Name: 췌 장 이식 수정된 팔목 기술을 사용 하 여 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: 학습하세요 마우스 췌장 이식 모델에서 비봉합 커프 기술을 이용한 혈관 문합법과 허혈-재관류 손상 연구 방법을. 이 기법은 이식 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 의료 대학 인스브루크의 #2008-1-596 보조금과 #UNI-0404/1956의는 "Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF)" (https://www.tirol.gv.at/en/), 그리고 부여 #2013-042018 "MUI 시작 Förderungsprogramm"의 의해 지원 되었다.

Alloimmune 응답을 방지 하 고 엄격 하 게 국 소 빈 혈 reperfusion 상해 관련 이식 피해 조사, syngeneic 기증 받는 쌍을 사용 해야 합니다. 이 프로토콜, 남성 C57BL6 (h 2b) 10-12 주 된 마우스 무게 26 ~ 28 g 크기 일치 기증자 받는 쌍으로 사용 되었다. 모든 장벽 병원 체 무료 시설에서 지 내게 했다 동물과 "교장의 실험실 동물 케어" 의료 연구와 "가이드에는 관리와 사용의 실험실 동물"에 대 한 국가 사회에 의해 공식화에 따라 인간의 치료를 받은 과학의 국가 아카데미에 의해 준비와 건강의 국가 학회 (NIH 간행물 번호 86-23, 1985 개정)에 의해 출판. 교육, 과학, 그리고 문화의 오스트리아 내각이이 원고 (BMWF-66.011/0056-II/3b/2011)에 설명 된 실험을 승인 했다.
1. 췌 장 조달
<ol>
	<li>Xylazine (5 mg/kg 체중)와 케 타 민 (100mg/kg 체중) 27-게이지 (G) 바늘을 사용 하 여의 복 (i.p.) 주입으로 기증자 동물 anesthetize</li>
	<li>전기 면도기를 사용 하 여 복 부에 머리를 면도 하 고 테이프의 가닥으로 부정사 위치에 수술 필드에 마우스를 수정.</li>
	<li>세 번을 액체에 젖은 gauzes 요원 필드를 제거 하십시오.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 양자 subcostal 확장명이 중간 복 부 절 개를 수행 합니다. 부드럽게 exteriorize 메 마른 코 튼 스틱, 왼쪽에 내장 하 고 moistened 거 즈에서 그들을 포장. 다음 단계에 대 한 복 부 구멍의 최대 노출을 제공 하는 모기 클램프와 cranially는 xyphoid를 들어올립니다.</li>
	<li>19 G 바늘을 사용 하 여, 주사는 살 균의 400 µ L 1:4 헤 파 린 나트륨 염화 물 솔루션 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)으로 heparinisation. 바늘을 제거한 후 exsanguination 대동맥의 transecting에 의해 동물을 안락사.</li>
	<li>부드럽게 곡선된 팁 집게를 사용 하 여 섬유 조직 분리 하 여 우수한 mesenteric 동맥의 기원과 오른쪽 신장 동맥 사이 복 부 대동맥 해 부. 대동맥을 훼손 하 고 8/0 실크 합자와 넥타이.</li>
	<li>Postpyloric 십이지 장과 간 hilum 사이 hepatoduodenal 인 대를 식별 합니다. 원심 합자, 후 낭 성 덕트의 입구 아래 담 즙 덕트를 분할 부드럽게 해 부 하 고 받는 사람에는 문 합을 수행 하기 위한 충분 한 길이를 최대한 distally 포털 정 맥 transect.</li>
	<li>이전 합자에서 시작 하는 복 부 대동맥 해 부 퉁 명 스럽게 곡선된 팁 집게를 사용 하 여 (단계 1.6 참조). Periaortic 조직 곡선된 팁 집게를 사용 하 여 훼손, 그것 8/0 실크 합자와 고가 위로 transect.<ol>
		<li>바이 폴라 포 셉을 사용 하 여, 모든 허리 가지 응고 하 고, 횡 경 막에 최대한 가깝게 혈관 문 합에 대 한 충분 한 길이 제공 하기 위해 대동맥이 위 transect. 마지막으로, 왼쪽된 신장 동맥 위에 이미 묶인된 대동맥 transect.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>문맥에서 오는 분명 유출 될 때까지 복 부 대동맥을 통해 antegrade 패션에서 4 ° C 히스티딘 트립토판 ketoglutarate 관류 솔루션의 5 mL와 함께 19 G 주사기 췌 장 perfuse. 부 종 형성을 방지 하기 위해 낮은 압력을 적용 합니다. 참고: 복구 된 이식의 따뜻한 허 혈 성 저하에 의해 어떤 편견을 피하기 위해 신속 하 고 표준화 된 방식에서 1.9를 단계 1.5를 수행 합니다.</li>
	<li>메 마른 면 지팡이 사용 하 여 복 막 구멍으로는 내장을 교체 합니다.</li>
	<li>곡선된 팁 집게를 사용 하 여, stepwise Treitz의 인 대를 도달할 때까지 앞으로 이동 하 고 postpyloric 십이지에서 시작 췌를 구분 합니다. 이러한 단계에 대 한 췌 장 및 십이지 장 벽 사이 avascular 결합 조직 영역을 식별 합니다.<ol>
		<li>퉁 명 스럽게 췌 장 그리고 십이지 장 사이 브리징 혈관을 분리 곡선된 팁 집게를 사용 하 여이 분야를 해 부. 각 격리 된 혈관 구조 8/0 실크 합자를 통과 하 고 넥타이.</li>
		<li>마지막으로,가 위 십이지 장 벽 쪽으로 혈관 구조 transect. 같은 패션에는 mesentery, 가로 장 및 위장 췌 구분 8/0 실크 봉합 사를 사용 합니다. 참고:이 절차 동안, choledocho 췌 장 덕트는 출혈 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gastrosplenic 인 대 위, 및 짧은 위 가지 cranially 위장을 해제 하 고가 위로 절단 하 여 비장에서 실행을 식별 합니다. 복구 된 이식에 연결 된 비장을 둡니다. 참고: 지속적으로 얼음에 저장 된 차가운 히스티딘 트립토판 ketoglutarate 관류 솔루션 19 G 바늘 10 mL 주사기를를 사용 하 여 췌 장 이식 rewarming 최소화, 관개.</li>
	<li>마지막으로, 겸 자와 함께 비장을 파악 하 여 췌 기증자 사이트 (그림 1B)에서 제거 하 고 받는 사람에 전송.<ol>
		<li>또는, 가혹한 국 소 빈 혈 reperfusion 상해를 트리거하려면 받는 사람 동물에 이식 하기 전에 16 h에 대 한 살 균, 4 ° C 관류 솔루션에는 이식을 저장 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 받는 사람 준비
<ol>
	<li>Xylazine (5 mg/kg 체중)와 케 타 민 (100mg/kg 체중) 27g 바늘을 사용 하 여의 i.p. 주사와 받는 사람 동물 anesthetize</li>
	<li>면도 전기 면도기를 사용 하 여 오른쪽 측면 자 궁 경부 지역 고 부정사 위치에 수술 필드에 마우스를 놓습니다. 수정 테이프의 가닥을 사용 하 여 마우스. 호흡을 손상 하는 피하기 위해 앞 다리를 잡아당기고 하지 마십시오.</li>
	<li>액체에 젖은 gauzes를 사용 하 여 시간 요원 필드 3 스크럽.</li>
	<li>바로 paramedian, 오른쪽 mandible 각도 jugular 절 개에서 약간 비스듬한 피부 절 개를 확인 합니다.</li>
	<li>퉁 명 스럽게 식별 하 고 오른쪽 외부 경 정 맥의 옆 분 지 동원. 바이 폴라 집게로 그들을 응고 하 고가 위로 transect.</li>
	<li>Submandibular 침 샘의 오른쪽 엽 cranially, 혈관 작은 꽃 자루를 식별 들어올린 바이 폴라 집게를 사용 하 여 그것을 부식. Cauterized 작은 꽃 자루가 위 transecting 여은 엽을 제거 합니다.</li>
	<li>단계로 2.5 비유에서 외부 경 정 맥의 모든 중간 지점을 식별 하 고 바이 폴라 포 셉으로 부식 한가 위 transect.</li></ol>가능한, cranially 곡선된 팁 집게와 외부 경 정 맥을 훼손 하 고는 합자 사이의 충분 한 공간을 떠나 두 8/0 실크 합자와 선.
	<li>스트레이트가 위 두 이전 배치 합자 사이 외부 경 정 맥 transect</li>
	<li>(0.75 m m의 내경, 외경 0.94 m m의), 폴 리 에틸렌 팔목을 통해 외부 경 정 맥의 근 위 끝을 통과 하 고 정 맥 microhemostat 클램프와 팔목의 핸들을 수정.</li>
	<li>배 그 루터 기의 끝에 넥타이 제거 하 고 팔목에 선박 evert. 원형 8/0-실크 합자 (그림 1A)와 팔목에 나왔으며 정 맥을 수정.</li>
	<li>Proximally distally 오른쪽 sternocleidomastoid 근육의 표면 부분을 부식가 위, transect 그리고 그것을 제거.</li>
	<li>부드럽게 일반적인 경 동맥을 동원, 분기 아래 훼손 하 고 두번에 선 경 동맥 분기를 넥타이 하지 않아야 함. 관계 사이 배를 잘라.</li>
	<li>2.9 단계, 폴 리 갑 (0.57 m m, 0.6 m m 외경의 내경)를 통해 일반적인 경 동맥의 근 위 끝을 통과 하 고는 동맥 microvascular 클램프와 함께 그것을 해결에 비슷합니다.</li>
	<li>혈관 그 루터 기의 끝에 합자를 제거 하 고 부드럽게 배 dilatators를 사용 하 여 루멘 확대. 동맥 갑 이상 선박 evert 고 8/0 실크 합자 (그림 1A)와 그것을 해결.</li>

