Name: 청각 차별 학습 한 후 마우스 뇌 영역의 높은 해상도 양적 시냅틱 프로테옴 프로파일 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 학습하세요 청각 차별 학습 후 마우스 뇌 시냅스의 고해상도 양적 프로테옴 프로파일링 방법을. 이 기술은 시냅스 단백질의 대규모 정량화를 통해 학습과 기억 형성의 분자 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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훌륭한 기술 지원을 제공해 주신 Yvonne Ducho와 Kathrin Pohlmann에게 감사드립니다. 이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft(SFB 779)와 행동 뇌 과학 센터(CBBS)를 통해 작센안할트 주/유럽 지역 개발 기금(ERDF)의 지원을 받았습니다.

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이 연구는 학습과 생쥐의 다른 뇌 영역 메모리 통합 동안 시냅스 단백질 발현 변화의 정확한 정량 프로파일에 최적화 된 방법론 워크 플로우를 제공합니다. 설치는 질량 분석 분석을위한 샘플 당 적어도 세 기술 복제의 필요한 응용 프로그램의에도 불구하고 단일 동물의 수준에서 단백질 발현을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 방법론이 고려 고분자 지지체 단백질로 이루어진 사전 및 postsynapse의 특정 단백질 조성물을 얻어 아니라 중간 또는 낮은 분자량 담지 중요한 매개체 단백질. synaptosomal 준비의에서-솔루션 다이제스트 효율적인 세대가 발생하고, 따라서 발판 유래 펩티드의 과잉 표현입니다. 이는 차례로, 더 작은 또는 저급 풍부한 단백질의 분석을 억제 할 수있다. 에서 SDS-PAGE 분획의 제안 준비평행 인 - 겔 소화 과정과 함께 각각의 샘플의 분취 량 중저 풍부한 단백질의 분석을 용이하게하고, 추천 상보적인 방법을 나타낸다. 샘플 유래의 모든 분획의 분리 질량 분석 도포 후 (인 용액 다이제스트 예에서 겔 결합 포스 - 풍부 분획 다이제스트)에 대응하는 MS / MS 데이터 세트 합하고 상기 PEAKS 의한 단백질 확인 및 정량을 위해 계산 될 수있다 소프트웨어 나 다른 인기있는 소프트웨어 패키지. 대안 적으로, 인 용액 절단 샘플의 생성에 겔 소화 유래 시료의 분획 (시료 차선 별도로 처리 겔 부분) 및 분획의 개별 애플리케이션이 증가 할 수 질량 스펙트럼 (이온 교환 크로마토 그래피에 의해 예) 분석 깊이. 그러나,이 확장 된 워크 플로우를 극적으로 LS-MS / MS 데이터 수집에 필요한 시간을 증가시킨다. generatio에 대한프로테옴 프로파일의 지정된 시간 코스를 학습과 기억 형성 동안 시냅스 단백질의 재 배열의 상세한 분자 시퀀스의 N이 필요합니다. 동물의 성능 후 약 학습 곡선의 점근 적 수준에 도달 할 때까지이 시간 코스는 후 또는 첫 번째 훈련 세션 동안 즉시 시작하고 확대 메시 시간 프레임을 커버 할 수있다. 8 - 훈련 10 일 (자세한 내용은 그림 2 참조). 시냅스 단백질의 인산화 변화의 분석은 FMTD 학습하는 동안 선택된 시간 프레임에서 특정 초점을 필요로한다. 단백질 인산화와 dephosphorylations에 의해 유발되는 것으로 알려져 시냅스 단백질의 재 배열을 개시 한 손으로 신호 폭포에서 동물 훈련의 초기 단계에서 예상된다. 한편, (S) 내에 연결 및 조립을 조절 알려진 여러 시냅스 인산화 단백질의 장기적인 변형이 존재ynaptic 건축 19, 20. 이러한 번역 후 변형에도 메모리 통합 이후 시점에서 예상된다. 이 단백체 워크 플로우에 의해 생성 된 복잡한 데이터 세트 분자 경로 및 주요 분자를 참여 식별하기 위해 생물 정보학 처리를 필요로한다. 메타 분석은 학습과 기억 과정에 중요한 역할을 크게 부풀려 경로를 보여줍니다.

