Name: 정량적 마이크로 중화 분석의 최적화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 학습하세요 정량적 마이크로 중화 분석법을 통해 인플루엔자 바이러스의 항원적 특성과 항체 중화 능력을 고감도로 측정하는 방법을. 이 기술은 바이러스학 연구에서 감염 세포 전체를 정량화하여 항바이러스 활성을 평가하는 데 활용됩니다.

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저자는 모 MDCK 및 MDCK-SIAT1 세포주를 제공한 M. Matrosovich 박사와 오셀타미비르 카르복실레이트를 제공한 Roche Pharmaceuticals에 감사를 표합니다. 또한 원고에 대한 귀중한 제안을 해주신 Anne Weston 박사님께도 감사드립니다. 이 연구는 사용된 인플루엔자 바이러스를 제공한 WHO 국립 인플루엔자 센터와 WHO GISRS 내 WHO CC의 소중한 협력에 의존했습니다. 이 연구는 프로그램 U117512723를 통해 의학 연구 위원회(Medical Research Council)의 자금 지원을 받았습니다.

참고 : 다음 프로토콜에 대한 바이오 안전성 수준 (BSL)은 잠재적 인 유행성 독감 바이러스에 대한 계절 인플루엔자 바이러스 및 BSL 3+위한 BSL 2입니다. 바이러스 적정 바이러스 제어 (VC)의 바이러스 농도를 결정하기 위해 중화 실험에 앞서 요구된다. 1. 바이러스 적정 주 : (1) 바이러스 희석 행 또는 열 (도 1) 중 하나를 따라 배치 될 수 바이러스의 수와 중복 수에 따라이 잘 플레이트는 다음의 유연성으로 설정 될 수있다. 각각의 바이러스는 별도의 행 / 열을 차지한다. (2) 바이러스 희석 증가는 유연하지만, 왼쪽 상단에서 가장 높은 바이러스 농도로 시작한다. (3)의 중복의 개수에는 제한이 없다. 참고 : Madin 다비 개 신장 (MDCK) 및 MDCK-SIAT1 (SIAT) 세포는 친절 박사 M. Matrosovich, 마르부르크, 게르에 의해 제공되었다10 많은. SIAT 세포는 안정적으로 인간의 CMP-N-acetylneuraminate로 형질 MDCK 세포이다 : 시알 산 (SA)의 강화 된 표현을위한 β - 갈 락토의 α-2,6- 시알 산 전이 효소 유전자 α2-6Gal 종료 올리고당. <ol><li> 분취 충분한 MDCK 세포 또는 MDCK 세포 SIAT-8 96 웰 플레이트에 (/ 웰 200 μL). 합류점에 도달하는 2 또는 3 일 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FCS) 및 항생제 (100 U / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신 100 μg의)이 보충 된 DMEM에서 세포를 전파. 5 % CO 2 및 1 ㎎ / ㎖의 G418 설페이트 37 ° C에서 SIAT 세포를 인큐베이션. 주 : 희석 배수 경험과 사용 된 세포주에 따라 달라집니다. 세포 단층은 컨 플루 언트해야합니다 (즉, 아니 세포 벽 또는 MDCK 세포와 MDCK-SIAT1 세포 단단히 포장 레이아웃을 볼 수 개요) 바이러스 접종시. 희석액의 예에 기초MDCK 또는 MDCK-SIAT1 세포의 합류 플라스크의 하위 문화는 표 1에 제시되어있다. </li><li> 물론 당 바이러스 성장 매체 (VGM) 200 μL와 세포를 3 회 반복한다. 30 분 동안 70 % EtOH로 다중 벽 플레이트 세척 소독 후 세척 전에 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 또는 VGM에 린스. </li><li> VGM을 대기음 즉시 각 웰에 VGM의 50 μl를 추가합니다. </li><li> (테스트 바이러스 및 중복의 수에 따라 이하) 6 멸균 튜브에 각각 VGM의 900 μl를 추가합니다. 각 희석 사이의 팁을 변경, 희석 직렬, 제 1 튜브에 바이러스의 100 μl를 피펫 잘 혼합합니다. 각각의 바이러스에 대해 반복하는 것이 적정합니다. 참고 :이 10-6로 10-1의 바이러스 희석을 줄 것이다. </li><li> 가장 높은 희석에서 시작하여, 각각의 바이러스 희석의 50 μl를 추가 9의 중복 우물 (그림 1의 열 9, 10) 내지 (그림 1의 1 × 10-5)6 웰 플레이트. </li><li> 바이러스는 세포를 감염시킬 수 2-3 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 놓는다. 참고 : 2 ~ 3 시간 배양은 접종에서 바이러스가 단일 층에 도달 할 수있는 충분한 시간이 있는지 확인하는 것이 필요하다. </li><li> 오버레이를 준비 (10 ㎖ / 판) 참고 : 오버레이 2 배 DMEM, 트립신 (2 μg의 / ml의 최종 농도), (20) 1 ㎎ / ㎖ 주식의 μL, 셀룰로오스 코튼 린터 5 ㎖ (재료 목록 참조) 5 ㎖로 구성되어 있습니다. </li><li> 접종을 제거합니다. </li><li> 오버레이 (각 웰에 200 μL)를 추가합니다. 방해받지 않고, 37 ° C에서 밤새 품어. 주 : 바이러스 발아 후 약 4 시간 일어난다 그래서 플레이트가이 시간 이후에 방해되지 않는 것이 중요하다. </li><li> 우물에서 오버레이를 대기음. </li><li> PBS (A)에 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드를 추가 (200 μL / 웰). 30 분 동안 또는 20 분 동안 실온에서 4 ° C에서 그들을 놓는다. 참고 : PBS A는 10 이동과 자연의 pH 인산 완충 식염수입니다F의 NaCl, 0.25 g의 KCl, 나 2 HPO 4 1.437 g, KH 2 PO 4, 0.25 g, 증류수 1 L (재료 목록 참조). 참고 : 흡입 및 삼키면 화상을 입을 수 있습니다 때 파라 포름 알데히드는 유해하다. 이 발암 성 영향이 제한된 증거도이며, 피부 접촉 후 과민성을 일으킬 수 있습니다. </li><li> 파라 포름 알데히드를 기음과 PBS A를 두 번 접시를 씻어 (200 μL / 웰). </li><li> 향후 사용을 위해 4 ° C에서 PBS A의 판을 보관하거나 다음 단계를 계속한다. </li><li> permeabilization 버퍼를 추가 (100 μL / 웰). 30 분 동안 실온에서 그것을 둡니다. </li><li> PBS A를 두 번 접시를 씻으 (200 μL / 웰). </li><li> 물론 당 (ELISA 버퍼 1,000 1) 첫 번째 항체의 50 μL, 인플루엔자 A 형에 대한 마우스 단클론 항체를 추가합니다. 진탕, 1 시간 (또는 4 ℃로 하룻밤) 실온에서 그것을 품어. </li><li> 세척 완충액 (0.05 % 트윈 80 PBS A, V / V IN) 페이지 100 ㎕에 3 회 반복한다잘 어. 세척과 5 분 동안 실온에서 인큐베이션을. 또는, 잘 300 μl를 사용하여 배양하지 않고 3 회 씻는다. </li><li> 두 번째 항체의 50 μl를 추가, 염소 항 - 마우스 IgG (H + 1) HRP 접합체 (1 : ELISA 버퍼 1,000), 당 잘. 