3입니다. 주입
<ol>
	<li>장소 머리와 핸들으로 비장을 사용 하 여 받는 사람의 목 지역으로 이식 지향 측면, medially, 비장을 포함 하 여 꼬리와 혈관 덩어리가 ventro-caudally. 위치는 이식 제대로 사용 코 튼 스틱</li>
	<li>부드럽게 받는 사람 동물의 외부 경 정 맥, 하가 되어 이전 나왔으며, 췌 장 이식의 문맥을 세워 적절 한 팔목에 고정 (단계 2.10 참조). 원형 8/0 실크 합자와 그것을 해결.</li>
	<li>받는 사람 동물의 나왔으며 일반적인 경 동맥에는 이식의 복 부 대동맥의 그 루터 기 세워. 원주 8/0 실크 합자 (그림 1C)와 그것을 해결.</li>
	<li>비장, hilum 가까이 비장 혈관 고 곡선된 팁 집게와 함께 그들을 훼손 합니다. 8/0 실크 합자와 그들을 연결 하 고 비장을 제거 하는 비장 혈관 transect. 마지막으로, 관계를 단축.</li>
	<li>셉을 적용 하는 클램프를 사용 하 여 먼저 정 맥 팔목에 클램프를 제거 합니다. 동맥 클램프를 제거 합니다. 참고: 이식에 성공 하면 췌 장 이식 됩니다 수 reperfused 즉시 균질 분홍 색상과 표시 동맥 맥 (그림 1D)를 보여주는.</li>
	<li>Normothermic 염 분 솔루션과 접목 축</li>
	<li>직선 겸 자 사용 하 여 정 맥 팔목의 핸들을 제거 합니다.</li>
	<li>가까운 실행 중인 수술 상처 봉합 사 6/0.</li>
</ol>
4. 수술 후 관리 (끝점)
<ol>
	<li>일반적인 염 분의 최대 0.5 mL을 피하 적용 절차, (사우스 캐롤라이나) 자가 유체 손실 19 G 바늘을 사용 하 여 교체.</li>
	<li>마 취에서 완전 한 회복까지 생리대에 받는 동물을 계속.</li>
	<li>일단, 반환 받는 사람 동물 주택 시설에 수 있는 음식 하 고 광고 libitum물.</li>
	<li>수술 후 통증을 방지 하기 위해 관리 작업 (1) Buprenorphin (0.1 mg/kg 들어) 후 바로 모든 12 h 첫 번째 5 일 및 (2) carprofen 4 mg/kg 들어 모든 12 h는 첫 주에 대 한 사우스 캐롤라이나.</li>
	<li>적절 한 영양 섭취를 예상 하려면 각 받는 사람 동물의 무게 (g)를 매일 모니터링 합니다. 수술 날, 무관심, 마비, 매우 구부러진된 뒤쪽으로 수술 측면 감염에서 체중에 비해 10-15% 이상의 체중 감소는 끝점을 나타냅니다.<ol>
		<li>이 경우에, 뿐 아니라 임상 끝점에 도달 하면 터미널 isoflurane 흡입을 사용 하 여 동물을 희생.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