학습은 메모리 트레이스 및 유지 보수의 형성에 기초한다. 널리 하나의 기본 메커니즘은 신경 세포 사이에 존재하는 시냅스 접촉의 새로운 및 / 또는 재배치의 활동에 의존 형성을 나타낼 수 있음을 인정한다. 분자 수준에서 다양한 단백질 변형, 세포 내 relocalizations과 시냅스 단백질의 회전율의 변화 1-4 (LAMPRECHT을 2004 년 # 8) 설명 하였다. 그러나 대부분의 연구는 지금까지 오히려 글로벌 그러나 복잡한 시냅스 프로테옴 조성에보다 선택 단백질에 초점을 맞추었다. 본 방법은 학습 실험 후 마우스 뇌 영역에서 시냅스 프로테옴의 변화에 ​​대한 공정한 심사를 할 수 있습니다. 이 시냅스 아키텍처의 학습에 의한 구조 조정의 시간 - 포인트 의존 분자 스냅 샷을 렌더링하기에 적합합니다. 설명 된 워크 플로는 동물 행동, 단백질 생화학, 질량 분석 및 bioi 다른 전문가의 특정 팀워크를 필요nformatics. 선택된 학습 패러다임, 즉 주파수 변조 톤 차별 (FMTD)는 설치류 5에서 잘 특징 청각 차별 작업입니다. 이 셔틀 박스로 이동 / 학습과 장기 기억 형성 없음 고우 태스크 증가 피질 도파민 시그널링 및 단백질 합성에 따라 메커니즘을 포함한다. 따라서, 게르 빌 루스 쥐와 쥐에 최근 단백체 연구는 도파민과 대뇌 피질에서 시냅스 구성 요소의 학습에 의한 플라스틱 재 배열뿐만 아니라, 가정 FMTD의 학습과 기억 6 ~ 8시 상호 작용을 더 기저 뇌 영역에 보여집니다. 이 기억 형성 다양한 뇌 영역의 복잡한 상호 작용을 포함하므로, 차분 프로테옴 수준에서 이러한 영역들 내에서 조정될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 선택 피질 및 피질 마우스 뇌 영역의 해부는 워크 플로에 포함되어 있습니다. 또한, 신뢰성 characterizati심지어 시냅스 단백질 성분에 약한 변화에 사전 및 시냅스 구획의 농축이 아닌 균질 또는 원유 막 분수 (9)의 분석을 필요로한다. 종래 단백질체 분석에 따라서, 시냅 토좀 (synaptosome)의 제조에 이용하는 단계 확립 프로토콜 검출 레벨과 시냅스 특정 단백질 10,11위한 동적 범위를 증가시키기 위해 설명된다. 정량적 목적 라벨없는 고해상도 질량 분석을 사용하는 필수 전제 조건은 단백질 샘플의 높은 유사도이다. 로 시냅스 단백질 조성이 아니라 사소한 변경, 라벨없는 접근 방식은 훈련과 순진 생쥐에서 얻은 단백질 샘플을 대응하는 비교하는 것이 적합 할 것이다 학습 후에 발생할 것으로 예상된다. 또한, 안정 동위 원소 (예 : TMT, iTRAQ, ICPL 및 SILAC)과 MS2 기반 라벨 무료 ...로서를 사용하여 단백질 / 펩티드의 조건 - 특정 레이블 전략ntification (SWATH)이 유용하지만, 이들은 선택된 라벨없는 접근법보다 더 비싼 특수 질량 분석 하드웨어가 필요하다. 단백체 검사는 종종 복잡한 데이터 세트를 생성하기 때문에, 생물 정보학 처리가 적절한 데이터 해석을 권장합니다. 추가 메타 분석은 패러다임 관련 변경 사항 및 관련 핵심 세포 프로세스 및 신호 전달 경로의 식별을 기본 잠재적 인 분자 메커니즘의 더 나은 이해를 지원할 수있다. 적절한 방법은 아래에 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>3 M Empore 고체상 추출- 필터</td><td>3M Bioanalytical Technologies</td><td>4245SD</td><td>7 mm/3 ml</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td></td><td>164564 100 &micro; m x 2cm, C18</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164569</td><td>75 &마이크로; m x 25 cm, C18</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3738.1</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴(ACN)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE70.2</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드(30%)</td><td>AppliChem</td><td>A0951</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 수소 탄산염&nbsp; &nbsp;</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄&nbsp;</td><td>플루카&nbsp;</td><td>44273</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄&nbsp; (APS)</td><td>AppliChem</td><td>A2941</td><td></td></tr><tr><td>바이오퓨지 pico</td><td>Heraeus GmbH</td><td>75003280</td><td></td></tr><tr><td>블루 R-250&nbsp;</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>17525</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>파마시아 바이오테크</td><td>17132901</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>찰스 리버&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cantharidin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3322.1</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50용 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>TLA 100.1 로터용 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R 원심분리기</td><td>VWR</td><td>22636138</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf A-8-11 로터</td><td>VWR</td><td>5407000317</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Fluka</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>GeneCodis</td><td>http://genecodis.cnb.csic.es/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gephi</td><td>https://gephi.