פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיל את ביטוי גן המטרה ב-DCS על ידי העברת SI RNA. זה מושג על ידי תכנות ראשון של אפקטור AM Maxin Nucleo. השלב השני של ההליך הוא לערבב DCS ו-siRNA יחד ולהכניס את תמיסת התא המתקבלת למודולי Nucleo QVE.

השלב השלישי של ההליך הוא למקם את הצלחת במגש המעבורת של ה-amaxa כדי להתחיל בתהליך הטרנספקציה. השלב האחרון של ההליך הוא להדביק את התאים בנגיף כדי להפעיל את תגובת האינטרפרון. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות הפלת גנים באמצעות R-T-P-C-R כמותי וכתמים מערביים.

טכניקה זו חשובה לאפיון מסלולי איתות בתאים דנדריטיים ועשויה לתרום לפיתוח טיפולים חיסוניים מבוססי תאים דנדריטיים. כדי לתכנת את גורם הגרעין של מעבורת מקסון 96 עבור טרנספקציה DC, פתח קובץ פרמטרים חדש. בחר את מספר הבארות בהן תשתמש עבור טרנספקציה סטנדרטית על ידי גרירת הסמן מעל דיאגרמת לוח 96 הבארות.

השתמש במינימום של שלוש בארות כדי לאגד עבור כל דגימה ניסיונית. כעת הזן את קוד התוכנית בחלק הראשון בחר F, F ו-i חלק שני, בחר 1 68 מהתפריטים הנפתחים. לאחר מכן, מתיבת הפתרון, בחר מונוציטים אנושיים הבא תחת אפשרות בקרה בחר סטנדרטי ולאחר מכן לחץ על החל.

כדי לכלול פקד ללא טרנספקציה, יש צורך בבחירת בארות נוספות מהדיאגרמה. לאחר מכן מאפשרות הבקרה, בחר ללא בקרת תוכנית ולחץ שוב על החל. לאחר ערבוב תמיסת חיבה גרעינית, הניחו לו להתחמם לטמפרטורת החדר.

הנח את מספר מודולי ה-nucleo vete הדרושים לתוך לוחית ה-nucleo VETE בכיוון הנכון כפי שמוצג כאן על ידי הכנסת הראשון לתוך ורד אחד ושניים ולאחר מכן הלאה עבור כל הצינורות הבאים. העבירו מספיק DCS מבקבוק תרבית תאים לתוך שפופרת של 50 מיליליטר כדי שיהיו 500,000 תאים לבאר עבור צנטריפוגת הטרנספקציה של התאים למשך 10 דקות ב-400 גרם בארבע מעלות צלזיוס ואז הסירו בזהירות את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף תמיסת חיבה גרעינית לצינור ולאחר מכן השהה מחדש את ה-DCS על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה כמה פעמים.

כעת סמן צינורות DPH בהתאם לטיפול הספציפי שיש לבצע, ולאחר מכן חלק את התאים התלויים לצינורות המסומנים בתווית. הוסף SI RNA בריכוז סופי של 0.25 מיקרוגרם לכל 500,000 תאים לצינורות האפי אנדורף המתאימים, ולאחר מכן ערבב את תרחיפי התאים על ידי פיפטינג. השתמש ב-SI RNA שאינו יעד עבור דגימת בקרת הטרנספקציה ללא טרנספקציה.

לאחר מכן פיפטה 20 מיקרוליטר של תרחיף התאים SI RA DC לתוך מודולי ה-nucleo vete בהתאם לפריסת הניסוי שתוכנתה בעבר, תוך הבטחה שהנוזל מועבר לתחתית הבאר, מכסים את לוחית ה-nucleo vete במכסה ומקישים על הצלחת על משטח קשיח כמה פעמים כדי להקל על הסרת בועות האוויר כדי להעביר את ה-dcs. הכנס את צלחת הגרעין איווט המוכנה למגש המעבורת של אפקטור הגרעין 96 באר. לאחר מכן לחץ על כפתור העלה והתחל.