IRI 관련 이식 피해는 단단한 장기 이식에 고는 미세 혈관의 방해에 의해 특징입니다. 허 혈 성 단계에서 여러 가지 대사 산물의 축적과 염증의 개시 반응 산소 및 질소 종에 의해 주로 중재 폭포, 이식 reperfusion4조직 손상에서 결과. 이 캐스케이드 수 있습니다만 단기, 하지만 또한 장기적인 성공을 위태롭게 하 고, 따라서, 환자 생존14이 크게 영향을. 날짜 하려면, 결합 된 신장 췌 장 이식 형식에서 고통 끝 단계 신장 질병151 당뇨병 환자를 위한 선택의 치료를 나타냅니다. 몇몇 연구는 성공적인 결합된 신장 췌 장 이식만 복원 하지 않는 받는 사람의 당뇨병, 신장 이식 기능 보호 하지만 또한 안정화 및 심지어 신경 장 해를 포함 하 여 2 차 합병증을 회복 뿐만 아니라 마이크로 포커스 및 macroangiopathy16,,1718.
동물 연구에서 감소, 대체, 및 교양 (3 R의) 지속적인 노력에도 불구 하 고 IRI 같은 복잡 한 병 태 생리 과정의 재생산 불가능 단순히 생체 외에서 설정에서 합니다. 따라서, 동물 모델은 여전히 변환 연구19,20이상적인 도구가 될 수 간주 됩니다. 여기에 설명 된 것 처럼 마우스 모델 쥐 또는 다른 동물에 비해 몇 가지 장점을 모델. 이들은 유전자 잘 정의 된 타고 난된 마우스 긴장 (예: 유전자 변형 및 노크 아웃 긴장)의 광대 한 수량, 분자 분석 도구의 과다로는 쉽고 저렴 한21처리의 가용성을 포함 한다. 설명된 모델의 주요 장점은 비 봉합 팔목 기술에 있다. 여기 제시 기법, 성공의 속도 사용 하 여 &#62; 90%는 달성, 더 이전에 비해 설명된 모델22입니다 극적으로. 이 아닌 봉합 기술을 사용 하 여, 우리는 크게 hypovolemic 충격, 혈전 증, 및 anastomoses12의 협 같은 일반적인 합병증을 감소. 관련 받는 사람의 빠른 수술 후 회복 된 이식의 여분의 복 부 위치가이 방법의 추가 장점에 의하여 이루어져 있다. 또한, 자 궁 경부 위치를을 vivo에서 분석, 어떤 긴장22없이 exterioration에 의해 이식의 라이브 영상 등 완벽 하 게 적합.
이 모델의 주요 단점은 임상 현실 유사 하지 않는 췌 장 덕트의 폐색입니다. 이 모델에 exocrine 배수 choledocho 췌 장 덕트 매 관리 됩니다. 긴 기간에 결과 표시 섬유 증 및 동맥의 위축 이식 췌 장 염22에 지도 없이. 우리가 일찍 관찰 외 분 비 조직의이 저하 때문으로 이식 후 하루 30, 우리는이 모델에 적합 하지 긴 기간 관찰 믿습니다. 반면, 손상 되지 않은 내 분 비 기능에 게 받는 이식13,,2324의 기능의 일일 평가 위한 쉬운 도구의 gylcemic 컨트롤.
이러한 특성이 초기 이식 부상과 연관 된 긴 보존 기간 다른 보존 솔루션 및 기술 분석에 대 한 이상적인 모델을 만듭니다. 이 모델 최적의 성공을 달성 하기 위해 몇 가지 중요 한 단계 고려 되어야 한다. 췌 장 자체는 조작에 매우 취약입니다. 따라서, 부드러운 처리 기관 복구 그리고 이식 면 막대기를 사용 하 여 기계적 외상을 최소화 합니다. 집게와 동맥을 직접 파악 피해 야 한다, 이후 그것은 필연적으로 하지 심한 이식 손상 될 것 이다. 같은 이유로 비장 췌, 함께 복구 되 고 핸들로 사용 됩니다. 이것은 또한 임상 연습에 설립. 추가 함정 4 ° C 히스티딘 트립토판 ketoglutarate 관류 솔루션을 사용 하 여 대동맥 유세 통해 관류에 의해 달성 된다 감기 관류를 포함 한다. 이로써, 동맥의 과도 한 팽창 부드럽게 perfusing에 이식 하 여 피할 수 있습니다. 나머지 관류 솔루션 기관 복구 하는 동안 그것의 온도 낮게 유지 하기 위해서는 이식, 보습을 위해 사용 되어야 한다.
받는 사람 준비 관련 외부 경 정 맥 뿐만 아니라 일반적인 경 동맥의 조심 해 부 성공적인 revascularisation에 대 한 기본을 설정합니다. 모든 지류, 뿐만 아니라 주변의 지방 조직을 제거 하 여 정 맥의 특히, 완전 노출, 나머지 지방 조직에 의해 외부 압축 및 협 착 증을 방지 하기 위해 필요 하다. 적절 한 갑 직경의 선택은 중요 합니다. 25 ~ 28 g, 사이 무게 마우스 공유 경험을 바탕 0.57 m m 동맥 갑와 0.75 사이의 정 맥 커 0.8 m m의 내부 직경은 적합 하다. 정확한, 깨끗 한 수 갑의 가장자리의 절단은 필수 배 그 루터 기를 찢는 피하기 위해입니다. 특히, 동맥의 혈관의 팽창 최고의 좋은 팁 배 dilatators를 사용 하 여 이루어집니다. 엄지손가락의 규칙으로 서 배 갑의 두 번 루멘을 넓혀 수 있어야 합니다. 이상 배 everting 및 팔목에 고정 과정으로이 질이 중요 한 단계 때 피부 플랩 아래에 그들을 배치 하 여 혈관 클램프를 안정화 하는 것이 좋습니다.
이미 언급 했 듯이, 비 봉합 팔목-기술 혈관 문 합 하는 쉬운 방법 나타내고 5 분 내에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 받는 사람의 목 지역에 이식의 올바른 위치 올바른 revascularization 위한 매우 중요입니다. 이로써, 정 맥과 동맥의 안전, 직선, 그리고 긴장 없는 문 합 할 수 있도록 예상 되는 목 지역에 이식의 최종 정확한 위치 한다. 너무 긴 혈관이 유출 방해 비틀면 때문에 발생할 수 있습니다 때문에, 피할 수 있다. 같은 이유로 정 맥 문 합에 갑 핸들 또한 제거 되어야 한다 reperfusion 다음. 췌 장 이식에서 지역화 된 bleedings의 경우, 성공적인 hemostasis 부드럽게 면 지팡이 사용 하 여 5 분 동안 출혈 측면을 압축 하 여 얻을 수 있습니다. 이 합병증의이 종류를 관리 하는 유일한 성공적인 방법입니다.열화, 비록 매우 선택적, 괴 사 성 췌 장 염으로 인해 거의 모든 경우에서 이식 손실 귀착되는.
요약 하자면, 우리는 및 microsurgically 가능한 기술적 이며 뛰어난 성공 속도 비 봉합 팔목 기술을 사용 하 여 마우스의 췌 장 이식 하는 방법을 개발 했다. 췌 장 덕트 폐색 때문에의 progredient 섬유 증을 감안할 때,이 모델은 초기 이식 손해에 초점을 맞추고 연구 분야에 대 한 가장 적합 합니다. 이 원고는 안전 하 게 그들의 실험실에서이 모델을 확립 하는 연구를 허용 하는 위한 것입니다.

