효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

이 포유류 단백질 발현 기술의 전반적인 목표는 구조적, 생물물리학적, 기능적 연구에 적합한 네이티브하게 접힌 단백질을 밀리그램 단위로 생산하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 분비된 포유류 단백질과 구조 연구에 필요한 순도 농도를 얻기 위한 빠르고 간단한 프로토콜이라는 것입니다. 일반적으로 단백질 수율과 관련된 대부분의 문제는 세포 건강과 생존력에 기인합니다.

세포 생존율을 면밀히 모니터링하고 배지 당 수치를 모니터링함으로써 단백질 수율을 크게 개선하고 세포의 유용성을 연장할 수 있습니다. 세포 밀도를 모니터링하는 것도 매우 중요합니다. transfection 전 언제든지 세포가 밀리리터당 200만 개의 세포를 초과하면 단백질 수율이 크게 감소한다는 것을 발견했습니다.2 93 F 세포의 대규모 배양을 수행하기 위해 2 93 F 배지 1리터에 100 x 글루타민 10ml와 100 x 펜 연쇄상구균 5ml를 보충합니다.

항생제는 무혈청 조건에서 충분한 강도를 유지하며 감소된 항생제 농도는 transfection 중 세포 생존력을 향상시켜 단백질 수율 배양을 향상시킵니다. 1리터의 배지 300밀리리터에 있는 2개의 93 F 세포는 8%의 이산화탄소가 함유된 섭씨 37도의 벤트 캡이 있는 삼각 플라스크를 당황하게 만든 동시에 형질주입 하루 전에 표준 조직 배양 인큐베이터에서 진탕하여 형질주입 당일 1밀리리터당 50만 개의 세포 밀도로 세포를 희석합니다. 2 93 F 배지에 부피 세포 부스트당 2% 중량의 10% 부피를 추가하여 배양 배지를 보충합니다.

단백질 당화(glycosylation)를 조절하기 위해 이 단계에서 볼 수 있는 카푸(kafu)를 첨가합니다. DNA 및 transfection 시약 용액을 무혈청 배지에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, transfection 시약을 1ml 단위로 DNA 용액에 첨가합니다.

시약 DNA 복합체가 형성될 때까지 실온에서 30분 동안 부드럽게 배양합니다. 그런 다음 용액을 세포에 적가형으로 첨가하여 형질주입된 세포가 72-96시간 동안 단백질을 발현하여 당단백질을 정제하도록 합니다. 먼저 배양액을 원심분리기 플라스크 원심분리기에 1300 Gs.To 20분 동안 디캔팅하여 세포를 펠릿화하고 상층액을 채취한 후 필요한 경우 두 번째 회전 및/또는 0.22미크론 필터를 사용하여 상층액을 정화합니다.

다음으로, 10 x 니켈 니트로 부하, 삼초산 또는 니켈 NTA 결합 버퍼의 10 % 부피를 추가합니다. 그런 다음 컬럼에 2밀리리터의 니켈 NTA 슬러리를 추가하고 섭씨 4도에서 작동하는 1개의 x 결합 버퍼의 10 컬럼 부피와 평형을 이루어 섭씨 4도의 중력 컬럼을 준비합니다. 상등액을 수지 위로 흐르게 하고 흐름을 통해 수집합니다.

상등액을 컬럼 위로 부은 후 10 컬럼 부피의 세척 버퍼로 세척합니다. 그런 다음 5개 컬럼 부피의 용리 완충액으로 단백질을 용리시킵니다. 0.5 밀리리터의 최종 부피에 대해 탈당화가 필요한 경우, 16, 000 GS 및 섭씨 4도에서 원심분리를 통해 파편을 펠릿으로 분쇄하여 EIT를 0.43 밀리리터로 농축합니다.

그런 다음 50 마이크로 리터의 500 밀리 몰 시트르산 나트륨, pH 5.5 및 20 마이크로 리터의 엔도 hf를 추가합니다.혼합물을 실온에서 2 시간 동안 배양하여 인산염 완충 식염수에서 엔도 HF 1 차 세척 아밀로스 수지를 3 회 제거합니다. 세척된 수지와 함께 단백질을 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후 1000Gs에서 5분 동안 회전하여 수지를 펠릿화하고 상층액을 수집합니다. 적절한 분자량 컷오프, 원심분리 필터 및 표시된 저장 완충액으로의 완충액 교환을 사용하여 단백질을 농축합니다. 다음은 니켈 친화성 크로마토그래피 후 cine 처리된 세포에서 발현된 분비 단백질에 대한 대표적인 SDS 페이지 결과입니다.

첫 번째 lane은 deglycosylation 전의 단백질이고, 두 번째 lane은 endo hf에 의한 deglycosylation 이후의 단백질입니다. 당화(glycosylated protein)는 약 10킬로달톤(kilodalton) 더 높게 실행된 다음 단일 정제 단계에 따라 탈당화(deglycosylation) 후 예측된 분자량과 일치하는 단일 띠로 붕괴됩니다. 크리스탈 스크린은 행잉 드롭 방법을 사용하여 설정되었습니다.

상단 이미지는 초기 결정 히트를 보여주고 하단 이미지는 최적화된 결정화 조건을 보여줍니다. 이는 관심 단백질의 생화학적 균질성이 결정화 성공의 결정적 요인이 될 수 있으며, 최적화된 포유류 발현 시스템이 이러한 결정화에 적합한 단백질을 생성한다는 것을 보여줍니다. 니켈 정제 단백질의 추가 정제는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 쉽게 수행됩니다.

이는 또한 단백질 생산을 평가하고 적절하게 접힌 단백질을 생성하기 위해 조건을 최적화하는 데 유용한 단계입니다. 관심 단백질은 크로마토그래피 용리의 주요 종이어야 하며, 용리 부피는 단백질의 분자량과 일치해야 합니다. 이전. EEU 시간은 일단 마스터된 단백질의 응집 또는 잘못 접힘을 암시할 수 있습니다.

이 기술은 적절하게 수행하면 4일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 세포 배양을 위한 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따릅니다. 단백질의 올리화(oli-ization) 상태와 열적 안정성을 평가하기 위해 크기, 배제 크로마토그래피, 다각도 광 산란 및 시차 스캐닝, 형광 측정법과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.