단일 세포 수준에서 캐비테이션 버블 (들) -cell 상호 작용 및 결과 Bioeffects을 조사하기위한 표면 패터닝와 마이크로 유체 시스템

이 실험 절차의 전반적인 목표는 표면 패터닝을 사용하여 미세유체 감금에서 캐비테이션 유도 생체 효과를 조사하여 탠덤 기포의 생성과 개별 표적 세포의 위치 및 모양을 정밀하게 제어하는 것입니다. 이 미세유체 시스템은 치료 및 건전한 출판 및 건전한 작동과 관련된 이러한 통과 캐비테이션 기포 및 세포의 실험을 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 표면 패터닝의 정밀도를 향상시키는 것입니다.

이를 통해 개별 세포의 생체 효과를 연구할 수 있으며 신뢰할 수 있는 기포-기포 상호 작용에서 높은 스트림 부하가 발생합니다. 칩 단계에서 표면 패터닝과 세포 준비는 다양한 기술과 팁을 포함하여 복잡하기 때문에 절차를 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 클린룸 슈트를 착용한 상태에서 클린룸에서 모든 미세 가공 절차를 수행하십시오.

각 금점의 면적을 25-30 평방 미크론 이내로 설계하여 거품 생성을 위해 레이저 에너지를 흡수할 수 있을 만큼 충분히 크지만 개별 세포가 그것에 부착되는 것을 방지할 수 있을 만큼 충분히 작도록 합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 화학 후드의 유리 슬라이드를 청소한 다음 스핀 코팅 후드로 진행합니다. 스핀 코더를 프로그래밍하여 2초 동안 1000RPM으로 가속하고 5초 동안 해당 속도를 유지한 다음 3초 동안 3000RPM으로 램프하고 30초 동안 해당 속도를 유지하도록 합니다.

그런 다음 진공 청소기를 사용하여 유리 슬라이드를 스핀 코더에 고정합니다. 그런 다음 슬라이드를 P20으로 덮고 스핀 사이클을 시작합니다. 다음으로, 동일한 사이클을 사용하여 NFR 네거티브 포토 레지스트를 적용합니다.

이제 섭씨 95도의 핫 플레이트에서 60초 동안 슬라이드를 굽습니다. 실온으로 냉각되면 포토리소그래피를 수행합니다. 크롬 마스크를 마스크 얼라이너에 장착하고 패턴 면이 슬라이드 쪽을 향하도록 합니다.

그런 다음 포토리소그래피 레시피를 9초 UV 노출로 하드 노출 모드로 설정하고 유리 기판을 마스크와 정렬합니다. UV 노출 후 슬라이드를 섭씨 95도에서 1분 동안 굽고 이전과 같이 식히십시오. 슬라이드에 패턴을 현상하려면 현상액에 60초 동안 넣은 다음 슬라이드를 증류수로 세척하고 질소 가스로 건조시킵니다.

현미경 검사로 패턴을 확인한 후 슬라이드를 섭씨 120도에서 5분 동안 굽고 실온으로 식힙니다. 이제 반응성 이온 에칭 기계에서 플라즈마로 슬라이드를 500 tor 및 100 watts에서 90 초 동안 청소합니다. E-beam 증발기를 사용하여 샘플을 플레이트 홀더에 테이프로 붙입니다.

5나노미터의 티타늄 층과 15나노미터의 금 층을 증착하도록 기계를 프로그래밍합니다. 해당 위치가 완료되면 기계를 환기시키십시오. 다음으로, NFR 레지스트 위에 있는 금을 제거하기 위해 포토레지스트 제거제 솔벤트가 담긴 비이커에 슬라이드를 밤새 담가둡니다.

다음날 슬라이드를 아세톤으로 세척한 다음 IPA로 세척한 다음 질소로 건조시킵니다. 슬라이드를 DI 물로 헹구고 질소로 다시 건조시킵니다. 이제 슬라이드를 섭씨 115도에서 5분 동안 가열합니다.

그런 다음 100와트의 산소 플라즈마 애셔를 사용하여 90초 동안 골드 도트 패턴 슬라이드를 청소합니다. 각 피브로넥틴으로 인코딩된 섬의 면적을 700-900제곱미크론 이내로 설정하여 정사각형 영역에서 적절한 헬라 세포 확산을 촉진하는 동시에 섬에 여러 세포가 응집될 가능성을 최소화합니다. 제작은 금 패턴과 매우 유사합니다.

S18 포지티브 포토레지스트를 사용하기 전과 같이 슬라이드를 스핀 코딩하고 섭씨 115도에서 코딩을 굽습니다. 그런 다음 포토리소그래피를 수행하여 마스크의 표시를 기판의 표시와 정렬합니다. 중앙 부분의 패턴을 확인하여 올바른 각도를 확인하고 금색 점에서 H 패턴까지의 스탠드오프 거리를 조정합니다.

포스트 베이크 없이 9초 동안 UV 노출을 실행합니다. 다음 차이점은 개발 단계가 45초밖에 걸리지 않는다는 것입니다. 반응성 이온 에칭의 경우 파리미터를 500 tor 100 watts 및 90 seconds로 설정합니다.

그런 다음 PLLG 페그 부동태화 용액 한 방울을 파라핀 필름 조각에 바르고 용액을 슬라이드의 패턴 면에 끼웁니다. 거품이 갇히지 않도록 하십시오. 45분 후 필름에서 슬라이드를 제거합니다.