진탕하면서, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하여. </li><li> 단계 1.17에 설명 된대로 3 회 반복한다. </li><li> 기판 (50 μL / 웰)를 추가합니다. 30 분 동안 또는 청색의 발색 분명히 보일 때까지 상온에서이를 부화. </li><li> 세척 사이 2-3 분 동안 실온에서 배양하고, 반응을 정지 웰 당 증류수 200 μL 회 플레이트를 세척한다. </li><li> 접시를 공기 - 건조하고 어두운 장소 (예를 들면, 알루미늄 호일에 포장)에 저장합니다. </li></ol> 2. 적정 정량 <ol><li> 도 2a에 도시 된 바와 같이, 플랫 베드 스캐너의 스캔 영역에서 웰 플레이트를 놓는다. 의 L 자형의 위치 제한을 사용최적의 및 반복적 인 영상 위치를 확인합니다. 참고 : 하나의 스캔 이미지이 잘 접시에 가능하다. </li><li> 이미지를 스캔합니다. 참고 :이 설정은 표 2에 나타내었다. </li><li> 필요한 바이러스 농도 (그림 3)을 계산하기 위해 &quot;Wellplate 리더&quot;소프트웨어를 실행합니다. <ol><li> 이미지를로드하려면 &quot;이미지로드&quot;버튼을 클릭합니다. 샘플링 임계 값을 조정하는 &quot;글로벌 임계 값&quot;탭의 막대 그래프에서 빨간색 막대를 밀어 넣습니다. 이미지에 미치는 영향을 조사하기 위해 &quot;업데이트&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;계산 중화 / 적정&quot;상자을 선택합니다. 유도 결합 플라스마를 정량화 할 수있는 &quot;샘플링&quot;버튼을 클릭합니다. 메시지가 표시되면 샘플링 결과를 저장하기 위해 &quot;저장&quot;버튼을 클릭합니다. 참고 : &quot;계산 중화 / 적정&quot;상자가 체크되어있는 경우 샘플링 과정 후, &quot;중화 및 적정 계산&quot;이라는 새로운 창이 자동으로 나타납니다. </li><li>부하 또는 입력 잘 플레이트 정의지도. &quot;최적의 바이러스 인구 (%) 적정&quot;의 임계 값 (예 : 30 %)을 나타냅니다. 적정 결과를 계산하기 위해 &quot;적정 프로세스&quot;탭을 선택합니다. 적정 결과를 확인합니다. 적정 결과를 저장하기 위해 &quot;저장 후 닫기 &#39;버튼을 클릭합니다. 주 : 소프트웨어에 대한 자세한 설명서에 대한 보충 S1을 참조하십시오. 주문 된 소프트웨어의 사본은 요청에 따라 사용할 수 있습니다. 참고 : 일반적으로, 각 웰 (11)에서 50 % (20-85%) 총 세포의 ICP 주위에 플라크 감소 분석 수익률에 가장 적합한 바이러스 희석. </li></ol></li></ol> 3. 바이러스 중화 주 : 중화 분석에 필요한 판의 수를 계산한다. 각 플레이트 한 바이러스 및 항혈청들을 수용 할 수있다. 주 : 항혈청의 개수 및 중복 수에 따라 웰 플레이트 번째로 설정 될 수있다예 다음은 유연성 (1) 혈청 희석 하나의 행 또는 열 (도 4)을 따라 배치 될 수있다. 각 혈청은 별도의 행이나 열을 차지한다. (2) 혈청 희석의 증가는 유연하지만 플레이트의 좌측 상단에 최고 혈중 농도로 시작한다. (3)의 중복 횟수는 항혈청의 수가 균형. 더 많은 중복 실험적인 변화를 부드럽게하는 데 도움이 될 수 있습니다. (4) VC의 수와 셀 제어 (CC) 중복 유연하지만, 또한 별도의 행 또는 열이어야 수. VC 중복 수가 항혈청보다 훨씬 큰 것으로 예상된다. <ol><li> 에서 미리 1.1-1.3, 2, 3 일 단계로, 세포 단층을 준비한다. </li><li> 플레이트의 각 웰에 VGM의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 각각 VC와 CC에 대한 열 11, 12을 사용합니다. 콜럼의 첫 번째 행 (A) 1:20 수용체 파괴 효소 (RDE) 처리 된 혈청 50 ㎕를 분취 추가NS 1-10. 주 : 각 바이러스 혈청 조합의 경우, 분석은 이중으로 수행되기 때문에, 하나의 플레이트는, 예를 들어, 바이러스가 다섯 항혈청에 대해 테스트를 포함 할 수있다. </li><li> 행 H.에서 50 μl를 (그림 4 열 1 ~ 10) H를 행에 행 A로부터 50 μl를 전송 및 폐기함으로써 연속 희석을 2 배 수행 </li><li> 공통 열 (그림 4 열 12)의 각 웰에 희석 50 μl를 추가합니다. </li><li> 공통 열을 제외하고, 플레이트의 각 웰에 바이러스의 50 μl를 추가합니다 (열 1-11, 그림 4의 행 AH)를. </li><li> 2-3 시간 동안 37 ℃로 인큐베이션. 접종을 제거합니다. 물론 각 오버레이 (200 μL)를 추가합니다. 방해받지 않고, 37 ° C에서 하룻밤을 품어. 수정 및 바이러스 적정 (1.11-1.22 단계)에 관해서 판을 얼룩. </li></ol> 4. 중화 정량화 <ol><li> Figu 같이 평판 스캐너의 스캔 영역에서 웰 플레이트를 놓고2A 다시. 최적하고 반복 촬상 위치를 확인하기 위해 L 자 형상의 위치 제한을 사용한다. 참고 : 하나의 스캔 이미지이 잘 접시에 가능하다. </li><li> 단계 2.2에 설명 된대로 판을 스캔합니다. </li><li> 필요한 바이러스 역가 (그림 3 단계 2.3)를 계산하기 위해 &quot;Wellplate 리더&quot;소프트웨어를 실행합니다. <ol><li> 이미지를로드하려면 &quot;이미지로드&quot;버튼을 클릭합니다. 샘플링 임계 값을 조정하는 &quot;글로벌 임계 값&quot;의 빨간색 막대를 밀어 넣습니다. 효과를 검토하기 위해 &quot;업데이트&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;계산 중화 / 적정&quot;상자을 선택합니다. 유도 결합 플라스마를 정량화 할 수있는 &quot;샘플링&quot;버튼을 클릭합니다. 메시지가 표시되면 샘플링 결과를 저장하기 위해 &quot;저장&quot;버튼을 클릭합니다. 참고 : &quot;계산 중화 / 적정&quot;상자가 체크되어있는 경우 샘플링 과정 후, &quot;중화 및 적정 계산&quot;이라는 새로운 창이 자동으로 나타납니다. </li><li> 잘 페이지로드 또는 입력늦은지도. 의 임계 값 (예를 들어, 50 %)를 나타냅니다 &quot;중화 :. 감염 공제 (%)를&quot; </li><li> 역가를 계산하기 위해 &quot;중화 프로세스&quot;를 선택합니다. 역가를 확인하고 중화 결과를 저장하기 위해 &quot;저장 후 닫기 &#39;버튼을 클릭합니다. 주 : 중화는 VC 대하여 소정 ICP 환원 (예컨대 50 % 나 80 % 등) (도 4의 열 (11)의 평균)과 혈청의 한 최고 희석액의 역수로서보고된다. 50 % ICP 감소는 대표적인 결과를 사용 하였다. </li></ol></li></ol>