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>글리세롤</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>AppliChem</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>HALT 포스파타제 억제제 칵테일&nbsp;</td><td>피어스 /Thermo Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 버퍼 솔루션&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>S11-001</td><td></td></tr><tr><td>균질화 용기 2ml</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2252</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>독창성 경로 분석</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>실험실용 시추 드라이브 &nbsp; K-컨트롤TLC 4957&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>칼텐바흐 & Vogt GmbH</td><td>182997</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2 Thermo</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macs-mix 튜브 로테이터</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Magic Scan 4.71</td><td>UMAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE71.2</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS 7.5</td><td>Bioinformatic Solutions&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산가수분해효소 억제제 칵테일 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoRS 3.1</td><td>IMP/IMBA/GMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>PTFE로 만든 플런저/유봉</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2651</td><td></td></tr><tr><td>PotterS 균질화기</td><td>Sartorius AG</td><td>853 3024</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 완전한 미니</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>수량 1 4.5.1</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186002122</td><td></td></tr><tr><td>셔틀 박스</td><td>Coulbourne Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecylsulfate (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 몰리브덴</td> 데이트 <td>Carl Roth GmbH</td><td>274.2</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 주석산 이수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>SONOREX RK 156 초음파 수조</td><td>BANDELIN electronic GmbH & Co. KG</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>방음 챔버</td><td>Industrial Acoustics Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸 에틸렌 -1,2-디아민 (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer basic</td><td>CallMedia</td><td>111000</td><td></td></tr><tr><td><a name="RANGE! A60">타이탄스피어 TiO 5&마이크로; m</a></td><td>GL Sciences Inc. 일본</td><td>502075000</td><td></td></tr><tr><td>TLA 100.1 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoro 아세트산&nbsp; (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS)</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Gold</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Ultra HPLC&nbsp;</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Unijet II 냉장 흡인기</td><td>Uniequip Laborger&auml; te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNIVAPO 100 H 농축기 원심분리기&nbsp;</td><td>Uniequip Laborger&auml; te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>물 (고품질 purifed)</td><td></td><td></td> <td>저항 : > 18.2 M & Omega; * 25 °C에서 cm; 씨&nbsp; 발열원: < 0.02 유럽연합/ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 목차: < 10 ppb</td></tr><tr><td>Xcalibur 3.0.63</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18 피펫 팁</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18S960</td><td></td></tr></tbody></table>

청각 차별 학습 한 후 마우스 뇌 영역의 높은 해상도 양적 시냅틱 프로테옴 프로파일

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

청각 학습과 기억의 기저에 있는 분자 시냅스 메커니즘은 대부분 알려지지 않았습니다. 여기에서는 생쥐의 청각 변별 학습에 대한 단백질체학 연구의 작업 흐름이 설명됩니다. 이 학습 패러다임에서 마우스는 가벼운 전기 발 충격을 피하기 위해 상승 및 하강 주파수 변조 톤을 구별하기 위해 셔틀 박스 Go/NoGo 작업에서 훈련을 받습니다. 이 프로토콜은 4개의 뇌 영역, 즉 청각 피질(auditory cortex), 전두엽 피질(frontal cortex), 해마(hippocampus) 및 선조체(striatum)에서 시냅토솜을 강화하는 것을 포함합니다. 훈련된 마우스에서 얻은 시냅스 단백질 발현 패턴을 단백질체학 접근법을 사용하여 순진한 대조군과 비교합니다. 충분한 분석 깊이를 얻기 위해 질량 분석 전에 세 가지 다른 방법, 즉 1D SDS-PAGE/in-gel 분해, 용액 내 분해 및 포스포 펩타이드 농축으로 샘플을 분획합니다. 