동시 신장-췌 장 이식 (SPK) 환자 당뇨병 mellitus 그리고 끝 단계 신장 질병에서 고통에 대 한 치료의 현재 표준을 나타냅니다. 성공적인 이식 장기 인슐린 독립 안정화 또는 당뇨병 microangiopathy와 더 나은 삶의 질1의 심지어 회귀와 관련 된 발생 합니다. 그러나, 신장과 간 이식 같은 다른 일반적인 고체 기관 이식, 달리 췌 장 이식 더 국 소 빈 혈 reperfusion 상해 (IRI)을 따르게 됩니다. 최대 35%의 보고 한 부각 위태롭게 이식, 뿐만 아니라 심지어 환자, 생존2,3.
산화 스트레스, microcirculatory 장애 증가 식 프로 염증 성 cytokines 및 접착 분자의 결과로 마침내 내 피 활성화 및 그것의 무결성의 손실에는 모두에 기인이 아닌 수용자 이식 부상 4. 지금까지, IRI의 정확한 분자 메커니즘 크게 알 수 있으며 기관 기관에서 다를 수 있습니다.
주요 진행 생체 외에서 모델을 활용 하 여에 불구 하 고 동물 모델의 개발은 췌 장 이식 다음 이식 IRI 관련 변경에 관련 된 분자 메커니즘의 지식을 심화 하 결정적 이다. 설치류의5,6, 여러 가지 췌 장 이식 모델 개발 되었습니다 하지만 단 하나 쥐7에 보고 됩니다. 이 매우 요구 microsurgical 절차는 46%의 낮은 생존 율의 약점이 다. 그러나, 마우스 모델을 다양 한 분자 분석 도구는 그들에 적용 될 수 있기 때문에 이식 관련 연구에 대 한 최고의 모델을 나타냅니다. 다른 장기 이식8,,910쥐에서 광범위 한 microsurgical 경험을 바탕으로, 우리 췌 heterotopic, 자 궁 경부에 대 한 새로운, 높게 재현 기술 개발 와 쥐에 이식 &#62; 90% 성공률 갑 비 봉합 기술을 사용 하 여. 이 기술은 anastomoses 관련 합병증을 최소한 감소와 봉합 모델11에 비해 높은 성공률을 달성 될 수 있다. 지금까지 비슷한 성공률을 하나만 마우스 모델 류 외12에 의해 설명 하고있다. 그러나, 지금까지이 모델을 사용 하 여 게시 없음 연구 있다.

<table><tbody><tr><td>Adventitia 가위</td><td>S & T</td><td>S-00102</td><td>스트레이트</td></tr><tr><td>Dumont # 7 펜치</td><td>FST</td><td>&nbsp; 11271- 30</td><td>곡선 팁 0.17 x 0.1 mm</td></tr><tr><td>Yasargil 클립 미니 영구 7mm</td><td>Aesculap</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 용기 클립</td><td>S & T</td><td>B1 00396 V</td><td></td></tr><tr><td>용기 확장기</td><td>S & T</td><td>D-5a.2, 00125</td><td></td></tr><tr><td>클립 애플리어</td><td>S & T</td><td>CAF-4 00072</td><td>정맥 커프용</td></tr><tr><td>클립 애플리어</td><td>Aesculap</td><td>FE572K&nbsp;</td><td>동맥 커프용</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜브</td><td>Portex Ltd</td><td></td><td>정맥 커프용 내경 0.75mm</td></tr><tr><td>폴리미드 튜브</td><td>Vention Medical&nbsp;</td><td>141-0051</td><td>내경 0.8 mm (Portex Ltd의 폴리에틸렌 튜브 대체품)</td></tr> <tr><td>폴리 이미드 튜브</td><td>Vention Medical</td><td>141-0033</td><td>동맥 커프 용 내경 0.57 mm</td></tr><tr><td>양극성 집게</td><td>Micromed</td><td>140-100-015</td><td></td></tr><tr><td>8/0 실크 합자</td><td>Catgut GmbH, Merkuramed</td><td>17209008</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK 솔루션</td><td>Dr. Franz K &ouml; hler Chemie</td><td>59997</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin Graeub</td><td>aniMedica GmbH</td><td>32554</td><td></td></tr><tr><td>Xylasol Graeub</td><td>aniMedica GmbH</td><td>50855</td><td></td></tr></tbody></table>

