청각 차별 학습 한 후 마우스 뇌 영역의 높은 해상도 양적 시냅틱 프로테옴 프로파일

이 프로테오믹스 접근법의 전반적인 목표는 학습 및 기억 형성 후 시냅스에서 일어나는 분자적 재구성을 특성화하여 기본적인 메커니즘과 신호 전달 경로를 이해하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 가설 없이 접근할 수 있다는 점으로, 이를 통해 시냅스 프로테옴 내의 번역 후 수정 및 변형을 대규모로 정량화하고 특성화할 수 있습니다. 당사의 확립된 워크플로우를 통해 특정 분자적 변화와 특정 행동 사이의 상관관계를 분석할 수 있습니다.

학습과 기억 형성은 시냅스 효율의 변화에 기반하므로, 단백질체 연구는 뇌 조직 균질액보다 시냅토솜과 같은 시냅스 구조의 분석에 더 집중해야 합니다. 단백질체 결과는 매우 복잡한 데이터 세트를 나타내므로 생물정보학적 처리가 필요합니다. 방음실 내의 어두운 셔틀 박스에 테스트 마우스를 넣어 훈련을 시작하십시오.

청각 판별 학습을 위해 완전히 컴퓨터로 제어되는 학습 일정을 사용하십시오. 훈련 세션을 시작하기 전, 3분 동안 정적을 유지하는 습관화 기간을 갖습니다. Go 시도 시, 동물은 톤 제시 후 6초 이내에 허들을 통과해야 성공(hit)으로 기록됩니다.

no-go 시행 동안 동물은 6초간의 톤 제시 시간 동안 셔틀 박스의 현재 구획에 머물러야 합니다. 의사 무작위 순서로 30회의 go 시행과 30회의 no-go 시행을 수행하며, 시행 간 간격은 20초로 설정하여 한 세션이 60회 시행으로 구성되고 약 25분간 지속되도록 합니다. 모든 시행이 완료되면 훈련된 마우스를 희생 시점까지 홈 케이지로 복귀시킵니다.

마우스를 희생시킨 후 뇌를 적출하고, 혈관과 표면의 형태를 포함한 시각적 지표를 이용하여 청각 피질의 위치를 파악합니다. 그다음 메스와 바늘을 사용하여 청각 피질을 직사각형 모양의 조직 블록으로 양측에서 절제합니다. 시신경교차(chiasma opticum)를 지표로 삼아, Bregma 3.56 및 1.54 사이의 뇌 슬라이스로 전두엽 피질을 절제합니다.

Bregma 1.54에서 0.5 사이의 뇌 슬라이스로 선조체를 박리하십시오. 그리고 피질 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 소뇌를 통해 바늘로 뇌를 고정하고 후두엽부터 피질을 풀어내어 해마를 박리하십시오.

분리한 뇌 샘플을 액체 질소로 급속 냉동합니다. 얼음처럼 차가운 Buffer A 1 mL가 들어 있는 균질화 용기에 분리된 뇌 조직을 옮겨 시냅토좀 정제를 시작합니다. 그다음 약 12회 스트로크를 사용하여 900 RPM으로 조직을 균질화합니다. 샘플을 1,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후 상층액을 회수합니다. 침전물을 이전과 동일하게 다시 균질화하고, 상층액들을 합칩니다. 합쳐진 상층액을 12,000 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다. 침전물을 1 mL의 균질화 완충액에 재현탁하고 900 RPM으로 6회 스트로크하여 균질화한 후, 1,200 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다.

P2 펠렛을 생성하기 위한 원심분리 과정 동안 초원심분리관에 수크로스 단계 구배를 준비합니다. 1.0 M 수크로스 완충액 2.5 mL를 먼저 넣고, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 1.2 M 수크로스 완충액 1.5 mL를 층 분리하여 쌓습니다. 원심분리가 끝난 후, P2 펠렛에 0.32 M 수크로스 완충액 0.5 mL를 추가합니다.