질량분석기에 대한 고분해능 단백질체학 분석 및 무표지 정량화는 시냅토솜 단백질 샘플의 포스포 펩타이드 고갈 및 포스포 펩타이드 농축 분획에서 시냅스 단백질 프로파일을 검사하는 데 사용됩니다. 상용 소프트웨어 패키지는 상대적 시냅스 풍부도 수준이 크게 조절되는 단백질과 포스포 펩타이드를 밝히는 데 사용됩니다(훈련된/나이브 대조군). 훈련 후 조사된 마우스의 뇌 영역에서 시냅스 단백질체에 대한 공통 및 차등 조절 모드가 관찰되었습니다. 그 후, 여러 데이터베이스를 활용한 메타 분석을 사용하여 기저의 세포 기능과 생물학적 경로를 식별합니다.

그림 1은 청각 차별 학습 후 마우스 뇌 영역의 양적 시냅스 프로테옴 프로파일의 전체 흐름을 요약 한 것입니다. 그것은 셔틀 상자의 동물 훈련을 시작합니다. 도 2에 도시 된 예에서, 마우스는 효율적인 학습을 나타내는 네 번째 훈련 상당한 FM 톤 구별을 표시하기 시작했다. 동물의 뇌 영역 해부에 대한 선택 시점에서 희생된다. 시냅스 필요한 농축 어느 시냅 토좀 (synaptosome)의 제조 방법에 의해 달성 될 수 있거나 PSD 농축 방법은 낮은 조직 양을 위해 개발 된 대안 PSD - 풍부 분획의 제조에 의해, 모두도 3에 상세히 설명 예 1 - 쥐의 뇌 (12), (18)에서 2 해마 조각. 그것은 작은 튜브,이 튜브 피팅 PTFE의 방앗와 유 봉에 전력을 공급하기위한 실험실 드릴링 드라이브가 필요합니다. 인해 시냅 토좀 (synaptosome)의 특정 단백질 조성물에 강력히 개의 서로 다르지만 상보적인 방식으로 샘플 준비를 수행 할 것을 권장한다. 의 PSD의 골격은 종종 높은 화학 양론에서 발생하는 매우 높은 분자량의 단백질이다. 인 - 솔루션 다이제스트 효율적으로 추출 할 수 있지만, 생성 된 펩타이드 혼합물의 오버 샘플링으로 이어질 수있는 가장 좋은 방법입니다. 는 겔에 그 고 분자량 단백질을 제외하고 중간 및 낮은 분자량의 단백질의 분석을 선호 할 수 병렬로 동일한 샘플의 수행 다이제스트. 포괄적 인 분석을 위해 단백질 분해 소화의 두 종류가 권장됩니다. 조사 뇌 영역의 조직의 서로 다른 양 더 나은 비교를 위해 적용 재료의 조정이 필요합니다. 네 조사 뇌 영역에서 청각 피질은 일반적으로 제한적인 사실또는. 다른 뇌 영역의 재료 신중 시냅 토좀 (synaptosome) 또는 PSD 풍부한 분획을 제조 한 후, 청각 피질의 양을 조정한다 (3.1.1 참조.). 다음과 같은 마우스에서 새로 제조 된 뇌 영역의 일반적인 무게는 다음과 같습니다 청각 피질 (AC) : ~ 50 mg의; 해마 (HIP) ~ 90 mg의; 선조체 (STR) : ~ 120 mg의 전두엽 피질 (FC) : ~ 100 mg의. 2.3 절에 설명 된 PSD 농축 방법은 약 1,500 가지 단백질 번의 동물 (표 1)의 수준에서의 뇌 영역 당 약 250 가지 포스 포 펩티드의 식별을 허용했다. 24 시간 첫 훈련 후 단백체 분석은 확인 된 단백질의 7.3 % 및 포스 포 펩타이드의 5.8 %가 유의 한 (P &lt;0.05) 순진한 컨트롤 (표 1)에 비해 자신의 시냅스 식의 양적 변화를 보였다 것으로 나타났습니다. 다운 REGULA에 대한 눈에 띄는 경향시냅스 비계의 기는 FMTD 학습의 초기 단계 시냅스 아키텍처의 발음 재 배열을 가리 수 있습니다. 단지 22 %가 두 개 이상의 뇌 영역에서 조절되는 것으로 밝혀졌다 반면 조절 단백질의 대부분이 뇌 영역 특정 방법으로 변경 하였다. 여섯 선택된 예는도 4에 도시되어있다. &quot;에서 RhoA 시그널링&quot;, &quot;노치 신호 전달&quot;클라 매개 엔도 시토 시스 시그널링 &quot;,&quot;축삭 지침 시그널링 &quot;,&quot;칼슘 신호 전달 &quot;IPA에 의해 복잡한 결과를 메타 분석은 다음과 같은 정식 경로의 특정 참여 / 조작에 대한 증거를 제공 &quot;,&quot;상피 Adherens 접합의 리모델링 &quot;,&quot;글루타메이트 수용체 신호 전달 &quot;,&quot;GABA 수용체 신호 전달 &quot;,&quot;도파민 수용체 신호 전달 &#39;과&#39;시냅스 장기 증강 &quot;. (그림 5)와 관련된 전두엽 피질이 크게 부풀려 생물학적 과정을 밝혔다. 이온 수송, 번역, mRNA의 전송을 포함하는 청각 피질 생물학적 과정에서 단백질 수송 및 학습에 띄게되었다. 