슬라이드를 DI 물로 헹구고 질소로 건조시킵니다. 다음으로, 슬라이드를 포토레지스트 제거제(1165)에 연속적으로 담근다. 그런 다음 DI 물에서 50% 1165

그런 다음 DI 물만 넣으면 됩니다. 각 목욕 중에 초음파 수조에서 용액을 90초 동안 저어줍니다. 이제 핫 플레이트에서 슬라이드를 건조시킨 다음 데시케이터로 밀봉하고 섭씨 4도에서 보관하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 슬라이드를 마이크로채널 칩으로 조립합니다. 반응성 이온 에칭을 사용하여 주변 영역에서 PLLG 페그를 제거하기 전에 작은 PDMS 슬래브로 유리 기판의 패턴화된 영역을 차폐하는 데 주의하십시오. RIE 기계에서 패턴 유리를 꺼내고 작은 PDMS 슬래브를 제거합니다.

감소된 용량의 산소 플라즈마로 마이크로채널 PDMS를 처리한 후 입체경 아래의 패터닝된 유리 기판에 정렬합니다. 마이크로 채널 PDMS와 패터닝 유리 기판을 등각 접촉으로 가져옵니다. 이제 칩을 사용하십시오.

먼저, 분당 1마이크로리터로 30분 동안 PBS를 마이크로채널 아래로 흐르게 하여 칩을 프라임합니다. 그런 다음 동일한 유속으로 45분 동안 칩에 피브로넥틴 용액을 주입합니다. 기다리는 동안 밀리리터당 500만 개의 세포로 세포를 준비합니다.

건강한 상태와 높은 컨플루언스(confluencey)는 이 절차에서 매우 중요합니다. 나중에 칩을 통해 흐르는 용액을 PBS로 교체하고 유속을 분당 10마이크로리터로 높입니다. PBS가 5분 동안 흐르도록 합니다.

다음으로, 준비된 세포를 주사기로 칩에 주입합니다. 튜브에서 한 방울이 흘러나오면 주입을 중지하고 배출구를 조입니다. 그런 다음 칩을 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다.

나중에 배출구를 분리하고 세포 배양 배지로 칩을 5분 동안 분당 10마이크로리터로 플러시합니다. 5분 후 유량을 분당 0.75마이크로리터로 낮추고 칩과 펌프를 2시간 동안 인큐베이터로 옮깁니다. 2시간 후, 탠덤 버블 생성을 진행하고, 금색 점 패턴을 향하는 타이밍 컨트롤에 두 개의 펄스 NDI 레이저가 있는 도립 현미경으로 칩을 보고, 결과를 캡처할 준비가 된 고속 카메라를 사용합니다.

50미크론 기포의 경우 두 레이저 사이의 지연을 2.5마이크로초로 설정하고 출력을 10마이크로줄로 설정합니다. 그런 다음 고속 카메라 녹화를 레이저와 동기화하고 200나노초 노출로 초당 200만 프레임으로 녹화합니다. 따라서 기포 팽창, 붕괴 기포-기포 상호 작용 및 제트 형성의 역학이 기록됩니다.

기포-기포 상호 작용 및 다양한 캐비테이션 유도 생체 효과는 설명된 기술을 사용하여 단일 세포 수준에서 연구되었으며, 예를 들어 탠덤 기포와 제트 형성의 일시적인 상호 작용, 결과 유동장의 시각화 및 제트 속도 계산과 같은 기술을 사용했습니다. 탠덤 버블 주위의 방향성 분사 흐름은 초당 약 10미터이고 너비가 약 10미크론이므로 근처의 표적 세포에 충동적이고 국부적인 순전한 응력 및 응력 구배를 생성할 수 있습니다. 탠덤 버블에 의한 세포막 변형도 연구하였다.

멤브레인 변형 및 회복은 세포막의 앞쪽 가장자리에 부착된 기능화된 비드의 변위에 의해 강조됩니다. 인접한 비드의 트라이어드 좌표로부터, 국소 면적 변형률이 계산되었습니다. 이 회로도는 셀 표면의 다른 위치에서 최대 면적 변화를 보여줍니다.

앞쪽 가장자리는 주로 늘어나는 반면, 셀의 뒤쪽 가장자리 또는 측면은 압축되어 탠덤 버블 유도 분사 흐름에 의해 생성된 이질성 및 세포 변형을 나타냅니다. 셀 앞 가장자리에서 영역 변형의 시간적 변화는 몇 번의 빠른 진동에 이어 약 100마이크로초 동안 크고 지속적인 스트레칭, 그리고 수 밀리초의 시간 척도에서 점진적인 회복으로 구성됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 표면 패터닝에서 모양과 위치가 제어된 단일 세포의 생체 효과를 연구하기 위해 제어 가능한 기포-기포 상호 작용을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차에 따라 세포골격 박화 및 부부 이미징과 같은 다른 조치를 추가로 수행하여 탠덤 버블 처리의 세포 골격 재배열을 연구할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 서브프레틱 초음파 분야의 연구자들이 단일 세포 수준에서 포획 유도 생체 효과를 탐구할 수 있는 길을 열 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포 패터닝의 성공을 위해 양호한 세포 포화도와 조건을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

클린룸 화학 물질 및 레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 및 레이저 고글 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.