לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לגבש טכנולוגיות המאפשרות התמרה מוצלחת של גנים בתאי הרג טבעיים ראשוניים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונותרפיה, כמו השפעת השינוי הגנטי על לימפוציטים אפקטיביים, כגון תאי הרג טבעיים, או תאי NK. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ביטוי יעיל של גן מעניין בתאי NK ראשוניים או אנושיים.

לאחר הכנה וטיטרציה של וקטורים לנטי-ויראליים על פי פרוטוקול הטקסט, טיהור תאי NK ראשוניים של עכברים על ידי העברת תרחיפי טחול של תא בודד דרך עמודי צמר ניילון כדי לדלל את האוכלוסיות הדבקות המורכבות מתאי B ומקרופאגים. השתמש ב-1,000 יחידות למיליליטר של אינטרלוקין-2 במדיום שלם RPMI1640 כדי לתרבית את האוכלוסייה הלא דביקה המכילה תאי NK. ביום הרביעי של התרבית, החלף את המדיום באמצעות 20 מיליליטר של מדיום שלם RPMI1640, ו-1,000 יחידות למיליליטר של IL-2 כדי להסיר את תאי ה-T וה-NKT שאינם נדבקים.

ביום השביעי, השתמשו בסמנים ספציפיים לתאי MK כדי לבדוק את טוהר תאי ה-NK של העכברים על ידי זרימה ציטומטרית באמצעות תכשירים עם יותר מ-95% CD3 שלילי ו-NK1.1 חיובי. כדי לבודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי, או PBMCs, שכבה בזהירות של 35 מיליליטר של תאים מדוללים למחצה על פני שיפוע צפיפות של 15 מיליליטר בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את השיפוע ברוטור דלי מתנדנד ב -400 פעמים G ו -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ללא הפסקה.

לאחר טיהור תאי NK ראשוניים אנושיים על פי פרוטוקול הטקסט, קבע את טוהר התאים על ידי הוספת שני מיקרוגרם למיליליטר של נוגדנים נגד CD3, ושני מיקרוגרם למיליליטר של נוגדנים נגד CD56. דגרו על התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים.

לאחר מכן, נתח את התאים על ידי ציטומטריית זרימה. אוכלוסיית תאי ה-NK תהיה חיובית ל-CD56 על פני התא, ושלילית ל-CD3. השעו תאי NK ראשוניים של עכבר או אדם בבארות של צלחת של 24 בארות ב-0.5 פעמים עד ה-5 למיליליטר של מדיום עם GFP Lentivirus supernatant, ב-NLY של חמישה, 10 ו-20.

ואז בנוכחות פוליברן, פרוטמין גופרתי או דקסטרן. צנטריפוגה את הצלחות ב -1, 000 פעמים G למשך 60 דקות. לאחר מכן, מבלי לרוקן את הסופרנטנט, תרבית התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5.2% פחמן דו חמצני למשך הלילה.

לאחר שטיפת התאים עם 10 מיליליטר PBS, השתמש בשני מיליליטר של מדיום RPMI1640 עם IL-2 כדי להשעות מחדש את התאים. יום לפני קצירת התאים, יש לצפות צלחות פוליסטירן סופגות חלבון ב-2.5 מיקרוגרם למיליליטר של נוגדנים חד-שבטיים נגד MKG2D. ודוגרים את הצלחות בטמפרטורת החדר או במקרר למשך הלילה.

למחרת, השתמש ב -100 מיקרוליטר PBS כדי לשטוף כל באר שלוש פעמים. קצרו את תאי ה-NK המומרים על ידי הקשה עדינה תחילה על הצלחות, ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של התאים לכל באר מ-96 הלוחות של 96 הבארות. 16 עד 18 שעות לאחר ההפעלה, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לאסוף את הסופרנטנטים.

לאחר מכן באמצעות הציטוקין הרקומביננטי מערכת ELISA, צור עקומה סטנדרטית וכמת את הציטוקינים, כגון אינטרפרון גמא בסופרנטנט. כדי לבדוק את כדאיות תאי ה- NK, ארבעה ימים לאחר ההעברה, שטפו את התאים עם 10 מיליליטר PBS קר פעמיים. לאחר מכן, קצרו את התאים והשתמשו ב-XM5 7-aminoactinomycin D כדי לצבוע אותם.

השתמש בזרימה ציטומטרית כדי לקבוע את אחוז התאים הנמקיים בין תאי ה-NK שעברו טרנספורמציה, ונתח את הנתונים על פי פרוטוקול הטקסט. איור זה מראה שתאי NK אנושיים שהודגרו עם IL-2 רקומביננטי ולאחר מכן הומרו עם GFP Lentivirus השיגו יעילות התמרה גבוהה יותר והגדילו את הטיטר הנגיפי כאשר דקסטרן נוסף לתרבית, בהשוואה לתוספת של פוליברן או פרוטמין סולפט. כפי שניתן לראות כאן, תוצאות דומות הודגמו בתאי NK של עכברים, שם דקסטרן הגדיל את היעילות של וקטורים לנטי-ויראליים, בהשוואה לפוליברן או פרוטמין סולפט.

בניסוי זה, היכולת הציטוטוקסית של תאי NK ראשוניים שהועברו התמרה נבדקה על ידי בדיקת שחרור CR כנגד K562 ו-YAC-1 כתאי מטרה. התמרה של תאי NK על ידי דקסטרן אינה משנה לרעה את פוטנציאל ההרג של תאי NK שעברו טרנספורמציה בהשוואה לתאי NK שאינם מותמרים. כאן, תאי NK ראשוניים אנושיים שהומרו עברו תרבית משותפת עם K562 במשך 24 שעות, והסופרנטנטים נאספו כדי למדוד אינטרפרון גמא.

התוצאות מצביעות על כך שלדקסטרן אין השפעה על יכולתם של תאי NK מתמרים לייצר ציטוקינים. בנוסף, אימות עצמאי הראה שתאי NK שטופלו בדקסטרן המופעלים עם נוגדנים חד שבטיים נגד NKG2DA10 הקשורים לצלחת עדיין מסוגלים לייצר את הציטוקין אינטרפרון גמא. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לסובב את התאים המועברים.

בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו טרנספקציה יכולות להיות עמוקות על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו כיצד לשפר את העברת הגנים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את דרכם של חוקרים בתחום האימונולוגיה, לחקר מניפולציה גנטית בתאי NK. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להמיר תאי NK.