עקוב אחר התקדמות תהליך ההעברה בתצוגה. צלב שחור על רקע ירוק מסמל טרנספקציה מוצלחת בבאר זו, בעוד שפס שחור על רקע אדום פירושו שהיא לא הצליחה בזמן שהתאים עוברים טרנספקציה. מחממים מראש את מדיום הגידול DC עם השלמת תהליך ההעברה, הסר את הצלחת והוסף 80 מיקרוליטר ממצע הגידול DC החם מראש לכל באר.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית דגרו כעת את הצלחת למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. במהלך תקופת הדגירה, הוסף 100 מיקרוליטר ממדיום הגידול DC החם מראש לצינורות מטריצה באותו כיוון כמו הגדרת צלחת הקובטה של הגרעילה. לאחר תקופת הדגירה, העבירו את כל 100 המיקרוליטרים של תרחיפי התאים מהגרעין CVEs לצינורות המטריצה המסודרים מראש.

לאחר מכן הסר והשליך את הצינורות שבהם לא התרחשה טרנספקציה. לבסוף, דגרו את צינורות המטריצה למשך 24 שעות או מרווח זמן רצוי אחר. סמן צינורות einor עבור כל אחד מצינורות המטריצה הדגירה.

לאחר מכן העבירו את צינורות המטריצה מהחממה למכסה המנוע של תרבית תאים ואגד את צינורות המטריצה עבור כל דגימת ניסוי לתוך ה-eend dfs המסומן מראש. לאחר מכן, גלו את התאים בעדינות על ידי סיבוב צינורות ה-DPH הפנימיים בצנטריפוגה שולחנית למשך 10 דקות. ב-400 גרם, הסר את ה-snat והשהה מחדש את התאים במדיום גידול חופשי בסרום המכיל נגיף מחלת ניוקאסל או NDV ב-MOI של אחד באופן רופף.

מכסים את אנדורפינים האפי בצורה סטרילית ואז דוגרים על הצינורות למשך 45 דקות. לאחר תקופת הדגירה הזו, הוסף 900 מיקרוליטר של מצע גידול DC ודגר מחדש את הצינורות למשך שמונה עד 10 שעות נוספות. לקצור את ה-dcs המועברים והנגועים.

גלולה את התאים על ידי סיבוב צינורות ה-einor בצנטריפוגה שולחנית כמו קודם והסרת ה-dcs מונוציטים של snat הועברו עם IRNA המכוון ל-RIG I או ל-irna זוהר לא ספציפי ונדבקו ב-NDV כפי שמצוין על ידי סימן פלוס או נותרו לא נגועים כפי שמצוין על ידי סימן מינוס כפי שזוהה על ידי נוקדאון כמותי של R-T-P-C-R-A של R RGA ב-75%ברמת השעתוק נצפתה ירידה דומה בביטוי של אינטרפרון בטא. נצפה גם אפקטור במורד הזרם של RGA במפל האיתות של האינטרפרון. יתר על כן, הביטוי של אינטרפרון בטא בתאי בקרה לא נגועים לא היה ניתן לזיהוי.

בעוד שגן התגובה של MXA ואינטרפרון בטא במורד הזרם היה מינימלי. הנה. נתונים מהעברה שנייה של DCS עם rigi המכוון לאירנה שבוצעה כמו באיור הקודם מוצגים בניסוי זה. עם זאת, כל התאים נגועים ב-NDV ושולבה בקרה נוספת באמצעות מונוציטים DCS שלא נכרתו.

תוצאות השתקת הגנים היו דומות לאלו שנצפו באיור הקודם. כתם מערבי שנבדק עבור RGA גילה שביטוי החלבון של גן זה נחסם לחלוטין. נתיבים 1 ו-2 מציגים נתונים עבור ליזטים מתאים שלא נכרתו.

נתיבים 3 ו-4 מראים ליזטים מ-glow irna transfected תאים ונתיבים 5 ו-6 מראים ליזטים מתאים שהועברו עם RIG I המכוון ל-S Irna לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת, כולל הפלה של גנים רבים בו זמנית.