정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

이 미세 중화 분석의 전반적인 목표는 현재 순환하는 모든 유형의 인플루엔자 바이러스와 항체 및 항바이러스 측정의 활성을 정량적이고 처리량이 많으며 매우 민감한 방식으로 특성화하는 것입니다. 이 방법은 인플루엔자 바이러스의 항원 특성화, 항체의 정량적 중화 및 항바이러스 활성과 같은 바이러스학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 눈에 보이는 플라크와 보이지 않는 플라크, 단세포 감염을 포함한 전체 감염된 세포 집단을 특성화한다는 것입니다.

미세 중화 분석법은 런던에 있는 WHO 인플루엔자 협력 센터의 부소장인 Yipu Lin 박사가 시연할 예정입니다. 다음 프로토콜에 대한 생물 안전성 수준 또는 BSL은 계절성 인플루엔자 바이러스의 경우 BSL 2이고 잠재적인 유행성 인플루엔자 바이러스의 경우 BSL 3+입니다. 시작하려면 충분한 세포를 96웰 플레이트로 분취합니다.

세포를 섭씨 37도, 5%CO2에서 2-3일 동안 배양하여 합류점에 도달합니다. 70% 에탄올을 사용하여 멀티웰 플레이트 세척기를 살균하고 PBS 또는 VGM을 사용하여 헹굽니다. 그런 다음 200마이크로리터의 바이러스 성장 배지(VGM)를 사용하여 합류 세포를 세척합니다.

세포에서 VGM을 흡인하고 즉시 각 웰에 50마이크로리터의 VGM을 추가합니다. 다음으로, 6개의 멸균 튜브 각각에 900마이크로리터의 VGM을 추가합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 바이러스를 첫 번째 튜브에 피펫으로 넣고 잘 섞습니다.

첫 번째 튜브부터 시작하여 바이러스의 연속 희석을 준비하고 각 희석 사이의 팁을 변경합니다. 가장 높은 희석액부터 시작하여 각 바이러스 희석액을 50마이크로리터씩 추가하여 96웰 플레이트의 웰을 복제합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 2-3시간 동안 놓아 바이러스가 세포를 감염시킬 수 있도록 합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 오버레이를 준비한 후 웰에서 접종물을 제거합니다. 그런 다음 각 웰에 200마이크로리터의 오버레이를 추가하고 섭씨 37도에서 밤새 방해받지 않고 배양합니다. PBS A에 담긴 얼음처럼 차가운 4%PFA 200마이크로리터를 웰에 넣고 섭씨 4도에서 30분 또는 실온에서 20분 동안 배양합니다.

배양 후 PFA를 흡입하고 PBS A 웰당 200마이크로리터를 사용하여 플레이트를 두 번 세척합니다. 플레이트에 100마이크로리터의 투과화 완충액을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS A를 사용하여 접시를 두 번 씻습니다.

다음으로, 인플루엔자 A형에 대한 마우스 단클론 항체 웰당 50마이크로리터를 웰에 추가하고 실온에서 1시간 동안 흔들면서 배양합니다. 배양 후 300마이크로리터의 세척 완충액을 사용하여 우물을 세 번 세척합니다. 그런 다음 HRP 접합 염소 2차 항체 50마이크로리터를 샘플에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

이전과 같이 웰을 3 회 세척 한 후 웰 당 50 마이크로 리터의 기질을 추가하고 실온에서 30 분 동안 또는 파란색의 발달이 명확하게 보일 때까지 배양합니다. 반응을 멈추려면 200마이크로리터의 증류수를 사용하여 우물을 두 번 씻으십시오. 그런 다음 플레이트를 자연 건조시킨 후 어두운 곳에 보관하십시오.

평판 스캐너의 스캔 영역에 웰 플레이트를 배치하고 L자형 위치 제한을 사용하여 최적의 반복 가능한 이미징 위치를 얻을 수 있도록 합니다. 여기에 표시된 설정을 사용하여 플레이트를 스캔합니다. 그런 다음 웰 플레이트 리더 소프트웨어를 실행하고 Load Image(이미지 로드) 버튼을 클릭하여 이미지를 로드함으로써 필요한 바이러스 농도를 계산합니다.