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본 연구에서는 바이러스 항원 간의 실제 관계를 정량화하는 촬상 계 MN 분석을 설명했다. 다른 플라크 감소 분석과 비교하면,이 방법은 감염 인구의 완전한 커버리지를 보장 전체 웰의 ICP 측정 강조한다. 플라크 형성의 독립성은 주로 보이지 않는 작은 플라크를 형성 할 수 있거나 단지 하나의 세포 감염을 관리 할 수있는 바이러스 분석의 어플리케이션을 넓힌다. 따라서, 분석은 더욱 바이러스 및 HI 항체가보다 넓은 범위의 효과를 조사 할 수 있고, 이는 더 포괄적 유사성 또는 바이러스 항원 (12) 사이의 차이를 반영하도록 돕는다. 예를 들어, 오셀 카르 복실 레이트가 포함하면, MN의 분석은 이하 더 정확하게 항원 차이를 반영 결합 NA 의존성에 의해 영향을 받는다. 분석의 개발 과정에서 많은 노력 실험 일관성, 속도 및 검출을 향상시키기 위해 이루어졌다감도 평판 스캐너 높은 처리량 정량화 적정 이미징을 통해 입력 된 바이러스를 제어하는 ​​것을 포함하고, 사용자 친화적 인 데이터 프로세싱 플랫폼을 구현. 결과는 일반적으로 일치 있었고, HI의 사람들을 확인했다. 특히,이 결과는 또한 특정 A (H1N1) pdm09 바이러스 HA1에 G155E 교체 등 배양 선택하거나 산발적 변화에 의한 최근 A 형 및 B 백신 바이러스 항원 드리프트 변종 간의 항원 차이뿐만 아니라, 항원 성 변화를 보여 12. 프로토콜은 크게 영상 신호를 강화 강한 감염 준 세포주의 선택과 바이러스 타입 또는 서브 타입을 매칭. 실험적 변이를 시험 항혈청의 개수와 균형 중복 설계 평활화 하였다. 불확실성은 주로 화상 형성 장치에 의해 영향을 받는다 화질로부터 올 수있다. 점잖은 컬러 플랫 베드 스캐너는 유의 수ficantly 이미지 대비를 개선하고 소음을 줄일 수 있습니다. 바이러스가 계속 동일한 상태를 유지하면서 중화에 입력 된 바이러스의 양을 정량적으로 대응하는 적정에서 미리 결정되어야한다. 중화하는 동안 감염에 대한 항혈청 반응의 기준 바이러스 (VC)과 배경 레벨 (CC)의 차이점에 대해 정규화된다. VC 및 CC의 정확한 측정은 중화 실험에 필수적이다. 더 많은 중복 (팔 중복이 대표 결과에 사용 된)을 권장합니다. 마지막으로, 소프트웨어를 이해하는 것이 실험의 성공에 매우 중요합니다. 이 소프트웨어는 2 년 이상에 대한 WHO 인플루엔자 센터, 영국에서 일상적인 바이러스 특성에 대해 테스트되었습니다. 다양한 상황 처리에 대한 자세한 설명은 보충 S1에 제공됩니다. MN이 분석은 시료가 EXT 커버 용도에 적합remely 큰 시야 만은 적당한 이미지 해상도를 필요로한다. 낮은 비용과 간단한 설치는 대부분의 바이러스학 실험실에 시스템을 쉽게 사용할 수 있도록. 동일한 시료의 측정치의 변화는 대략 11 스캔 중에 도입 된 불확실성을 정의 3 % 미만이었다. 이러한 재현성 많은 바이러스 학적 연구에 충분하며, 상기 복수의 스캔 이미지를 평균함으로써 감소 될 수있다. 결론적으로, 본 연구는 통상적으로 항원 성 연구에 사용될 수 있으며, 특히 인간의 인플루엔자 백신에 포함 바이러스 반기 선택할 인플루엔자 바이러스를 현재 순환의 상세한 분석의 HI 데이터를 지원하는 강력한 MN 분석을 보여준다.

