청각 차별 학습 한 후 마우스 뇌 영역의 높은 해상도 양적 시냅틱 프로테옴 프로파일

이 단백질체학 접근법의 전반적인 목표는 기본 메커니즘과 신호 전달 경로를 이해하기 위해 학습 및 기억 형성 후 시냅스에서 분자 재조직을 특성화하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 가설이 없는 접근 방식으로, 시냅스 단백질체 내에서 번역 후 및 수정의 대규모 정량화 및 특성화를 가능하게 합니다. 우리가 확립한 워크플로우는 특정 분자 변화와 특정 행동 사이의 상관 관계를 허용합니다.

학습과 기억 형성은 시냅스 효능의 변화를 기반으로 하므로 단백질체학 연구는 뇌 조직의 균질화보다 시냅토솜과 같은 시냅스 구조 분석에 더 중점을 두어야 합니다. 단백질체학 결과는 매우 복잡한 데이터 세트를 나타내므로 생물 정보 처리가 필요합니다. 테스트 마우스를 방음실 내의 희미한 불이 켜진 셔틀 박스에 넣어 훈련을 시작합니다.

청각 차별 학습을 위해 완전히 컴퓨터로 제어되는 학습 일정을 사용합니다. 훈련 세션을 시작하기 전에 3분 동안 침묵하는 습관화 기간으로 시작하십시오. 바둑 시험 중에 동물은 음색 발표 후 6초 이내에 장애물을 넘어야 안타를 기록해야 합니다.

노고(no-go) 실험 동안, 동물은 6초간의 톤 발표 동안 셔틀 박스의 현재 칸에 남아 있어야 합니다. 30회의 시행 및 30회의 노고(no-go) 시행을 의사 무작위 순서로 수행하며, 한 세션은 60번의 시행으로 구성되고 약 25분 동안 지속되도록 20초의 시행 간 간격을 두고 수행합니다. 모든 시험이 수행되면 희생 될 때까지 훈련 된 마우스를 가정용 케이지로 되돌립니다.

쥐를 희생하고 뇌를 제거한 후 혈관과 표면의 모양을 포함한 시각적 랜드마크를 사용하여 청각 피질의 위치를 파악합니다. 그런 다음 메스와 바늘을 사용하여 청각 피질을 직사각형 조직 블록으로 양측으로 절개합니다. chiasma opticum을 이정표로 사용하여 전두엽 피질을 Bregma 3.56과 1.54 사이의 뇌 절편으로 해부합니다.

선조체를 Bregma 1.54와 0.5 사이의 뇌 절편으로 해부합니다. 그리고 조심스럽게 피질 조직을 제거하십시오. 소뇌를 통해 바늘로 뇌를 안정시키고 후두엽에서 시작하여 피질을 풀어 해마를 해부합니다.

충격-동결로 해부된 뇌 샘플을 액체 질소로 만들었습니다. 절개된 뇌 조직을 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 완충액 A를 포함하는 균질화 혈관으로 옮겨 시냅토솜 정제를 시작한 다음 약 12번의 스트로크를 사용하여 900RPM에서 조직을 균질화합니다. 1, 000 시간 G에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리하십시오.

원심분리 후 상등액을 유지하십시오. 이전과 같이 펠릿을 재균질화하고 상등액을 결합합니다. 12, 균질화 완충액의 1 밀리리터에 있는 펠릿을 G.Re 중단하고 1, 20 분 동안 200 시간 G에 원심분리에 선행된 900 분당 회전수에 6개의 치기로 20 분 동안 결합한 상등액을 회전시키십시오.

P2 펠릿을 생산하기 위한 원심분리 중에 초원심분리 튜브에서 자당 스텝 그래디언트를 준비합니다. 2.5 밀리리터의 1.0 몰 자당 완충액으로 시작한 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 1.5 밀리리터의 1.2 몰 자당 완충액을 sublayer합니다. 원심분리 후 0.5밀리리터의 0.32몰 자당 완충액을 P2 펠릿에 추가합니다.