다음으로, Global Threshold(전역 임계값) 탭에서 히스토그램의 빨간색 막대를 밀어 샘플링 임계값을 조정합니다. 그런 다음 업데이트 버튼을 클릭하여 이미지에 미치는 영향을 검토합니다. 이제 Calculate Neutralization/Titration(중화/적정 계산) 상자를 선택합니다.

샘플링(Sampling) 버튼을 클릭하여 감염된 세포 집단 또는 ICP를 정량화합니다. 그런 다음 메시지가 표시되면 저장 버튼을 클릭하여 샘플링 결과를 저장합니다. 적정 결과를 얻으려면 웰 플레이트 정의 맵을 로드하거나 입력하십시오.

In Titration:Optimal Virus Population 임계값을 나타냅니다. Titration Process 탭을 선택하여 적정 결과를 계산합니다. 그런 다음 Save and Close 버튼을 클릭하여 결과를 저장하기 전에 적정 결과를 확인하십시오.

소프트웨어에 대한 자세한 지침은 부록 S1을 참조하십시오. 바이러스 중화를 수행하려면 2-3일 전에 세포 단층을 준비하십시오. 그런 다음 플레이트의 각 웰에 50마이크로리터의 VGM을 추가합니다.

11열과 12열은 각각 바이러스 제어와 세포 제어를 위해 사용합니다. 수용체 파괴 효소(RDE) 처리 혈청의 1/20 희석액 50마이크로리터 분취액을 1열에서 10열의 첫 번째 줄에 추가합니다. A행에서 H행으로 50마이크로리터를 옮기고 H행에서 50마이크로리터를 버리는 방식으로 2배 연속 희석을 수행합니다. 그런 다음 세포 제어 컬럼의 각 웰에 50마이크로리터의 희석제를 추가합니다.

세포 조절 컬럼을 제외한 플레이트의 각 웰에 50마이크로리터의 바이러스를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 2-3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 접종물을 제거하고 각 웰에 오버레이를 추가합니다.

섭씨 37도에서 밤새 방해받지 않고 접시를 배양하십시오. 그런 다음 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 플레이트를 고정하고 염색합니다. 중화를 정량화하려면 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 평판 스캐너의 스캐닝 영역에 웰 플레이트를 놓습니다.

플레이트를 스캔하고 웰 플레이트 리더 소프트웨어를 실행하여 이전과 같이 필요한 바이러스 역가를 계산합니다. 웰 플레이트 맵을 로드하거나 입력한 후 Neutralization:Infection Deduction에서 임계값을 표시합니다. 그런 다음 Neutralization Process를 선택하여 역가를 계산합니다.

마지막으로 역가를 확인하고 저장 및 닫기 버튼을 클릭하여 중화 결과를 저장합니다. 여기에 표시된 것은 8개의 입력 바이러스에 대한 최근 항원 특성화 실험의 적정 결과이며, 희석량은 1.0 곱하기 10에서 음성 1 사이, 1.0 곱하기 10에서 음성 6 사이입니다. 이 그래프는 바이러스 희석이 증가함에 따라 ICP가 감소한다는 것을 보여줍니다.

곡선은 웰 내의 모든 세포에서 감염을 일으킨 동일한 바이러스의 ICP에 대해 정규화되었습니다. 이 표에는 중화를 위한 입력 바이러스 희석액으로 선택된 ICP 포화도의 30%를 생성한 바이러스 희석액이 나열되어 있습니다. 이 그림은 5개의 안티혈청에 대해 하나의 입력 바이러스를 사용한 중화 실험의 결과를 보여줍니다.

그래프는 혈청 희석의 증가에 따른 감염 과정을 보여줍니다. 세로축의 정규화된 양성 모집단은 reference 바이러스의 평균 ICP에 대한 해당 antisera 반응의 ICP 비율을 나타냅니다. 마지막으로, 중화 역가는 50% ICP 감소에 해당하는 항혈청 희석액의 역수로 결정되었습니다.

이 분석은 입력 바이러스의 정량 적정, 고처리량 이미징 및 데이터 처리를 포함하여 일관성, 속도 및 검출 감도에 중점을 둡니다. 비용 효율적이고 사용자 친화적이며 바이러스 항원 연구에 일상적으로 사용되었습니다.