마이크로 중화 (MN) 분석은 중화 항체의 정량과 항 바이러스 활동 바이러스학에 사용됩니다. 혈구 응집 억제의 대안으로 (HI) 분석, MN의 분석은 HI의 해석은 1,2,3 결과 복잡하게 수용체 결합 인플루엔자 바이러스에의 선호도 변화에 의해 영향을 비 항원 효과를 극복 할 수있다. 최근까지 대부분의 MN의 분석은 세포 변성 효과 (CPE) 또는 효소 면역 분석법 (ELISA) 4,5 기반으로했다. 초점과 플라크 감소에 따라 MN 분석 1990 년 6,7,8 개발되었다. 플라크 감소 분석은 감염을 정량화 볼 수 플라크를 계산에 의존하고 있습니다. 그러나, 시각 카운트는 플라크의 대부분이 작은 많은 현재의 순환 바이러스에 대한 눈에 보이지는 않지만 인간의 눈으로 확인할 수있는 큰 플라크를 다룹니다. 이 불완전한 정보에 따르면 내가 선도, 심사관들과 실험 사이에 상당한 변화를 일으킬 수 있습니다ncomparable 결과. 또한 일부 바이러스는 단일 세포 또는 매우 작은 플라크 불현성 감염을 표시 할 때 방법을 사용하는 것도 불가능하다. 가난한 계수 해상도 이미징 기반 프로토콜을 도입함으로써 개선 될 수있다. 기술, 광학 현미경 및 높은 처리량의 발전과 함께 잘 플레이트 리더는 감염된 세포 구를 계산하는 정확한 방법을 제공 할 수 있습니다. 트랜스 조명 현미경, 특정 마커 태그 감염된 세포는 서브 세포 해상도에서의 흡수 또는 형광 대조적으로 시각화 할 수있다. 시료 후 컴퓨터 화면에서 분석 될 수있다. 불행히도 인해 시야의 제한으로 100 개 이상의 타일 이미지는 하나의 웰을 포함해야한다. 96 웰 플레이트로 분석하면 약 만 화상의 화상 처리를 필요로한다. 이러한 힘든 과정은 시간이 걸리고 비싸다하고 얻은 해상도는 장군에바이러스 감염의 일상적인 특성에 대한 불필요한 리터. 제한된 예산 연구소는 평판 스캐너 중심으로 구축 접근 방식은 비용 효과, 높은 처리량 대안을 제공하는 것을 알 수 있습니다. 본 논문에서는 바이러스의 많은 수의 항원 특성에 대한 정량적 항 바이러스 활동 및 중화 항체를 측정하기에 적합한 개선 된 플라크 감소 MN 분석에 대해 설명합니다. 분석은 여러 가지 장점이있다 : 첫째, 상관없이 플라크 크기, 세포 수준에서 바이러스 감염을 측정 할 수있는 영상 기반 분석법이다. 잘 내 총 감염된 세포 집단 (ICP)를 계산하는 것은 대단히 가능한 낮은 감염으로 바이러스를 특성화 할 수있게, 검출 감도를 증가시킨다. 둘째,보다 정확한 정량 적정 입력 된 바이러스의 양을 결정하기 위해 중화하기 전에 도입된다. 정량적 입력 바이러스는 상당히 감소 바리다른 실험 사이 기는 실험실의 결과는 더 비교할 수 있습니다. 셋째, 중화 역가를 이미지 분석을 빠르게 정량을 사용자 친화적하여 결정될 수있다. 마지막으로, 프로토콜은 필요한 해상도와 정확도를 비용 효율적이고 높은 쓰루풋의 대안을 제공한다. 정량은 평판 스캐너 무료 데이터 처리 소프트웨어를 기반으로합니다. 전체 설치는 작은 풋 프린트를 가지고 있으며, 대부분의 실험실에서 배포합니다. 이 논문에 제시된 프로토콜은 바이러스 적정, 적정 정량, 바이러스 중화, 중화 정량 등 4 개 주요 단계로 구성되어 있습니다. 바이러스 적정 입력 된 바이러스의 양이 중화에 사용하는 결정 제제 실험이다. 적정 기간 동안, 바이러스 농도의 숫자가 96 웰 플레이트에서 세포 단층에 적용된다. 감염된 세포는 다음 섹션 2. 바이러스 dilu에 정량된다20 %에게 -85 %를 생산 능은 ICP 차례에 대응하는 중화에 입력 바이러스와 같은 적용 섹션 3. 중화 프로토콜의 역가가 섹션을 위의 프로토콜이 대표 결과에 제시되어 다음 4. 실험을 사용하여 정량한다. 분석은 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 형 바이러스와 같은 현재의 순환 인플루엔자 바이러스의 대부분과 함께 지난 2 년 동안 철저하게 테스트되었습니다. 인플루엔자 바이러스의 특성 분석의 결과는 2016 년 남반구와 2016에서 2017 사이에 북반구에 사용되는 인플루엔자 백신에 대한 권장 사항을 준 WHO 상담 회의의 보고서에 포함되었다.