해마의 단백질 분획의 분석은 상당히 이온 전달, 세포주기, 번역, 인산화 및 신경계 발달과 관련된 농축 처리를 검출한다. 선조체에서 mRNA의 운송, 소포 매개 교통, axonogenesis, 단백질 분해, 단백질 수송 및 세포 내 이입을 포함한 생물학적 과정이 발견되었다 부풀려. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig1.jpg" /> 그림 1 : 체계적인 Workflo방법 론적 접근의 w 이 그림은 개략적으로 뇌 영역 특정 시냅스 단백질 조성물의 높은 해상도 정량 프로파일의 흐름을 요약 한 것입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig2.jpg" /> 그림 2 : FM 톤 차별 작업에서 마우스의 성능의 예. 동물 안타의 증가 속도 (파란색 곡선)과 훈련의 과정에서 잘못된 경보의 감소 속도 (검정 곡선)을 보여줍니다. 중요한 판별 네번째 세션에서 일어난다. 오차 막대는 SEM로 제공됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig2large.jpg" target="_blank">고맙다을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 게르 버전입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig3.jpg" /> 그림 3 : 시냅 및 PSD 풍부한 분수의 준비. A : 시냅 준비. B : PSD 농축 분획 제제. 두 그림은 뇌 조직에서 시냅 토좀 (synaptosome) 또는 대안 PSD 농축 분획 제제의 상세한 워크 플로우를 설명합니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig4.jpg" /> 그림 4 : 선정 된 양적 프로테옴 결과. 선택된 단백질의 상대적 시냅스 존재비는 마우스 TRA 사이 비교(AV N = 6) FMTD 태스크와 나이브 대조군 마우스 (NV, N = 6) 24 시간 후 1 트레이닝 세션 리트. 풍부한 값은 단백질의 세 가장 강렬한 펩티드의 피크 면적의 중앙값으로서 계산 하였다. 중요한 풍부 변경 (AV / NV; t 테스트)와 단백질은 플롯 내에서 표시됩니다 : * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.005. 오차 막대는 SD로 제공됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig5.jpg" /> 그림 5 : GeneCodis / Gephi에 의해 정면 코어 텍스에 대한 생물 진학의 시각화. 최소 3 단백질 번호 &quot;생물학적 과정&quot;에 관련된 유전자 온톨로지 (GO) 데이터베이스 (http://geneontology.org)의 중요한 용어<html> 여기에 표시됩니다. 노드 GO 조건을 대표하는 노드의 크기, 특정 노드의 연결 라인 폭 및 개수는 다른 노드와이 GO 용어 공유 단백질의 수를 도시한다. 때문에 Gephi의 &quot;강제 아틀라스&quot;방법, 관련 노드는 서로 밀접하게 클러스터링됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 뇌 영역 </td><td> AC </td><td> FC </td><td> 잘 알고 있기 </td><td><html> 000 &quot;얼굴 =&quot;돋움 &quot;크기 =&quot;3 &quot;&gt; STR </td><td> Σ </td></tr><tr><td> 확인 된 단백질 </td><td> 1,435 </td><td> 1,758 </td><td> 1,572 </td><td> 1,507 </td><td> 6272 </td></tr><tr><td> 규제 단백질 (P &lt;0.05) </td><td> 59 </td><td> (130) </td><td> (162) </td><td> (108) </td><td>얼굴 = &quot;돋움&quot;크기 = &quot;3&quot;&gt; (459) </td></tr><tr><td> ↑ AV / NV </td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> (76) </td><td> (35) </td><td> (123) </td></tr><tr><td> ↓의 