8). </li><li> 용출 완충제 5 CV로 단백질을 용리 (300 mM의 염화나트륨, 50 mM의 K 2 HPO 4, 250 mM의 이미 다졸의 pH 8). </li><li> 경우 탈 글리코 실화가 필요합니다 : <ol><li> 0.5 ㎖의 최종 부피를 위해, 원심 분리 농축기를 이용하여 0.43 ml의 용출액을 농축시킨다. 양식을 침전 경우, 16,000 XG, 4 ℃에서 원심 분리하여 이물질을 펠렛. </li><li> 500 밀리미터 나 - 구연산 산도 5.5의 50 μl를 추가합니다. </li><li> EndoHf (1 × 106 U / ㎖)의 20 μl를 추가합니다. 2 시간 동안 실온에서 품어. 아니E : 효소는 농축 된 단백질이 응집시킬 수있는, 37 ℃에서 최적으로 작동합니다. SDS-PAGE 또는 면역 탈 글리코 실화에 의해 평가가 불완전한 경우, RT 배양을 연장한다. 효소는 4 ° C에서 활동이 없습니다. </li><li> 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 최종 저장 버퍼에 세척 아밀로스 수지 배 : EndoHf를 제거하십시오. 4 ℃에서 1 시간 동안 수지와 단백질을 품어. 구슬 펠렛 상층 액을 수집하기 위해 1,000 XG에서 5 분 스핀. </li><li> 적절한 분획 분자량 원심 분리 필터를 이용하여 단백질을 농축시키고, 저장 버퍼 (150 mM의 염화나트륨, 20 mM의 HEPES pH를 7.5)로 교환 버퍼. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-host+expression+system+for+recombinant+production+of+challenging+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins.</a> PLoS One. 8, e68674(2013).</li>
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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

HEK 293F 세포는 번역 후 변형을 필요로하는 단백질의 강력한 생산을 제공한다. 이 시스템은 이황화물, 당화, 그렇지 않으면 더 일상적인 표현 도구를 사용하여 결석 것 인산화를 포함 기본적으로 접힌 단백질의 신속하고 확장 가능한 표현을 할 수 있습니다. 또한,이 시스템은 단순히 여러 플라스미드의 공동 형질 감염에 의해 발현 및 다중 단백질 복합체의 정제를 위해 사용될 수있다. TREM2 외에도,이 시스템은 광범위하게 실험실 (10, 11)에 대한 관심이 다른 단백질과 기능 연구에 사용되어왔다. 포유 동물 세포는 또한 생체 내 실험 또는 입체 의존성 항체를 생성하기 위해 기본적으로 접혀 항원의 생산을위한 무 - 엔도톡신 단백질 발현 최적을 제공한다. 최적의 세포 생존하고 형질 감염 조건은 효율적인 단백질 생산을 위해 가장 중요하다. 더 세포 생존을 위해, 낮은 통로 세포 배양 부스팅세포 배양 물을 보충하고 성장 배지에서 항생제 농도가 감소...