췌 장 이식 수정된 팔목 기술을 사용 하 여 마우스 모델

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

마우스 모델 이식 연구, 취급이 용이, 다양 한 유전자 잘 정의 된 긴장, 및 분자 프로브 및에서 vivo에서 로 를 수행 하기 위해 시 약의 광범위의 가용성을 포함 하 여 몇 가지 장점이 있는 체 외 연구. 다양 한 murine 이식 모델 우리의 경험을 바탕으로, 우리 밑에 심한 국 소 빈 혈 reperfusion 상해 관련 된 초기 이식 손상 메커니즘을 분석 하는 것으로 쥐에서 heterotopic 췌 장 이식 모델을 개발 했다. 달리 이전 설명된 기법 봉합 기술을 사용 하 여 여기 우리 기술 비 봉합 팔목 기술을 사용 하 여 새로운 절차.
최근 몇 년 동안, 우리가 마우스의 전반적인 성공율에 300 개 이상의 췌 장 이식 수행한 &gt; 90% 성공률 결코 설명 하기 전에 마우스 췌 장 이식에서. 이 아닌 봉합 팔목 기술 이식 revascularization의 두 주요 단계로 구성 됩니다: (I) 폴 리 에틸렌/폴 리 갑을 통해 받는 사람 배 고 완곡 한 합자와 (II) 기증자 선박 배치 그것을 고치는 받는 사람 배 고 두 번째 원주 합자와 고정 나왔으며. 내 피 레이어 결과 높은 patency 속도 덜 thrombogenic 병 변에서의 결과 연속성 및, 마지막으로, 높은 성공률.
이 모델에서 동맥 문 합 받는 사람 동물의 나왔으며 일반적인 경 동맥을 통해 기증자 이식의 복 부 대동맥을 당겨서 이루어집니다. 정 맥 배수 장치는 이식의 받는의 나왔으며 외부 경 정 맥에 당기는 이식의 문맥으로 이루어집니다. 이 원고는 세부 사항 및 장기 복구 및 수 있도록 그들의 실험실에서 이식을 성공적으로 수행 하기 위해 microsurgical 기술 연구원 장기 이식 절차의 중요 한 단계를 제공 합니다.