AV / NV </td><td> (51) </td><td> (126) </td><td> (86) </td><td> 73 </td><td> (336) </td></tr><tr><td> 확인 phosphomoti<html> FS </td><td> 197 </td><td> (361) </td><td> (273) </td><td> (278) </td><td> 1,109 </td></tr><tr><td> 규제 phosphomotifs (P &lt;0.05) </td><td> 8 </td><td> (22) </td><td> (21) </td><td> (14) </td><td> (65) </td></tr><tr><td> ↑ AV / NV </td><td> 4 </td><td>00000 &quot;얼굴 =&quot;돋움 &quot;크기 =&quot;3 &quot;&gt; (17) </td><td> (5) </td><td> 9 </td><td> (35) </td></tr><tr><td> ↓의 AV / NV </td><td> 4 </td><td> (5) </td><td> (16) </td><td> (5) </td><td> (30) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 단백체 결과의 요약. 이 표는 훈련 된 쥐의 대표 단백체 실험 요약 (AV를 N = 6) 자신의 순진한 컨트롤에 비해 첫 훈련 후 24 시간 (NV, N = 6). 그만큼459 조절 단백질의 합은 중복 규정을 포함한다. 283 다른 규정은 뇌의 특정로 결정 하였다. 구체적으로, 57 단백질이 뇌 영역에서 규제, 18 단백질 규정은 세 가지 뇌 영역에서 발견 된 만 2 단백질은 네 개의 연구 뇌 영역에서 조절된다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 오류 허용 오차 </td></tr><tr><td> 전구체 질량 (푸리에 변환 질량 분석) </td><td> 10 ppm의 </td></tr><tr><td> 조각 이온 질량 (선형 이온 트랩) </td><td> 0.6 다 </td></tr><tr><td> 펩타이드 당 최대 놓친 분열 </td><td> 삼 </td></tr><tr><td> 수정 수정 </td></tr><tr><td> 용의 젤 소화 샘플 </td><td> 시스테인의 Carbamidomethylation </td></tr><tr><td> 대한 샘플에-솔루션 소화 </td><td> Methylthiolatio시스테인의 N </td></tr><tr><td> 변수 수정 </td><td> 메티오닌의 산화 </td></tr><tr><td></td><td> 아스파라긴 및 / 또는 글루타민의 Deamidations </td></tr><tr><td> 데이터 베이스 </td><td> Uniprot / Sprot </td></tr><tr><td> 분류 </td><td> 쥐 </td></tr><tr><td> 통계 식별-허용 설정 </td></tr><tr><td> 드 노보 평균 지방 신뢰 (ALC) </td><td> &gt; 50 % </td></tr><tr><td> 펩타이드 거짓 검색 속도 (FDR, 동부 표준시에 따라. 디코이 융합) </td><td> &lt;1 % </td></tr><tr><td> 단백질 유의성 (-10logP는 변형 T 테스트 기준) </td><td> &gt; (20) </td></tr><tr><td> 독특한 펩타이드 / 단백질 </td><td> ≥ 1 </td></tr><tr><td> 정량 설정 : </td></tr><tr><td> 정량하는 경우에 사용되는 펩티드 : </td></tr><tr><td> 펩타이드의 의미 (-10logP) </td><td> &gt; (30) </td></tr><tr><td> 의 펩타이드 식별 </td><td> 샘플의 ≥ 50 % </td></tr><tr><td> 펩타이드 신호 품질 </td><td> &gt; 1 </td></tr><tr><td> 펩타이드 평균 면적 </td><td> &gt; 1E5 </td></tr><tr><td> 펩타이드 보유 시간 허용 </td><td> &lt;5 분 </td></tr><tr><td> 표준화 </td><td> 총 이온 전류 (TIC) </td></tr></tbody></table> 표 2 : 단백질 식별을위한 설정 (단계 4.2.2).