<table><tbody><tr><td>VGM</td><td>Sigma</td><td>D6429, P0781</td><td>500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td></tr><tr><td>PBS A</td><td></td><td></td><td>Nature pH 인산염 완충 식염수: NaCl 10&nbsp; g, KCl 0.25&nbsp; g, Na2HPO4 1.437g, KH2PO4 0.25g 및 Dist. Water 1L.</td></tr><tr><td>Avicell</td><td>FMC</td><td>RC-581F</td><td>2.4g을 100ml 증류수에 넣고 자석 교반기에서 1시간 동안 교반하여 용해합니다. 오토클레이브로 살균합니다.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco 2개&nbsp;</td><td>21935-028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>오버레이 (10 ml/플레이트):</td><td></td><td></td><td>5 ml 2x DMEM, Trypsin 2&nbsp; &뮤; g/ml 최종 농도, Avicell 5&nbsp; ml</td></tr><tr><td>트리톤 X- 100e</td><td>시그마&nbsp;</td><td>T8787</td><td>투과 완충액: PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P5188</td><td>세척 완충액에서 0.2%: 0.05% Tween 80 in PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>PAA Labs Ltd</td><td>B15-021</td><td>ELISA 완충액: PBS A에서 10% (v/v) + 0.1% Tween 80</td></tr><tr><td>Mouse MAb against influenza type A</td><td>Biorad</td><td>MCA 400</td><td>1st 항체: 1:1,000 in ELISA Buffer</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td><td>Biorad</td><td>172-1011</td><td>2nd 항체: 1:1,000 in ELISA Buffer</td></tr><tr><td>True Blu peroxidase substrate</td><td>KPL&nbsp;</td><td>50-78-02</td><td>기판: 트루 블루 +0.03% H2O2g (1:1,000 of 30% solution)</td></tr><tr><td>96-well flat-bottom microtitre plates</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>8 채널 다중벽 플레이트 와셔 및 매니폴드</td><td>Sigma</td><td>M2656</td><td></td></tr><tr><td>퍼펙션 플레이트 스캐너</td><td>Epson</td><td>V750 Pro</td><td>이미징 소프트웨어는 <a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp 에서 자유롭게 다운로드할 수 있습니다. infoType=다운로드">http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp; infoType=다운로드</a>.</td></tr><tr><td>소프트웨어 운영 환경: NI</td><td>Vision Builder 기반</td> LabVIEW <td>National Instruments Corporation</td> Window <td>버전: LabVIEW2012 이상</td></tr></tbody></table>

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

미세중화(MN) 분석은 인플루엔자 바이러스의 감염성과 바이러스 복제 억제를 측정하기 위한 표준 기술입니다. 이 연구에서는 바이러스 간의 실제 항원 관계를 정량화하기 위한 이미징 기반 MN 분석 프로토콜을 제시합니다. 눈에 보이는 플라크에 의존하는 일반적인 플라크 감소 분석과 달리, 이 분석은 각 웰의 전체 감염된 세포 집단을 정량화합니다. 이 프로토콜은 바이러스 유형 또는 아형을 세포주 선택과 일치시켜 감염성을 극대화함으로써 이미징 및 이미지 처리 중 샘플 대비를 향상시킵니다. 정량 적정의 도입은 중화의 입력 바이러스의 양을 정의하고 다른 실험의 결과를 비교할 수 있게 합니다. 평판 스캐너와 무료로 다운로드할 수 있는 소프트웨어를 사용한 이미징 설정은 이 접근 방식을 높은 처리량, 비용 효율성, 사용자 친화적이고 대부분의 실험실에 쉽게 배포할 수 있도록 합니다. 본 연구는 개선된 MN 분석법이 A(H3N2) 바이러스의 뉴라미니다아제(NA)에 있는 아미노산 치환의 영향을 크게 받지 않으면서 현재 순환하는 인플루엔자 A(H1N1)pdm09, A(H3N2) 및 B 바이러스와 잘 작동한다는 것을 보여줍니다. 낮은 HA 역가로 성장하거나 유산 감염을 겪어 배양된 세포에서 플라크를 형성할 수 없는 바이러스의 특성을 분석하는 데 특히 유용합니다.