지난 10 년간 우리는 생쥐에서 300 개 이상의 췌 장 이식 수행. 프로토콜을 설정한 후의 전반적인 생존 했다 &#62; 90%. 수술 후 출혈 이후 치명적인 괴 이식 췌 장 염으로 혈전 증 이식 다음 실패에 대 한 주요 원인 이었다. 두 경우 모두, 끝점은 24 시간 이내에 도달 하 고 동물을 희생 했다. 어떤 신경 장애, 부전 실어증, 그리고이 시리즈에서 외과 측면 감염 증상 없었다.
이식된 이식의 내 분 비 기능을 조사 하 고 따라서 patency 모델의 유효성을 검사, 혈당 intraperitoneally 적용된 streptozotocin (312.5 mg/kg 체중)의 단 하나의 복용량으로 전처리 하 여 받는 사람 마우스에서 유도 되었다 4 수술 전에 일. 마우스 경우 혈당 hyperglycemic 여겨졌다 &#62; 300 mg/dL. 그림 2A 다른 그룹의 혈액 포도 당 수준을 보여줍니다. 16 h의 머리말 붙인된 찬 허 혈 시간 없이 이식 받는 마우스 normogylcemia 이식, 다음 24 시간 이내에 도달 하 고 전체 관찰 기간 동안이 대사 상태를 유지. 대조적으로, 비 이식 동물 hyperglycemic 남아 있었다. 때문에 우리는 국 소 빈 혈 reperfusion 상해 관련 된 이식 손상 내 분 비 기능에 미치는 영향에 관심이 있었다, 우리 16 h 장기 찬 허 혈 시간 (CIT)와 따뜻한 허 혈 시간 (WIT)의 45 분에 이식 노출 했다 제 3의 그룹을 추가. 이러한 이식 받은 쥐 normoglycemia를 도달 하지 않았다 고이 모델13에 치명적인 것으로 표시 되었다 심각한 췌 장 염의 개발으로 인해 48 h 후 희생 되어야 했다.
이 모델은 국 소 빈 혈 reperfusion 상해 관련 된 초기 이식 피해를 조사 하기 위한 다양 한 프로젝트에 대 한 유용 합니다. 추가 조사 포함, 다른 가운데, 2 h 이식 다음을 수행 하는 microcirculatory으로 혼란의 정량화를 위한 공초점 intravital 형광 현미경 검사 법. 이식의 microvessels의 대비는 음 경 정 맥으로 0.4% fluorescein isothiocyanate 표시 된 dextran (150 000 MW)의 0.3 mL를 주입 하 여 향상 되었습니다. 그림 2B 순진한 murine 췌와 장기간된 CIT (그림 2C)에 노출 되지 했다는 이식된 췌 장 이식의 일반 모 세관 패턴을 표시 합니다. 그림 2D 췌 장 이식 장기. CIT 노출의 결과로 미세 혈관의 붕괴를 표시 하는 반면,
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54998/54998fig1.jpg"> 
그림 1 : 자가 사진. (A) 받는 사람 혈관 문 합에 대 한 준비의 자가 보기. 외부 경 정 맥 (1) 되어 정 맥 폴 리 에틸렌 팔목에 나왔으며과 원형 8/0 실크 합자와 고정. 비유에서 일반적인 경 동맥 (2) 되어 나왔으며과 작은 동맥 폴 리아 미드 팔목에 고정. 스케일 바 m m. 1 (B) 라 전췌 장 이식 포털 정 맥 (1) 및 (2) 혈관 문 합에 필요한 복 부 대동맥의 그 루터 기. (3) 비장 췌 함께 검색 되 고 핸들로 사용 됩니다. 비장은 이식의 reperfusion 전에 제거 됩니다. 규모 1 cm. 바 (C) 자가 보기는 anastomoses의. 포털 정 맥 (1) 나왔으며 외부 경 정 맥의 팔목에 당겨 (2)와 원형 8/0 실크 넥타이 고정. 마찬가지로, 복 부 대동맥 (3)의 대동맥 유세 나왔으며 일반적인 경 동맥 (4)의 팔목 위에 당 겼 다. 1. 다음 5 분 reperfusion perfused 췌 장 이식의 보기 (D) 자가 바 규모: 정 맥, 동맥 클램프, 뒤의 제거 후 성공적으로 이식된 췌 장 이식 동종 분홍 색상을 표시 합니다. 비장의 reperfusion 전에 제거 되었습니다 (1: 합자 비장 혈관). 규모 1 cm. 바 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54998/54998fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54998/54998fig2.jpg"> 
그림 2 : 내 분 비 기능과 췌 장 이식의 confocal vivo에서 형광 현미경 검사 법. 그림 2A CIT 없이 이식된 생쥐의 혈액 포도 당 수준으로 꺾은선형 차트를 보여 줍니다 (n = 10, CIT, 블루 라인 없이 PTX), 비-이식 마우스 (n = 11, 아니 PTX 레드 라인), 그리고 장기간된 CIT에 노출 하는 이식 받은 쥐 (PTX + 16 h CIT, n = 10, 녹색 선). 모든 받는 사람 312.5 mg/kg 들어 streptozotocin i.p.과 hyperglycemic 렌더링 이전 했다 CIT 없이 이식의 모든 받는 사람이 그대로 내 분 비 기능 (50 일) 전체 관측 기간을 살아날 수 있었다, 그러나 비 이식 마우스 전체 관찰 기간 동안 hyperglycemic 남아. 16 h CIT에 노출 하는 이식 받은 생쥐 혈당에서 재기 하지 않았다 고 이식 수술, 10-15% 이상의 체중 감소 후 48 h 희생 했다. 전체 관측 기간 살아남은 쥐 날 한 마지막 glycemia 측정을 다음 50에 희생 했다. 미세 이식된 이식에 confocal intravital 형광 현미경 이식 다음 2 h에 의해 평가 되었다. 순진한 췌 컨트롤로 제공 됩니다. 그림 2B 순진한 췌에 정기적으로 모 세관 패턴을 보여 줍니다. 일반 모 세관 메쉬 또한 장기간된 CIT (그림 2C) 대상이 되지 이식된 이식에서 볼 수 있다. 반면, 붕괴는 미세 이식된 이식 장기 CIT (그림 2D)에 노출에서 관찰 됩니다. 스케일 바 100 µ m. 데이터에서 그래프 ± 표준 편차로 표현 됩니다. PTX: 췌 장 이식; CIT: 찬 허 혈 시간; 승: 없이 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54998/54998fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

복 부의 단단한 장기 이식 중 췌 장 이식 가혹한 국 소 빈 혈 reperfusion 상해 관련 된 이식 손상, 결국 초기 이식 손실에 지도 개발 하는 경향이 있다. 이 프로토콜 murine 췌 장 이식이 초기, 해로운 손해 분석 적합 비 봉합 팔목 기술을 사용 하 여 모델을 설명 합니다.