그런 다음 6개의 스트로크를 사용하여 다시 균질화합니다. gradients 위에 homogenized fractions를 불러옵니다. 로드된 그래디언트를 스윙 버킷 로터에 넣은 다음 초원심분리기에서 2시간 동안 85, 000회 G로 회전합니다.

원심분리가 완료되면 1.0 몰 자당 완충액에 대한 계면의 물질을 포함하여 상단 0.32 몰 자당 층을 버립니다. 1 내지 1.2 몰 자당 완충액 계면에서 시냅토솜을 수집합니다. 0.32 몰 자당 완충액을 1.1 비율로 시냅토솜 분획에 추가합니다.

조심스럽게 섞고 1 시간 동안 150, 000 번 G로 회전시킵니다. 시냅토솜은 펠릿 내에 있으며, 추가 처리를 위해 완충액에 다시 현탁할 수 있습니다. 동물의 각 뇌 영역의 시냅토솜을 20-50 마이크로 리터의 8 몰 요소에 녹여 초음파 욕조에서 1 시간 동안 얼음 위에서 배양합니다.

2개의 몰 요소의 최종 농도를 보장하기 위해 제거 가능한 세제 1%로 희석합니다. SDS-PAGE 피펫을 사용하여 상대적인 단백질 양을 측정한 후 각 샘플의 나머지 부분 중 1/3을 새 튜브에 넣습니다. 2 밀리몰 DTT와 25 밀리몰 중탄산암모늄을 첨가하여 용액 내 분해를 수행하고 샘플을 부드럽게 와류로 만듭니다.

섭씨 20도에서 45분 동안 샘플을 줄입니다. 카르바미도메틸레이트 시스테인 잔기에 10밀리몰의 이오타 아세도마이드를 첨가하고 혼합합니다. 섭씨 20도의 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.

마지막으로 1마이크로리터의 트립신 스톡 용액을 넣고 섭씨 20도에서 12시간 동안 배양합니다. 산을 절단할 수 있는 세제를 제거하려면 트리플루오로아세트산을 최종 농도 1%까지 추가하고 섭씨 20도에서 한 시간 더 배양합니다. 16에 표본을 원심 분리하기 후에, 10 분 동안 000 시간 G는, 주의깊게 상등액을 모읍니다.

고체상 추출 컬럼을 랙에 놓고 매트릭스를 2밀리리터의 메탄올로 평형을 이룹니다. 세척 후 2ml의 버퍼 B를 추가로 추가하고 샘플을 로드합니다. 버퍼 B로 3회 세척한 후 200마이크로리터의 70% 아세토니트릴과 0.1% 트리플루오르로아세트산을 첨가하여 펩타이드를 용리시킵니다.

그런 다음 정제된 샘플을 진공 원심분리기에서 건조시킵니다. 이 예에서 FM 톤 판별 작업에 대해 훈련된 동물은 훈련 세션 동안 적중률이 증가하고 오경보율이 감소하는 것을 보여줍니다. 네 번째 세션에서 심각한 차별이 발생합니다.

FM 톤 판별 작업에 대해 훈련된 마우스와 첫 번째 교육 세션 후 24시간이 지난 순진한 대조군 마우스 간에 선택된 단백질의 상대적 시냅스 풍부도를 비교합니다. 훈련 후, CYFP2 단백질의 수치는 연구된 모든 영역에서 변경됩니다. 동물들은 종종 개체 내에서 종종 변동성을 보인다는 것을 잊지 마십시오.

따라서 잘 일치하는 동물 그룹의 생물학적 복제물을 최소 5개 이상 연구에 포함하는 것이 좋습니다. 일단 확립되면 이 기술은 다른 종에 쉽게 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 단일 초파리 뇌에서 학습 의존적 단백질 발현 변화를 모니터링하는 데 사용되었습니다.