원자 수준에서 단백질의 구조를 이해하는 것은 생물학적 경로와 질병의 분자 기반을 폭로의 핵심입니다. X 선 결정학은 단백질 거대 분자의 구조를 결정하기위한 가장 널리 사용 / 적용 가능한 방법이다. 이 방법의 가장 큰 문제는 제대로 접혀, 순수한 단백질의 충분한 양을 얻을 수있다. 특히 특정 번역 후 수정을 거쳐 분비 포유류 단백질, 작업 문제가된다. 세균 발현 단백질은 단백질 데이터 뱅크 1에서 증착 된 결정화 된 단백질의 주요 원이다. 그들은 저렴하고, 빠르고 일반적으로 단백질의 높은 수율을 생산하기 때문에 세균 발현 시스템은 크게 바람직하다. 그러나, 박테리아에서 발현 포유류 단백질의 세포 외 도메인은 종종 제대로 fo를 균일하게 얻기 위해하는 경우 폴딩 및 광범위한 정화 단계가 필요, 접힌되지 않습니다lded 단백질. 또한, 많은 포유류 단백질은 적절한 폴딩 2를 달성하기 위해 번역 후 당화가 필요합니다. 효모 또는 곤충 세포에서의 발현은 글리코 실화 및 접힘 문제를 극복 할 수 있지만, 당화 포함 번역 후 변형은, 부정확 한 또는 불균일 한 변형을 가진 단백질을 수득 포유류 세포 (3)의 것과 크게 다르지. 포유 동물 세포가 적절한 번역 후 변형 및 폴딩을 위해 필요한 모든 분자 기계를 표현; 그러나, 이러한 발현 시스템은 전형적으로 제한 수율 및 시약 및 소모품의 높은 비용, 대부분의 실험실에서 바람직하지 않다. 폴리에틸렌 이민 (PEI)는 표준 트랜 스펙 션 시약을 비교적 염가이지만 상당한 독성, 낮은 형질 감염 효율, 셀 매체, DNA의 비용 상승을 초래하고 장비의 배양을 부과한다. PEI에 많은 대안이 엄청나게 비싸다. 우리는 해결개선 된 세포 배양 용 도구의 조합을 나타내는 화학적, 단일 단계 정제 한 후, 분비 된 포유 동물 단백질의 발현을위한 신속하고 비교적 저렴​​한 방법에 대한 PEI를 수정함으로써 이러한 문제. 이 방법은 강력한 기능, 생화학 적 연구 4 충분한 수율을 제공하고, 어떤 경우에는, 추가의 정제없이 결정화 의무가 단백질을 초래한다. 이 프로토콜은 표현을 극대화하고 정지에서 재배 인간 배아 신장 (HEK)에서 분비 포유류 단백질 293F 세포 산출하기 위해 여러 가지 기술에 대해 설명합니다. 형질 전환 효율 (비용), 단백질 생산 및 정제 모두 크게이 프로토콜에 따라 향상됩니다. 단일 단계의 개환 반응을 통해 카바 메이트의 추가에 의해 변형 된 PEI는 (PEI-TMC-25, REF 5에 상세히 설명 합성 및 특성)을 크게, 트랜 스펙 션 효율을 향상 양이온으로부터 세포 독성을 줄여따라서 막 중단 및 실험 비용을 절감 할 수 있습니다. 또한, 세포 생존 및 단백질 발현이 크게 포도당과 비타민 공급 배양 보조제의 첨가로 향상된다. 중요한 kifunensine와 당화 단백질, 치료의 제조, 만노 I의 비 독성 화학 억제제, 대신에 단일 N 아세틸 글루코사민으로 단백질을 수득 엔도 글리코시다 제의 EndoHf에 의해 제거 될 수있다 정의 미성숙 글리 칸으로 단백질을 생산 전체 길이가 6 글리 칸을 N- 결합. 마지막으로, 혈청, 화학적 매체에 단백질의 분비는 구조적, 생화학 적 연구에 대한 신속하고 손쉬운 정화를 할 수 있습니다. 단일 단계 니켈 니트릴 로트리 아세트산 (NTA 니켈) 수지의 정제는 경우에 따라, 결정화를 위해 충분한 순도의 단백질을 얻을 수 있고, 상징액의 종 및 오염의 대부분을 제거한다.

<table><tbody><tr><td>배양 플라스크</td><td>GeneMate</td><td>F-5909B</td><td></td></tr><tr><td>293 Freestyle Media</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Glutamine</td></tr><tr><td>Hype 5 형질주입 시약</td> 대신 사용 <td>Oz Biosciences</td><td>HY01500</td><td></td></tr><tr><td>293fectin 형질주입 시약</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>12347019</tr><tr><td>PEI 트랜스펙션 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf</td><td>NEB</td><td>P0703L</td><td></td></tr><tr><td>아밀로스 수지</td><td>NEB</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>세포 부스트 R05.2</td><td>HyClone</td><td>SH30584.02</td><td>세포 배양 보충제</td></tr><tr><td>GlucCell</td><td>CESCO Bioengineering</td><td>DG2032</td><td>포도당 모니터링 시스템</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>519850.91</td><td>무혈청 배지 DNA transfection,</td></tr><tr><td>Luria Broth (LB Media),</td> <td>Life Technologies</td><td>10855-001</td><td></td></tr>, <tr><td>GC10, Competent Cells,</td><td>Sigma-Aldrich</td>, <td>G2919</td><td></td></tr></tbody></table>