시냅스 가소성과 기억을 제어하는 분자와 경로를 식별하는 것은 여전히 신경 과학의 주요 과제입니다. 여기에서는 청각 학습 패러다임에서 학습 및 기억 통합 중 시냅스의 분자 재편성에 관여하는 것으로 추정되는 시냅스 단백질의 상대적 정량화를 다루는 워크플로우에 대해 설명합니다.

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

이 프로테오믹스 접근법의 전반적인 목표는 학습 및 기억 형성 후 시냅스에서 일어나는 분자적 재구성을 특성화하여 기본적인 메커니즘과 신호 전달 경로를 이해하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 가설 없이 접근할 수 있다는 점으로, 이를 통해 시냅스 프로테옴 내의 번역 후 수정 및 변형을 대규모로 정량화하고 특성화할 수 있습니다. 당사의 확립된 워크플로우를 통해 특정 분자적 변화와 특정 행동 사이의 상관관계를 분석할 수 있습니다.학습과 기억 형성은 시냅스 효율의 변화에 기반하므로, 단백질체 연구는 뇌 조직 균질액보다 시냅토솜과 같은 시냅스 구조의 분석에 더 집중해야 합니다. 단백질체 결과는 매우 복잡한 데이터 세트를 나타내므로 생물정보학적 처리가 필요합니다. 방음실 내의 어두운 셔틀 박스에 테스트 마우스를 넣어 훈련을 시작하십시오.청각 판별 학습을 위해 완전히 컴퓨터로 제어되는 학습 일정을 사용하십시오. 훈련 세션을 시작하기 전, 3분 동안 정적을 유지하는 습관화 기간을 갖습니다. Go 시도 시, 동물은 톤 제시 후 6초 이내에 허들을 통과해야 성공(hit)으로 기록됩니다.no-go 시행 동안 동물은 6초간의 톤 제시 시간 동안 셔틀 박스의 현재 구획에 머물러야 합니다. 의사 무작위 순서로 30회의 go 시행과 30회의 no-go 시행을 수행하며, 시행 간 간격은 20초로 설정하여 한 세션이 60회 시행으로 구성되고 약 25분간 지속되도록 합니다. 모든 시행이 완료되면 훈련된 마우스를 희생 시점까지 홈 케이지로 복귀시킵니다.마우스를 희생시킨 후 뇌를 적출하고, 혈관과 표면의 형태를 포함한 시각적 지표를 이용하여 청각 피질의 위치를 파악합니다. 그다음 메스와 바늘을 사용하여 청각 피질을 직사각형 모양의 조직 블록으로 양측에서 절제합니다. 시신경교차(chiasma opticum)를 지표로 삼아, Bregma 3.56 및 1.54 사이의 뇌 슬라이스로 전두엽 피질을 절제합니다.Bregma 1.54에서 0.5 사이의 뇌 슬라이스로 선조체를 박리하십시오. 그리고 피질 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 소뇌를 통해 바늘로 뇌를 고정하고 후두엽부터 피질을 풀어내어 해마를 박리하십시오.분리한 뇌 샘플을 액체 질소로 급속 냉동합니다. 얼음처럼 차가운 Buffer A 1 mL가 들어 있는 균질화 용기에 분리된 뇌 조직을 옮겨 시냅토좀 정제를 시작합니다. 그다음 약 12회 스트로크를 사용하여 900 RPM으로 조직을 균질화합니다. 샘플을 1,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 상층액을 회수합니다. 침전물을 이전과 동일하게 다시 균질화하고, 상층액들을 합칩니다. 합쳐진 상층액을 12,000 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다. 침전물을 1 mL의 균질화 완충액에 재현탁하고 900 RPM으로 6회 스트로크하여 균질화한 후, 1,200 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다.P2 펠렛을 생성하기 위한 원심분리 과정 동안 초원심분리관에 수크로스 단계 구배를 준비합니다. 1.0 M 수크로스 완충액 2.5 mL를 먼저 넣고, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 1.2 M 수크로스 완충액 1.5 mL를 층 분리하여 쌓습니다. 