위의 절차에 따라, 우리는 최근의 항원 특성 실험에서 어떤 결과를 제시한다. 적정 설치는 각각의 희석에 대한 이중 중복으로, 8 개의 입력 바이러스를 검사하도록 설계되었습니다. 바이러스 희석 바이러스의 변형을 다루 -6 1.0 × -1 10 × 1.0 내지 1.0 시험 하였다. 테스트 바이러스는 A / 카메룬 / 15V-2,015분의 3,538을 포함하여 H3N2 아형, 출신 A / 블라디보스톡 / / 2015 (36), A / 모스크바 / A / 톰 스크 / 5 / 2015 / A / 모스크바 / 2,015분의 101 (103) / 2015 A / 모스크바 / / 2015 (100), A / 모스크바 / / 2015 (133), 및 A / 브라 티 슬라바 / 2,015분의 437. 적정 결과를도 5에 도시되어있다. 도 5d는 바이러스 희석 증가를 ICP의 감소를 보여준다. 곡선이 잘 (12) 내의 모든 세포에서 감염을 굴복 같은 바이러스를 ICP에 대해 정규화 된 (ICP 포화로 정의). 유도 결합 플라스마는 인사와 함께 포화에 도달하지 않은 경우ghest 바이러스 농도는, 대응하는 중복의 ICP 평균 대신 사용되었다 (A / 모스크바 / / 2015 103도 5D에서). ICP 포화도의 30 %를 생산하는 바이러스 희석 중화 (표 3)에 대한 입력의 바이러스 희석으로 선택 하였다. 중화 각 접시에 두 번 중복으로 다섯 항혈청에 대해 하나의 입력 바이러스가하는 것을 목표로. 표시 기준 바이러스는 H3N2 A / 스톡홀름 / 2,015분의 63입니다. 다섯 항혈청은 A / HK 14분의 4,801 계란 F12 / 15, A / HK 14분의 7,295 MDCK의 F02 / 15, A / 남아프리카 공화국 R2665 / 15 SIAT의 F50 / 15, A / 스위스 13분의 9,715,923 SIAT NIBF의 F18 / 15, 및 A / 네덜란드 14분의 525의 SIAT F23 / 15. 중화 결과는도 6에 도시되어있다. 그림 6D는 혈청 희석의 증가와 감염의 진행 상황을 보여줍니다. 수직축 정규화 양 인구 평균 ICP 대하여 해당 항혈청 응답으로부터 ICP와의 비를 나타낸다기준 (12)의 바이러스. 감염되지 않은 세포 컨트롤에서 배경 ICP는 정상화시 차감되었습니다. 중화 역가는 50 % ICP 감소 (표 4)에 대응하는 항혈청 희석액의 역수로서 결정 하였다. 선형 보간은 두 개의 인접한 혈청 희석액 사이 떨어지는 역가를 추정하는데 사용 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> 그림 1 : 바이러스 적정 실험에서 잘 플레이트 설치의 예. 테스트 바이러스는 별도의 행 (H에 A)에 할당됩니다. 열은 다른 바이러스 성 희석 (12-1)을 위해 설계되었습니다. 두 열은 각각의 바이러스 희석 중복 사용 하였다. 스케일 바 = 10 mm이다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 2 : 샘플 스캐닝 시스템의 회로도. (a)는 플랫 베드 스캐너의 촬상 위치에있는 96 웰 플레이트 (로부터 재발행 엘스 비어 BV 허가) 11를 참조하고, (b)에 도시하는 L 자형 리미트 치수 (a). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> 그림 3 : &quot;Wellplate 리더&quot;정량 소프트웨어의 바탕 화면도. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </p&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> 그림 4 : 중화 실험에서 잘 플레이트 설치의 예. 각 항혈청은 중복 (10-1)와 함께 두 개의 열이 할당됩니다. 행은 다른 혈청 희석 (H에 A)을 위해 설계되었습니다. 바이러스 제어 팔 중복 (H11에 A11)와, 열 (11)을합니다. 셀 제어 여덟 중복 (H12에 A12)와 칼럼 (12)이다. 스케일 바 = 10 mm이다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> 그림 5 : 적정 실험의 결과. (a) 웰 플레이트 셋업, (b)는 웰 플레이트 이미지를 검색 (c) 그림컬러 인코딩, 정량, 바이러스에 감염된 세포 집단 및 바이러스 희석액에 대해 (d) 표준화 바이러스 감염된 세포 집단. 30 %는 ICP 임계치로 사용 하였다. (d) 상기 에러 막대 샘플 중복 (± 1 SD)로부터 표준 편차 (SD)이다. (b)와 (c)에서의 스케일 바는 10mm를 =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> 그림 6 : 중화 실험의 결과. (a) 웰 플레이트 설정, (b) 웰 플레이트 화상의 정량, 바이러스에 감염된 세포 집단의 (c) 그림과 혈청 희석액에 대한 (d) 표준화 바이러스 감염된 세포 집단 스캔. 입력 VIRUS (VC)은 A / 스톡홀름 / 2,015분의 63입니다. 50 % ICP의 역가를 산출 하였다. (d) 상기 에러 막대 샘플 중복 (± 1 SD)로부터 표준 편차 (SD)이다. (b)와 (c)에서의 스케일 바는 10mm를 =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 S1 : <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> 일반적인 희석 </td></tr><tr><td></td><td> MDCK 세포 </td><td> MDCK-SIAT1 세포 </td></tr><tr><td> 이일 </td><td> 1 : 5 (1 + 4) </td><td> 1시 10분 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 일 </td&gt; <td> 1시 10분 (1 + 9) </td><td> 1시 20분 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> ml의 당 세포의 전형적인 수 </td></tr><tr><td></td><td> MDCK 세포 </td><td> MDCK-SIAT1 세포 </td></tr><tr><td> 이일 </td><td> 2 × 10 5 </td><td> 1 × 10 (5) </td></tr><tr><td> 3 일 </td><td> 1 × 10 (5) </td><td> 5 × 10 (4) </td></tr></tbody></table> 표 1 : MDCK 또는 MDCK-SIAT1 세포의 합류 플라스크의 하위 문화에 전형적인 희석. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 방법 </td><td> 전문가 모드 </td></tr><tr><td> 문서 유형 </td><td> 필름 (필름 지역 가이드와 함께) </td></tr><tr><td> 자동 노출 유형 </td><td> 사진 </td></tr><tr><td> 임세 유형 </td><td> 24 비트 컬러 </td></tr><tr><td> 해결 </td><td> 1,200 dpi의 </td></tr><tr><td> 저장된 이미지 형식 </td><td> 사소한 말다툼 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 평판 스캐너의 표준 설치. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 열 </td><td> 바이러스 </td><td> 권장 희석 </td></tr><tr><td> 에이 </td><td> A / 카메론 / 15V-2,016분의 3,538 </td><td> 1.0 × 10 -2 </td></tr><tr><td> 비 </td><td> A / 블라디보스톡 / 2,015분의 36 </td><td> 1.0 × 10 -3 </td></tr><tr><td> 기음 </td><td> A / 모스크바 / 2,015분의 103 </td><td> 1.1 × 10 -1 </td></tr><tr><td> 디 </td><td> A / 톰 스크 / 2천15분의 5 </td><td> 5.9 × 10 -1 </td></tr><tr><td> 이자형 </td><td> A / 모스크바 / 2,015분의 101 </td><td> 8.3 × 10 -1 </td></tr><tr><td> 에프 </td><td> A / 모스크바 / 2,015분의 100 </td><td> 1.4 × 10 -2 </td></tr><tr><td> 지 </td><td> A / 모스크바 / 2,015분의 133 </td><td> 1.3 × 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / 브라 티 슬라바 / 2,015분의 437 </td><td> 1.3 × 10 -4 </td></tr></tbody></table> 표 3 : 30 % ICP의 인구에서 계산 된 바이러스 희석. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 기둥 </td><td> 항혈청 </td><td> 추천 역가 </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> (110) </td></tr><tr><td> 3-4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213.3 </td></tr><tr><td&gt; 5-6 </td><td> A / 남아프리카 공화국 / R2665 / 2015 </td><td> 2155.8 </td></tr><tr><td> 7-8 </td><td> A / 스위스 / 2,013분의 9,715,293 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td> A / 네덜란드 / 2,014분의 525 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> 표 4 : A / 스톡홀름의 50 % ICP / 항혈청에 대한 2천15분의 63에서 역가.