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

구조 및 생물물리학 연구를 위해 분비된 포유류 단백질을 생산하는 것은 까다롭고 시간이 많이 걸리며 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에는 포유류 세포에서 분비된 단백질 발현과 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용한 1단계 정제를 위한 시간 및 비용 효율적인 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 시스템은 현탁 중인 포유류 세포의 대규모 일시적 transfection을 기반으로 하며, 이는 발현 바이러스 개발 또는 안정적인 발현 세포주 생성과 같은 단계를 제거하므로 단백질 생산 시간을 크게 단축합니다. 이 프로토콜은 간단한 화학적 변형으로 쉽게 만들 수 있는 저렴한 transfection 제제 또는 적당한 가격의 transfection 제제를 사용하여 transfection 효율을 높이고 세포 독성을 줄여 수율을 높입니다. 매체 포도당 수치를 주의 깊게 모니터링하고 유지하면 단백질 수율이 증가합니다. 발현 단계에서 천연 글라이칸의 성숙을 제어하면 적절하게 접힌 기능성 포유류 단백질의 최종 수율이 증가하며, 이는 X선 결정학을 추구하기 위한 이상적인 특성입니다. 일부 경우에서는 단일 단계 정제를 통해 결정화에 충분한 순도의 단백질을 생산할 수 있으며, 이는 여기에 예시로 설명되어 있습니다.

본원에서 골수 세포를 2 (hTREM2 잔사 19부터 1백32까지)에 발현 인간 단백질 트리거링 수용체로부터 분비되는 13 kDa의 면역 글로빈의 (IG)에인가 도메인이 발현 시스템의 결과에 따른다. TREM2 두 개의 이황화 결합 및 N - 결합 글리코 실화 부위를 갖는 단일 IG 세포 외 도메인을 함유하는 I 형 막 횡단 단백질이다. 다른 많은 IG 도메인 단백질 (8)과는 달리, TREM2 세균 봉입체 (9)에서 접힘 의무가 아니 었습니다. 이후의 돌연변이 유발 확인 N 연결 글리 칸은 적절한 표현과 폴딩이 필요합니다. 구조적 및 기능적 연구를 용이하게하기 위해, TREM2는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 C 말단 6His 태그 7 pHLsec 벡터에 도입 하였다. kifunensine 처리 HEK293F 세포에서의 일시적인 발현은 (도 1b, 레인 2)의 Ni-NTA 크로마토 그래피에 의해 정제 된 단백질을 수득하고 샘플을 생성...

이것은 분비된 당화(glycosylated mammalian protein)의 생산 및 X선 결정학 및 기타 생물물리학 연구를 위한 균질한 단백질의 충분한 수율을 가진 후속 1단계 정제를 위한 빠르고 비용 효율적인 프로토콜입니다.