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

저는 인스브루크 의과대학 내장, 이식 및 흉부외과국의 Daniel Swarovski 연구소 소속 Benno Cardini입니다. 오늘은 변형된 커프 기법을 이용한 췌장 이식 마우스 모델을 보여드리겠습니다. 케타민과 자일라진을 복강 내 주사하여 공여자 동물을 마취하고, 복부 부위를 제모합니다.그런 다음 수술 대상자를 수술대에 앙와위로 눕히고, 수술 부위를 클로르헥시딘으로 3회 세척합니다. 이제 치골 부위부터 검상돌기까지 정중선 개복술을 시행하고, 수술 시야를 더 잘 확보하기 위해 절개 부위를 양측 갈비뼈 아래쪽으로 확장합니다. 그런 다음 내장을 왼쪽으로 외출시키고, 신장 하부의 대정맥에 헤파린을 주입합니다.다음 단계로, 왼쪽 신정맥 교차점의 근위측에서 복부 대동맥을 확인하고, 대동맥 아래를 박리한 후 해당 지점을 결찰합니다. 이제 간문으로 이동하여 간에 가까운 총담관을 확인 및 박리하고, 췌장에 가까운 부위를 결찰합니다. 마지막으로 결찰사 위쪽의 총담관을 절단합니다.다음으로, 정맥 문합에 충분한 길이를 확보하기 위해 간 근처의 문맥을 박리합니다. 팁을 드리자면, 나중에 쉽게 식별할 수 있도록 문맥에 간 조각을 약간 남겨두십시오. 이어서 대동맥 주변 조직에서 좌측 신정맥을 박리하고 결찰합니다.그런 다음 결찰선의 오른쪽을 유지하며 신정맥과 대동맥 주변 조직을 횡단 절단합니다. 이어서 복강동맥에서 횡격막까지의 복부 대동맥을 둔탁하게 박리하고, 횡격막 근처에서 대동맥을 들어 올린 후 그 지점에서 절단합니다. 다음으로 모든 요동맥 분지를 확인하여 응고시킨 후 절단합니다.이제 이전에 설정한 결찰 부위 아래에서 대동맥을 횡단 절개하십시오. 대동맥 패치를 통해 췌장에 얼음처럼 차가운 관류액을 주입하여 문맥에서 유출액이 나올 때까지 관류하십시오. 위쪽에서는 관류된 문맥을, 아래쪽에서는 관류된 대동맥을 확인할 수 있습니다.이제 내장을 복강 내로 다시 넣고, 8-0 실크 리가튀어를 사용하여 췌장을 장에서 단계적으로 분리합니다. 유문 후 영역부터 시작하여 십이지장을 두 번 박리하고 8-0 실크 리가튀어를 통과시킵니다. 그런 다음 이를 결찰하고 췌장을 십이지장에서 예리하게 분리합니다.이 방법은 트라이츠 인대(ligament of Treitz)에 도달할 때까지 반복적으로 수행합니다. 십이지장을 손상시키지 않는 것이 매우 중요한데, 이는 오염 가능성으로 인해 이식편을 실험에서 제외해야 하기 때문입니다. 췌장이 십이지장에서 완전히 분리된 후, 장간막으로 이동하여 박리하고 결찰한 다음 절단합니다.이전 단계와 마찬가지로, 췌하부를 박리하고 결찰한 후 최종적으로 절단하여 횡결장을 췌장에서 분리합니다. 이제 동일한 방법으로, 결찰 후 예리하게 절개하여 담도 영역에서 췌장을 분리합니다. 이어서, 췌장을 위장으로부터 둔성 박리합니다.좌위동맥을 확인하여 결찰하고 절단합니다. 마지막으로, 비장이 부착된 췌장을 적출하여 추가 이식 시까지 얼음처럼 차가운 재관류 용액에 보관합니다. 이때 비장을 손잡이처럼 사용하여 잡습니다.공여 동물과 마찬가지로, 케타민과 자일라진을 복강 내 주사하여 수혜 동물을 마취시키고 경부 부위를 제모합니다. 그 후, 수혜 동물을 수술대 위에 Supine 자세로 눕히고 클로르헥시딘으로 경부 부위를 3회 세척합니다. 다음으로, 경정맥 절개 부위부터 오른쪽 하악각까지 피부 절개를 실시합니다.다음으로, 우측 외경정맥의 모든 측분지들을 확인하여 가동화하고, 박리한 후 바이폴라 응고술을 통해 절단합니다. 그 후, 우측 악하선의 하극을 잡아 두측으로 들어 올리고, 공급 혈관들을 바이폴라 응고술로 처리하며 박리합니다. 이제 우측 외경정맥의 모든 내측 분지들을 바이폴라 응고술 후 절단합니다.외경정맥을 가능한 한 두 번 두개측으로 결찰하고 결찰사 사이에서 절단합니다. 외경정맥의 근위단을 폴리에틸렌 커프에 통과시킵니다. 이때 커프의 손잡이가 수술자를 향하도록 하는 것이 중요합니다.다음 단계로, 측면에서 미세혈관 정맥 클램프를 배치합니다. 이제 정맥을 헤파린으로 적신 후, 결찰사를 제거하고 정맥을 폴리에틸렌 커프 위로 조심스럽게 당깁니다. 마지막으로, 뒤쪽에 매듭 하나, 앞쪽에 매듭 세 개를 만들어 8-0 실크 결찰사로 커프 위에 정맥을 원형으로 고정합니다.우측 총경동맥에 접근하려면, 근위부와 원위부를 응고시킨 후 우측 흉쇄유돌근을 가동화하고 절단합니다. 이어서 미주신경과 같은 인접 구조물을 손상시키지 않도록 주의하며 총경동맥을 조심스럽게 가동화합니다. 정맥과 마찬가지로, 총경동맥을 가능한 한 두개 쪽으로 두 번 결찰하고 결찰 부위 사이를 절단합니다.이제 혈관을 동맥 커프(arterial cuff)를 통해 통과시킵니다. 마지막으로, 내측에서 미세혈관 클램프(microvascular clamp)를 사용하여 동맥 커프를 고정합니다. 다음으로, 결찰사를 제거하고 혈관 확장기를 사용하여 동맥의 내강을 넓힙니다.강내(lumen)가 충분히 확장되면, 동맥을 동맥 커프 위로 당깁니다. 마지막으로 정맥과 마찬가지로 8-0 실크 결찰사로 동맥을 고정합니다. 여기에서 동정맥 문합술을 위해 복구된 정맥과 동맥을 확인할 수 있습니다.이식을 위해, 습윤 상태의 Ace 위 경부 영역에 이식편을 배치합니다. 그런 다음, 8-0 실크 결찰 루프를 통해 문맥을 끌어당기고, 장력 없는 문합을 위해 정맥의 길이를 짧게 조절한 후 문맥을 정맥 커프 위로 당깁니다. 마지막으로, 원형 8-0 실크 결찰로 정맥을 고정합니다.정맥과 유사한 방식으로, 대동맥 단단을 결찰 루프에 통과시켜 대동맥의 길이를 줄입니다. 그런 다음, 대동맥을 동맥 커프 위로 당겨 최종적으로 circular 8-0 silk ligature로 고정합니다. 재관류 전, 비장 혈관을 확인하여 결찰한 후, 최종적으로 이를 예리하게 절개하여 비장을 제거합니다.재관류를 위해 먼저 정맥 클램프를 제거한 후, 동맥 클램프를 제거합니다. 이식편의 적절한 재관류는 동맥의 가시적인 박동과 이식편 전체의 분홍빛 색상으로 확인할 수 있습니다. 정온 식염수로 이식편을 적십니다.혈관 꼬임(kinking)을 방지하기 위해 상처를 봉합하기 전 정맥 커프의 핸들을 제거합니다. 마지막으로 6-0 연속 봉합사로 상처를 봉합하고 0.5 milliliters의 정상 생리식염수를 피하에 주입합니다. 모델을 검증하기 위해, 이식된 췌장의 내분비 기능을 테스트했습니다.수술 4일 전 streptozotocin으로 전처리를 하여 마우스의 혈당을 높였으며, 혈당 수치가 300 mg% 이상인 경우 고혈당 상태인 것으로 간주하였습니다. 이 선 그래프는 이식하지 않은 살아있는 대조군 마우스의 혈당 수치를 빨간색으로, 장시간의 냉허혈 시간에 노출되지 않은 이식편 수혜자의 혈당 수치를 파란색으로 보여줍니다. 또한, 16시간의 냉허혈 시간에 노출된 췌장 이식편 수혜자의 혈당 수치가 녹색으로 표시되어 있습니다.생존 마우스는 전체 관찰 기간 동안 저혈당 상태를 유지했습니다. 이와 대조적으로, 장시간의 냉허혈 시간에 노출되지 않은 췌장 이식편을 이식한 경우에는 24시간 이내에 정상 혈당 수치로 회복되어 이식편의 내분비 기능이 확인되었습니다. 16시간의 냉허혈 시간에 노출된 이식편을 이식한 경우에는 수신자의 정상 혈당 수치가 회복되지 않았습니다.게다가, 이 그룹의 모든 마우스는 허혈 재관류 손상과 관련된 초기 이식편 손상으로 인해 48시간 이내에 희생되어야 했습니다. 본 영상에서는 비봉합 커프 기술을 이용한 마우스 췌장 이식 방법을 제시하였습니다. 이 방법은 기술적으로나 미세수술적으로 가능하며 매우 우수한 성공률을 보입니다.하지만 관 폐쇄로 인한 췌장의 점진적인 섬유화를 고려할 때, 본 모델은 초기 허혈 재관류 손상과 관련된 이식편 손상에 집중하는 연구 분야에 가장 적합하다고 판단됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리 프로토콜이 정상적으로 쉽게 생쥐의 신장에 따라 캡슐 아일 레츠이나 세포를 제공하기 위해 개발되었습니다. 세포 신장 캡슐에서 세포를 이식에 사용되는 최종 튜브에 쥐똥에 집중되어있다. 이 기법의 용이성은 세포와 마우스에 스트레스를 줄여줍니다.