이 연구는 설명 영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

본 미세 중화 분석의 전반적인 목적은 현재 유행하는 모든 유형의 인플루엔자 바이러스와 항체 및 항바이러스 측정치의 활성을 정량적이고 고처리량이며 매우 민감한 방식으로 특성화하는 것입니다. 이 방법은 인플루엔자 바이러스의 항원성 특성화, 항체의 정량적 중화 및 항바이러스 활성과 같이 바이러스학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 가시적 및 비가시적 플라크와 단일 세포 감염을 포함하여 감염된 전체 세포 집단을 특성화한다는 점입니다.마이크로 중화 분석법은 런던 WHO 인플루엔자 협력 센터의 부소장인 Yipu Lin 박사가 시연합니다. 다음 프로토콜의 생물안전등급(BSL)은 계절성 인플루엔자 바이러스의 경우 BSL 2이며, 잠재적 팬데믹 인플루엔자 바이러스의 경우 BSL 3+입니다. 우선, 96-웰 플레이트에 충분한 양의 세포를 분주합니다.세포가 완전히 충전될 때까지 37 °C, 5% CO2 조건에서 2~3일 동안 배양합니다. 70% ethanol을 사용하여 멀티웰 플레이트 세척기를 멸균하고, PBS 또는 VGM으로 헹굽니다. 그 후, 200 µL의 바이러스 성장 배지(VGM)를 사용하여 충전된 세포를 세척합니다.세포에서 VGM을 흡입하여 제거하고, 즉시 각 웰에 50 µL의 VGM을 첨가합니다. 다음으로, 6개의 멸균 튜브 각각에 900 µL의 VGM을 첨가합니다. 그런 다음, 첫 번째 튜브에 100 µL의 바이러스를 피펫으로 넣고 잘 섞어줍니다.첫 번째 튜브부터 시작하여 바이러스의 연속 희석액을 준비하며, 각 희석 단계마다 팁을 교체합니다. 가장 높은 희석 배수부터 시작하여 각 바이러스 희석액 50 µL를 96-well 플레이트의 중복 웰에 첨가합니다. 그 후, 바이러스가 세포를 감염시킬 수 있도록 플레이트를 37 °C에서 2~3시간 동안 배양합니다.텍스트 프로토콜에 따라 오버레이를 준비한 후, 웰에서 접종물을 제거합니다. 그런 다음, 각 웰에 200 microliters의 오버레이를 추가하고 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 정지 상태로 배양합니다. 웰에 얼음처럼 차가운 PBS A 내 4%PFA 200 microliters를 추가하고, 4 degrees Celsius에서 30분 또는 상온에서 20분 동안 배양합니다.배양 후, PFA를 흡입하여 제거하고, 웰당 200 µL의 PBS A를 사용하여 플레이트를 2회 세척합니다. 플레이트에 100 µL의 투과화 버퍼를 첨가하고, 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음, PBS A를 사용하여 플레이트를 2회 세척합니다.다음으로, 각 웰에 인플루엔자 A형에 대한 마우스 단클론 항체 50 µL를 넣고, 상온에서 1시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 배양 후, 300 µL의 세척 완충액을 사용하여 웰을 3회 세척합니다. 그 후, 시료에 HRP 접합 염소 2차 항체 50 µL를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 배양합니다.이전과 동일하게 웰을 3회 세척한 후, 웰당 50 microliters의 기질을 첨가하고 상온에서 30분 동안 또는 청색의 발색이 뚜렷하게 보일 때까지 배양합니다. 반응을 중단시키기 위해 200 microliters의 증류수를 사용하여 웰을 2회 세척합니다. 그 후 플레이트를 공기 중에서 건조시키고 암소에 보관하십시오.L-형 위치 제한 표시를 사용하여 최적의 반복 가능한 이미징 위치를 확보한 후, 플랫베드 스캐너의 스캔 영역에 웰 플레이트를 배치하십시오. 여기에 표시된 설정으로 플레이트를 스캔합니다. 그다음, 웰 플레이트 리더 소프트웨어를 실행하고 Load Image 버튼을 클릭하여 이미지를 불러와 필요한 바이러스 농도를 계산하십시오.다음으로, 전역 임계값(global threshold) 탭에서 히스토그램의 빨간색 막대를 밀어 샘플링 임계값을 조정합니다. 그런 다음, 업데이트 버튼을 클릭하여 이미지에 미치는 영향을 확인합니다. 이제 중화/적정 계산(Calculate Neutralization/Titration) 확인란을 선택합니다.Sampling 버튼을 클릭하여 감염된 세포군, 즉 ICP를 정량화하십시오. 그런 다음 메시지가 표시되면 Save 버튼을 클릭하여 샘플링 결과를 저장하십시오. 타이트레이션 결과를 얻으려면 웰 플레이트 정의 맵을 로드하거나 입력하십시오.적정(Titration)에서: 최적 바이러스 개체수(Optimal Virus Population)는 임계값을 나타냅니다. 적정 프로세스(Titration Process) 탭을 선택하여 적정 결과를 계산하십시오. 그런 다음, 저장 및 닫기(Save and Close) 버튼을 클릭하여 결과를 저장하기 전에 적정 결과를 확인하십시오.소프트웨어에 대한 더 자세한 지침은 보충 자료 S1을 참조하십시오. 바이러스 중화를 수행하려면 2~3일 전에 세포 단층을 준비하십시오. 그런 다음, 플레이트의 각 웰에 50 µL의 VGM을 첨가하십시오.11번 열과 12번 열을 각각 바이러스 대조군과 세포 대조군으로 사용하십시오. 1번에서 10번 열의 첫 번째 행에 20배 희석한 수용체 파괴 효소(RDE) 처리 혈청 50 µL씩을 분주합니다. A행에서 H행까지 50 µL씩 옮기고 H행에서 50 µL를 제거하여 2배 연속 희석을 수행하십시오. 그런 다음, 세포 대조군 열의 각 웰에 희석액 50 µL를 첨가합니다.세포 대조군 열을 제외한 플레이트의 각 웰에 바이러스 50 µL를 첨가합니다. 플레이트를 37 °C에서 2~3시간 동안 배양합니다. 그 후, 접종액을 제거하고 각 웰에 오버레이를 첨가합니다.플레이트를 37°C에서 밤새도록 그대로 배양합니다. 그 후, 이 영상의 앞부분에서 보여준 대로 플레이트를 고정하고 염색합니다. 중화 정도를 정량화하려면, 이전 단계에서 시연한 것과 같이 플랫베드 스캐너의 스캔 영역에 웰 플레이트를 배치합니다.플레이트를 스캔하고 이전과 동일하게 웰 플레이트 리더 소프트웨어를 실행하여 필요한 바이러스 역가를 계산하십시오. 웰 플레이트 맵을 로드하거나 입력한 후, Neutralization:Infection Deduction에서 임계값을 지정하십시오. 그런 다음 Neutralization Process를 선택하여 역가를 계산하십시오.마지막으로 역가를 확인한 후, Save and Close 버튼을 클릭하여 중화 결과를 저장합니다. 여기에는 1.0 × 10⁻¹에서 1.0 × 10⁻⁶ 사이의 희석 배수로 수행한 8종의 투입 바이러스에 대한 최근 항원성 특성 분석 실험의 적정 결과가 나타나 있습니다. 그래프는 바이러스 희석 배수가 증가함에 따라 ICP가 감소함을 보여줍니다.곡선은 웰 내의 모든 세포에서 감염을 일으킨 동일한 바이러스의 ICP에 대해 정규화되었습니다. 이 표에는 중화 실험을 위한 입력 바이러스 희석 배율로 선택된, ICP 포화도의 30%를 생성한 바이러스 희석 배율이 나열되어 있습니다. 이 그림은 다섯 가지 항혈청에 대해 하나의 입력 바이러스를 사용하여 수행한 중화 실험의 결과를 보여줍니다.그래프는 혈청 희석 배수 증가에 따른 감염 과정을 보여줍니다. 세로축의 정규화된 양성 집단은 대조 바이러스의 평균 ICP 대비 해당 항혈청 반응에서 나타난 ICP의 비율을 나타냅니다. 최종적으로, 중화 역가는 ICP가 50% 감소하는 지점에 해당하는 항혈청 희석 배수의 역수로 결정되었습니다.본 분석법은 입력 바이러스의 정량적 적정, 고효율 이미지 분석 및 데이터 처리를 포함하여 일관성, 속도 및 검출 민감도에 중점을 둡니다. 이 방법은 비용 효율적이고 사용자 친화적이며, 바이러스 항원 연구에 일상적으로 사용되어 왔습니다.

