효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

이 포유류 단백질 발현 기술의 전반적인 목표는 구조적, 생물물리학적 및 기능적 연구에 적합하도록 천연 상태로 접힌 단백질을 밀리그램 단위로 생산하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 분비성 포유류 단백질을 얻고 구조 연구에 필요한 순도와 농도를 확보할 수 있는 빠르고 간단한 프로토콜이라는 점입니다. 일반적으로 단백질 수율과 관련된 대부분의 문제는 세포의 건강 상태 및 생존력에 기인하는 것으로 확인되었습니다.

세포 생존율과 배지의 당 수치를 면밀히 모니터링함으로써 단백질 수율을 크게 높이고 세포의 유효 기간을 연장할 수 있습니다. 세포 밀도를 모니터링하는 것 또한 매우 중요합니다. transfection 이전 어느 시점에서든 세포 밀도가 mL당 2백만 개를 초과하면 단백질 수율이 크게 감소하는 것으로 나타났습니다. 293F 세포를 대량 배양하려면 293F 배지 1L에 100x glutamine 10mL와 100x pen strep 5mL를 첨가하십시오.

항생제는 무혈청 조건에서 충분한 농도로 유지되며, 항생제 농도를 낮추면 형질전환 중 세포 생존율이 향상되어 단백질 수득률이 높아집니다. 형질전환 하루 전, 표준 조직 배양 인큐베이터 내 37 °C, 8% CO₂ 조건에서 1 L 폴리카보네이트 배플 에를렌마이어 플라스크(통기성 캡 사용)에 300 mL 배지를 넣고 2 93 F 세포를 배양합니다. 형질전환 당일에 세포 밀도를 0.5 million cells/mL로 희석합니다. 2 93 F 배지에 2% w/v cell boost를 10% v/v 비율로 첨가하여 배양 배지를 보충합니다.

단백질 당화(glycosylation)를 제어하기 위해 이 단계에서 kafu를 첨가하십시오. 무혈청 배지에서 DNA 및 transfection 시약 용액을 준비하고 5분 동안 배양하십시오. 그 다음, transfection 시약을 DNA 용액에 1 mL씩 나누어 넣으며 혼합하십시오.

시약-DNA 복합체가 형성되도록 실온에서 30분 동안 부드럽게 배양합니다. 그런 다음 용액을 세포에 한 방울씩 첨가하고, 당단백질을 정제하기 위해 형질전환된 세포가 72~96시간 동안 단백질을 발현하도록 둡니다. 먼저 배양액을 원심분리 플라스크에 붓고 1300 Gs에서 20분 동안 원심분리합니다. 세포를 펠렛화한 후 상층액을 수집하고, 필요한 경우 다시 한번 원심분리하거나 0.22 micron 필터를 사용하여 상층액을 투명하게 만듭니다.

다음으로, 10 x nickel nitro load, tri acetic acid 또는 nickel NTA 결합 버퍼를 부피의 10%만큼 첨가합니다. 그런 다음, 컬럼에 nickel NTA 슬러리 2 mL를 넣고 4 °C에서 1 x 결합 버퍼 10 컬럼 부피로 평형화하여 4 °C에서 중력 컬럼을 준비합니다. 상층액을 수지로 흘려보내고 통과액을 수집합니다.

상층액을 컬럼에 통과시킨 후, 세척 완충액 10 컬럼 부피(column volumes)로 컬럼을 세척합니다. 그다음 용출 완충액 5 컬럼 부피로 단백질을 용출합니다. 최종 부피 0.5 mL에 대한 탈당쇄화(deglycosylation)가 필요한 경우, 원심분리 농축기를 사용하여 EIT를 0.43 mL로 농축하고, 16,000 g, 4 °C 조건에서 원심분리하여 모든 찌꺼기를 펠릿화합니다.

그 후 pH 5.5의 500 millimolar sodium citrate 50 µL와 endo hf 20 µL를 첨가합니다. endo HF를 제거하기 위해 혼합물을 상온에서 2시간 동안 배양합니다. 먼저 phosphate buffered saline으로 amylose resin을 3회 세척합니다. 세척된 resin과 단백질을 4 °C에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후, 1000 Gs에서 5분 동안 원심분리하여 레진을 침전시키고 상층액을 수집합니다. 적절한 분자량 컷오프, 원심분리 필터를 사용하여 단백질을 농축하고, 제시된 보관 완충액으로 완충액 교환을 수행합니다. 다음은 니켈 친화성 크로마토그래피 이후 cine 처리 세포에서 발현된 분비 단백질의 대표적인 SDS page 결과입니다.

첫 번째 레인은 탈당쇄화 전의 단백질이며, 두 번째 레인은 endo hf에 의한 탈당쇄화 후의 단백질입니다. 당쇄화된 단백질은 약 10 kilodaltons 더 높게 이동하며, 단일 정제 단계 후 탈당쇄화를 거치면 예측 분자량과 일치하는 단일 밴드로 응축됩니다. 결정 스크리닝은 hanging drop법을 사용하여 설정되었습니다.

위쪽 이미지는 초기 결정 히트를 보여주며, 아래쪽 이미지는 최적화된 결정화 조건을 보여줍니다. 이는 표적 단백질의 생화학적 균질성이 결정화 성공의 결정적인 요인이 될 수 있으며, 최적화된 포유류 발현 시스템이 이러한 결정화에 적합한 단백질을 생성한다는 것을 입증합니다. 니켈 정제된 단백질의 추가 정제는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 용이하게 수행할 수 있습니다.

이는 단백질 생산을 평가하고 적절하게 접힌 단백질을 얻기 위해 조건을 최적화하는 데에도 유용한 단계입니다. 목적 단백질은 크로마토그래피 용출물의 주요 성분이어야 하며, 용출 부피는 단백질의 분자량과 일치해야 합니다. 예상보다 빠른 용출 시간은 단백질의 응집 또는 미스폴딩을 시사할 수 있습니다. 숙련된 후에는.

이 기술은 적절히 수행될 경우 4일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 세포 배양을 위한 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 단백질의 올리고머화 상태와 열적 안정성을 평가하기 위해 크기 배제 크로마토그래피, 다각도 광산란 및 차등 주사로리메트리와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.