당뇨병 마우스의 신장 캡슐으로 췌장 아일 레츠의 이식

절연 아일 레츠의 이식은 제 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 여기 마우스 pancreata에서 아일 레츠를 분리하고 신장의 subcapsular 공간을 이식하는 방법을 설명합니다.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

이 비디오는 생체 내에서 인간 췌장 이식편의 혈관 재생화를 모니터링하기 위해 인간 췌장도를 마우스 눈의 전방에 이식하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 이식편의 캡슐화 및 혈관화를 촉진하는 데 있어 수용자 세포와 기증자 세포의 기여도를 이해하는 데 도움이 됩니다.

췌장섬 접목: 생체 내 이미징을 위해 췌장섬을 마우스 눈의 전방에 이식하는 방법

이 비디오는 췌장암 발병을 위해 암성 기증자의 종양 조각을 비암성 수용자 마우스의 췌장으로 이식하는 단계적 수술 방법을 설명합니다. 정소적으로 이식된 PDAC는 기존의 피하(SC) 모델보다 인간 췌장암의 조직 미세환경을 더 정확하게 재현할 수 있습니다.

정소성 동종이식 종양 이식: 췌장 종양 마우스 모델을 생성하는 기술

이 비디오에서는 췌장섬 세포를 간 문맥에 주입한 다음 출혈을 성공적으로 방지하기 위해 젤 폼을 적용하는 절차를 설명합니다. 수술 후 출혈은 섬 이식 중 높은 사망률의 흔한 원인입니다.

섬 이식의 쥐 모델: 췌장도를 문맥에 주입하는 수술 방법 및 수술 후 출혈 예방

이 프로토콜은 성체 쥐의 췌장에서 췌관의 외과적 결찰과 관련된 부상 모델을 설명하며, 이로 인해 베타 세포의 신생과 증식이 가능한 환경을 조성하는 심각한 손상이 발생합니다. 이 모델은 베타 세포 형성과 관련된 메커니즘을 연구하는 도구로 사용할 수 있습니다.

내분비 및 외분비 리 프로그래밍과 대량 살상 무기 확산 모델로 췌관의 결찰을 통해 마우스 췌장 외과 부상

이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

임상 맥락에서, 국소췌암을 가진 환자는 부주 처리를 선행한 pancreatectomy를 겪게 될 것입니다. 여기에서 보고된 이 프로토콜은 말단 판생성 절제술 및 비장 절제술다음에 췌장암의 정형소 이식을 통해 누드 마우스에서 이 임상 시나리오를 모델링하는 안전하고 효과적인 방법을 확립하는 것을 목표로 합니다.

췌장암의 정형소 절제술 마우스 모델

본 프로토콜에서, 마우스 심장 이식 모델은 심장 동종이식 거부반응의 메카니즘을 조사하기 위해 사용된다. 이 이종 심장 이식 모델에서는 수술 효율이 향상되고 수정된 커프 기술을 사용하여 심장 이식의 자궁경부 종단 간 문합에 의해 심장 이식편의 생존이 보장됩니다.

마우스 자궁경부 이종 심장 이식 모델을 위한 수정된 커프 기술

췌관 선암종(PDAC)의 Syngeneic mouse orthotopic 동종이식편은 질병 아형의 생물학, 표현형 및 치료 반응을 요약합니다. 빠르고 재현 가능한 종양 진행으로 인해 전임상 연구에 널리 사용됩니다. 여기에서는 syngeneic murine PDAC 배양을 췌장에 주입하여 이러한 모델을 생성하는 일반적인 방법을 보여줍니다.

췌장암을 모델링하기 위한 Syngeneic Mouse Orthotopic Allografts

학습하세요 마우스 췌장 이식 모델에서 비봉합 커프 기술을 이용한 혈관 문합법과 허혈-재관류 손상 연구 방법을. 이 기법은 이식 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

췌 장 이식 수정된 팔목 기술을 사용 하 여 마우스 모델

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