optimization-of-a-quantitative-micro-neutralization-assay

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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인간 혈청에서 중화 항체 역가를 측정하기 위한 미세중화 분석

이 비디오는 인플루엔자 A와 B 바이러스 간의 항원 관계를 분석하기 위한 이미징 기반 미세 중화 분석을 보여줍니다. 바이러스 감염 예방에 대한 항체 또는 기타 치료법의 효과를 평가할 수 있는 정량적이고 시각적인 방법을 제공합니다.

이미지 기반 미세중화 분석을 사용한 바이러스 간의 항원 관계 분석

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프로토콜 WEHI 164 셀 중립화 메커니즘을 사용 하는 안티-TNFα mAb의 상대 안티-apoptotic 활동의 결정에 대 한 여기에 제공 됩니다. 이 프로토콜은 같은 생물 학적 기능을 가진 다른 분자의 중립화 강도 비교 하는 데 유용.

상대적인 힘의 안티-TNF 단 클론 항 체 (mAb) 중화 방 청 TNF는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정

모 세관 기반 immunoassay 상용 플랫폼을 사용 하 여 총 단백질 준비에서 대상 단백질을 측정 하는 보여 줍니다. 또한, 노출 시간, 단백질 농도, 및 항 체 희석의 분석 결과 매개 변수 셀 문화 모델 시스템 최적화 되어 있다.

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여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

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핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

학습하세요 정량적 마이크로 중화 분석법을 통해 인플루엔자 바이러스의 항원적 특성과 항체 중화 능력을 고감도로 측정하는 방법을. 이 기술은 바이러스학 연구에서 감염 세포 전체를 정량화하여 항바이러스 활성을 평가하는 데 활용됩니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

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