그 다음 6회 반복하여 다시 균질화합니다. 균질화된 분획을 밀도 구배 상단에 적재합니다. 적재된 구배 튜브를 스윙 버킷 로터(swinging bucket rotor)에 넣고 초원심분리기로 85,000 ×g에서 2시간 동안 원심분리합니다.

원심 분리가 완료되면, 1.0 molar sucrose 버퍼와의 계면 물질을 포함하여 상층의 0.32 molar sucrose 층을 제거합니다. 1.0에서 1.2 molar sucrose 버퍼 계면에 형성된 시냅토솜(synaptosomes)을 수집합니다. 시냅토솜 분획에 0.32 molar sucrose 버퍼를 1:1 비율로 첨가합니다.

주의 깊게 혼합한 후 150,000 ×g에서 1시간 동안 원심분리합니다. 시냅토솜은 펠렛(pellet) 형태로 존재하며, 추가 처리를 위해 버퍼에 다시 현탁할 수 있습니다. 초음파 세척기 내 얼음 위에서 1시간 동안 배양하여, 동물의 각 뇌 영역에서 얻은 시냅토솜을 20~50 µL의 8 M urea에 녹입니다.

최종 농도가 2 M urea가 되도록 1% 제거 가능한 세제로 희석합니다. SDS-PAGE를 사용하여 상대적인 단백질 양을 결정한 후, 각 샘플의 남은 양 중 1/3을 새 튜브에 피펫으로 옮깁니다. 2 mM DTT와 25 mM 탄산수소암모늄을 첨가하고 샘플을 부드럽게 볼텍싱하여 용액 내 소화를 수행합니다.

샘플을 20 °C에서 45분 동안 환원시킵니다. 시스테인 잔기를 카바미도메틸화하기 위해 10 mM iota acedomide를 첨가하고 혼합합니다. 20 °C의 암실에서 30분 동안 배양합니다.

마지막으로, 1 µL의 trypsin 스톡 용액을 첨가하고 20 °C에서 12시간 동안 배양합니다. 산-분해성 계면활성제를 제거하기 위해, trifluoroacetic acid를 최종 농도 1%가 되도록 첨가하고 20 °C에서 1시간 더 배양합니다. 샘플을 16,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리한 후, 상층액을 조심스럽게 수집합니다.

고체상 추출 컬럼을 랙에 배치하고 2 mL의 메탄올로 매트릭스를 평형화합니다. 세척 후, Buffer B 2 mL를 추가로 넣고 시료를 로딩합니다. Buffer B로 3회 세척한 후, 70% acetonitrile 및 0.1% triflouroacetic acid 200 µL를 첨가하여 펩타이드를 용출합니다.

그 다음, 정제된 샘플을 진공 원심분리기에서 건조합니다. 이 예시에서, FM 톤 식별 과제로 훈련된 동물들은 훈련 세션이 진행됨에 따라 정답률(hit rate)은 증가하고 오경보율(false alarm rate)은 감소하는 양상을 보입니다. 유의미한 식별은 네 번째 세션부터 나타납니다.

FM 톤 식별 과제를 훈련한 생쥐와 훈련 전 대조군 생쥐를 대상으로 첫 훈련 세션 24시간 후 선택된 단백질의 상대적 시냅스 풍부도를 비교합니다. 훈련 후, 연구된 모든 영역에서 CYFP2 단백질 수치가 변화합니다. 동물들에게서 개체 내 변동성이 자주 나타난다는 점을 유의하십시오.

따라서 연구 시 잘 매칭된 동물 그룹의 생물학적 반복 수를 최소 5회 이상 포함하는 것이 매우 권장됩니다. 일단 이 기술이 확립되면 다른 종으로도 쉽게 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 이 기술은 단일 초파리 뇌에서 학습 의존적인 단백질 발현 변화를 모니터링하는 데 사용되었습니다.