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

이 포유류 단백질 발현 기술의 전반적인 목표는 구조적, 생물물리학적 및 기능적 연구에 적합하도록 천연 상태로 접힌 단백질을 밀리그램 단위로 생산하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 분비성 포유류 단백질을 얻고 구조 연구에 필요한 순도와 농도를 확보할 수 있는 빠르고 간단한 프로토콜이라는 점입니다. 일반적으로 단백질 수율과 관련된 대부분의 문제는 세포의 건강 상태 및 생존력에 기인하는 것으로 확인되었습니다.세포 생존율과 배지의 당 수치를 면밀히 모니터링함으로써 단백질 수율을 크게 높이고 세포의 유효 기간을 연장할 수 있습니다. 세포 밀도를 모니터링하는 것 또한 매우 중요합니다. transfection 이전 어느 시점에서든 세포 밀도가 mL당 2백만 개를 초과하면 단백질 수율이 크게 감소하는 것으로 나타났습니다. 293F 세포를 대량 배양하려면 293F 배지 1L에 100x glutamine 10mL와 100x pen strep 5mL를 첨가하십시오.항생제는 무혈청 조건에서 충분한 농도로 유지되며, 항생제 농도를 낮추면 형질전환 중 세포 생존율이 향상되어 단백질 수득률이 높아집니다. 형질전환 하루 전, 표준 조직 배양 인큐베이터 내 37 °C, 8% CO₂ 조건에서 1 L 폴리카보네이트 배플 에를렌마이어 플라스크(통기성 캡 사용)에 300 mL 배지를 넣고 2 93 F 세포를 배양합니다. 형질전환 당일에 세포 밀도를 0.5 million cells/mL로 희석합니다. 2 93 F 배지에 2% w/v cell boost를 10% v/v 비율로 첨가하여 배양 배지를 보충합니다.단백질 당화(glycosylation)를 제어하기 위해 이 단계에서 kafu를 첨가하십시오. 무혈청 배지에서 DNA 및 transfection 시약 용액을 준비하고 5분 동안 배양하십시오. 그 다음, transfection 시약을 DNA 용액에 1 mL씩 나누어 넣으며 혼합하십시오.시약-DNA 복합체가 형성되도록 실온에서 30분 동안 부드럽게 배양합니다. 그런 다음 용액을 세포에 한 방울씩 첨가하고, 당단백질을 정제하기 위해 형질전환된 세포가 72~96시간 동안 단백질을 발현하도록 둡니다. 먼저 배양액을 원심분리 플라스크에 붓고 1300 Gs에서 20분 동안 원심분리합니다. 세포를 펠렛화한 후 상층액을 수집하고, 필요한 경우 다시 한번 원심분리하거나 0.22 micron 필터를 사용하여 상층액을 투명하게 만듭니다.다음으로, 10 x nickel nitro load, tri acetic acid 또는 nickel NTA 결합 버퍼를 부피의 10%만큼 첨가합니다. 그런 다음, 컬럼에 nickel NTA 슬러리 2 mL를 넣고 4 °C에서 1 x 결합 버퍼 10 컬럼 부피로 평형화하여 4 °C에서 중력 컬럼을 준비합니다. 상층액을 수지로 흘려보내고 통과액을 수집합니다.상층액을 컬럼에 통과시킨 후, 세척 완충액 10 컬럼 부피(column volumes)로 컬럼을 세척합니다. 그다음 용출 완충액 5 컬럼 부피로 단백질을 용출합니다. 최종 부피 0.5 mL에 대한 탈당쇄화(deglycosylation)가 필요한 경우, 원심분리 농축기를 사용하여 EIT를 0.43 mL로 농축하고, 16,000 g, 4 °C 조건에서 원심분리하여 모든 찌꺼기를 펠릿화합니다.그 후 pH 5.5의 500 millimolar sodium citrate 50 µL와 endo hf 20 µL를 첨가합니다. endo HF를 제거하기 위해 혼합물을 상온에서 2시간 동안 배양합니다. 먼저 phosphate buffered saline으로 amylose resin을 3회 세척합니다. 세척된 resin과 단백질을 4 °C에서 1시간 동안 배양합니다.배양 후, 1000 Gs에서 5분 동안 원심분리하여 레진을 침전시키고 상층액을 수집합니다. 적절한 분자량 컷오프, 원심분리 필터를 사용하여 단백질을 농축하고, 제시된 보관 완충액으로 완충액 교환을 수행합니다. 다음은 니켈 친화성 크로마토그래피 이후 cine 처리 세포에서 발현된 분비 단백질의 대표적인 SDS page 결과입니다.첫 번째 레인은 탈당쇄화 전의 단백질이며, 두 번째 레인은 endo hf에 의한 탈당쇄화 후의 단백질입니다. 당쇄화된 단백질은 약 10 kilodaltons 더 높게 이동하며, 단일 정제 단계 후 탈당쇄화를 거치면 예측 분자량과 일치하는 단일 밴드로 응축됩니다. 결정 스크리닝은 hanging drop법을 사용하여 설정되었습니다.위쪽 이미지는 초기 결정 히트를 보여주며, 아래쪽 이미지는 최적화된 결정화 조건을 보여줍니다. 이는 표적 단백질의 생화학적 균질성이 결정화 성공의 결정적인 요인이 될 수 있으며, 최적화된 포유류 발현 시스템이 이러한 결정화에 적합한 단백질을 생성한다는 것을 입증합니다. 니켈 정제된 단백질의 추가 정제는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 용이하게 수행할 수 있습니다.이는 단백질 생산을 평가하고 적절하게 접힌 단백질을 얻기 위해 조건을 최적화하는 데에도 유용한 단계입니다. 목적 단백질은 크로마토그래피 용출물의 주요 성분이어야 하며, 용출 부피는 단백질의 분자량과 일치해야 합니다. 예상보다 빠른 용출 시간은 단백질의 응집 또는 미스폴딩을 시사할 수 있습니다. 숙련된 후에는.이 기술은 적절히 수행될 경우 4일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 세포 배양을 위한 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 단백질의 올리고머화 상태와 열적 안정성을 평가하기 위해 크기 배제 크로마토그래피, 다각도 광산란 및 차등 주사로리메트리와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