원심분리가 끝난 후, P2 펠렛에 0.32 M 수크로스 완충액 0.5 mL를 추가합니다.그 다음 6회 반복하여 다시 균질화합니다. 균질화된 분획을 밀도 구배 상단에 적재합니다. 적재된 구배 튜브를 스윙 버킷 로터(swinging bucket rotor)에 넣고 초원심분리기로 85,000 ×g에서 2시간 동안 원심분리합니다.원심 분리가 완료되면, 1.0 molar sucrose 버퍼와의 계면 물질을 포함하여 상층의 0.32 molar sucrose 층을 제거합니다. 1.0에서 1.2 molar sucrose 버퍼 계면에 형성된 시냅토솜(synaptosomes)을 수집합니다. 시냅토솜 분획에 0.32 molar sucrose 버퍼를 1:1 비율로 첨가합니다.주의 깊게 혼합한 후 150,000 ×g에서 1시간 동안 원심분리합니다. 시냅토솜은 펠렛(pellet) 형태로 존재하며, 추가 처리를 위해 버퍼에 다시 현탁할 수 있습니다. 초음파 세척기 내 얼음 위에서 1시간 동안 배양하여, 동물의 각 뇌 영역에서 얻은 시냅토솜을 20~50 µL의 8 M urea에 녹입니다.최종 농도가 2 M urea가 되도록 1% 제거 가능한 세제로 희석합니다. SDS-PAGE를 사용하여 상대적인 단백질 양을 결정한 후, 각 샘플의 남은 양 중 1/3을 새 튜브에 피펫으로 옮깁니다. 2 mM DTT와 25 mM 탄산수소암모늄을 첨가하고 샘플을 부드럽게 볼텍싱하여 용액 내 소화를 수행합니다.샘플을 20 °C에서 45분 동안 환원시킵니다. 시스테인 잔기를 카바미도메틸화하기 위해 10 mM iota acedomide를 첨가하고 혼합합니다. 20 °C의 암실에서 30분 동안 배양합니다.마지막으로, 1 µL의 trypsin 스톡 용액을 첨가하고 20 °C에서 12시간 동안 배양합니다. 산-분해성 계면활성제를 제거하기 위해, trifluoroacetic acid를 최종 농도 1%가 되도록 첨가하고 20 °C에서 1시간 더 배양합니다. 샘플을 16,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리한 후, 상층액을 조심스럽게 수집합니다.고체상 추출 컬럼을 랙에 배치하고 2 mL의 메탄올로 매트릭스를 평형화합니다. 세척 후, Buffer B 2 mL를 추가로 넣고 시료를 로딩합니다. Buffer B로 3회 세척한 후, 70% acetonitrile 및 0.1% triflouroacetic acid 200 µL를 첨가하여 펩타이드를 용출합니다.그 다음, 정제된 샘플을 진공 원심분리기에서 건조합니다. 이 예시에서, FM 톤 식별 과제로 훈련된 동물들은 훈련 세션이 진행됨에 따라 정답률(hit rate)은 증가하고 오경보율(false alarm rate)은 감소하는 양상을 보입니다. 유의미한 식별은 네 번째 세션부터 나타납니다.FM 톤 식별 과제를 훈련한 생쥐와 훈련 전 대조군 생쥐를 대상으로 첫 훈련 세션 24시간 후 선택된 단백질의 상대적 시냅스 풍부도를 비교합니다. 훈련 후, 연구된 모든 영역에서 CYFP2 단백질 수치가 변화합니다. 동물들에게서 개체 내 변동성이 자주 나타난다는 점을 유의하십시오.따라서 연구 시 잘 매칭된 동물 그룹의 생물학적 반복 수를 최소 5회 이상 포함하는 것이 매우 권장됩니다. 일단 이 기술이 확립되면 다른 종으로도 쉽게 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 이 기술은 단일 초파리 뇌에서 학습 의존적인 단백질 발현 변화를 모니터링하는 데 사용되었습니다.

high-resolution-quantitative-synaptic-proteome-profiling-mouse-brain

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

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