포유류 시스템에 의한 재조합 단백질의 발현은 구조 생물학을 위한 단백질 복합체를 생산하는 매력적인 방법이 되고 있습니다. 여기에서 우리는 구조 연구를 위해 단백질 복합체를 정제하기 위해 현탁액 성장 포유류 세포를 사용하는 간단하면서도 매우 효율적인 발현 시스템을 제시합니다.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

징크 핑거 도메인은 본질적으로 세포 투과성 및 포유 동물 세포 유형 내로 다양한 단백질 전달을 매개 할 수있다. 여기서, 단백질의 세포 내 전달을위한 아연 핑거 기술을 구현하기위한 상세한 단계별 프로토콜이 제시된다.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

여기에서는 순수하고 완전히 글리코실화되었으며 효소 활성 프로테아제를 높은 수율로 생산하는 HEK293T 세포를 사용하는 비용 효율적인 그랜자임 발현 시스템을 설명합니다.

포유 동물 세포에서 인간의 Granzymes의 높은 수율과 비용 효율적인 발현 시스템

적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

우리 면역 글로불린 겹 biolayer 간섭계, 등온선 적정 열 량, 및 x-선 결정학에 의해 glycoproteins의 생물 및 구조적 특성에 대 한 접근 방법 제시.

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

이온 채널의 정화는 종종 도전, 하지만 일단 달성, 그것은 잠재적으로 수 체 외에서 조사 기능 및 채널의 구조. 여기, 표현과 포유류 bestrophin 단백질, 캘리포니아2 +의 가족의 정화에 대 한 단계적 절차 설명-Cl- 채널을 활성화.

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

이 프로토콜은 스테롤 수송체 ABCG5/G8의 결정화를 위한 설정을 설명합니다. ABCG5/G8은 행잉 드롭 결정화를 위해 이셀로 재구성됩니다. 이 프로토콜은 특수 재료나 기질이 필요하지 않으므로 X선 결정학을 통해 단백질 구조를 결정하기 위한 모든 실험실에서 쉽게 접근할 수 있고 적용할 수 있습니다.

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

학습하세요 293F 세포를 이용한 포유 동물 당단백질 발현 및 단일 단계 정화 방법을 통해 구조 생물학 연구에 적합한 고품질 단백질을 효율적으로 생산하는 기술을 익히세요.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

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