Name: 피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 학습하세요 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화를 위한 피더 및 제노 프리 프로토콜을. LM511-E8 코팅과 유세포 분석을 활용하여 일관된 수율의 CD34/CD45 양성 조혈 전구세포를 생성하는 이 방법은 혈액학 및 면역학 연구에 활용됩니다.

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우리는 그들의 기술 지원에 대한 Alina 리와 세이코 벤노에 감사드립니다. 또한 행정 지원을 제공한 와타나베 하루미 씨와 피터 카라기아니스 박사에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 일본 의학 연구 개발기관 (AMED)에서 재생 의학의 실현을위한 연구 센터 네트워크의 iPS 세포 연구 의 핵심 센터에 의해 지원되었다 (M.K.S.], 난치성 질환 연구를위한 프로그램 활용. AMED(17935423) [M.K.S.] 및 일본 과학기술청(JST) 혁신 센터[R.O. 및 M.K.S.]의 질병 별 iPS 세포.

1. 시약
<ol><li>세포주(인간 PSCs): 배아 줄기 세포(ESC) 또는 iPSC 라인 409B2 및 201B7(317-9)) 및 CBA11을 얻습니다.</li>
	<li>
시약 준비
	<ol>
<li>PSC 도금 매체: PSC 유지 보수 매체를 10 μM Y-27632와 혼합하고 4 °C에 보관하십시오.</li>
		<li>PSC 스페로이드 타일링 배지: PSC 유지 매체를 사용 직전에 625-1,250 ng/mL 인간 재조합 라미닌-511 E8 단편(LM511-E8)과 혼합합니다. 참고: LM511-E8은 미디어15에서혼합될 수 있다. 전길이 라미닌-511과 같은 다른 매트릭스는 미리 코팅되어야 하며, 심지어 그렇게 하더라도 분화 과정에서 부착된 중피소노이드를 유지하지 못한다.</li>
		<li>일 0 분화 매체: 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL 뼈 형태 유전학 단백질 4 (BMP4) 및 80 ng/mL 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)와 중이세말 기저 배지를 섞는다.</li>
		<li>2일차 분화 배지: 혈혈기 기저 배지를 1 μM SB431542, 80 ng/mL VEGF 및 100 ng/mL 줄기 세포 인자(SCF)와 혼합합니다.</li>
		<li>칼슘이나 마그네슘없이 인산완충식염수(PBS)를 준비합니다(재료 표참조).</li>
		<li>1 mM에 의해서 미네테트라아세트산(EDTA) 완충제: PBS 의 500 mL에 0.5 M EDTA의 1 mL을 추가합니다.</li>
		<li>EHT 배지: 조혈 기저 배지를 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL 혈전포이틴(TPO), 50 ng/mL Fms 관련 티로신 키나아제 3 리간드(Flt-3L), 20 ng/mL 인터류킨-6/6 수용체 알파(IL-6L)와 혼합 인슐린 트랜스퍼에이체-셀레늄-에탄놀라민, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B.</li>
		<li>FACS 완충제: PBS를 2% 태아 송아지 혈청과 1 mM EDTA와 혼합합니다.</li>
		<li>자기 분리 버퍼 를 준비합니다(재료 표참조).</li>
		<li>메틸셀룰로오스 기반 용지 를 준비합니다(재료 표참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PSC 식민지 형성
<ol><li>hPSCs를 0.5 μgcm-2 LM511-E8 코팅 된 6 웰 플레이트에서 mTeSR1에서 5% CO2로 37°C 인큐베이터에서70-80% 동률로 성장시다.</li>
	<li>
PSC 해리 (일 -4)
	<ol>
<li>배지를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 해리 액으로 세포를 헹구. 37 °C에서 15 분 동안 배양하십시오 (세포는이 시간에 담수하지 않습니다).</li>
		<li>PSC 유지 배지에서 세포를 중단하고, 현탁액을 적당한 크기의 튜브로 옮기고 세포를 200 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PSC 현탁액을 48,000-70,000 셀cm-2의 밀도로 플레이트(세포주에 따라 다름)에 미세 제조플라스틱 용기상에 5% CO2로 37°C 인큐베이터에서 밤새 배양한다. 참고: 96웰 마이크로 제작된 플라스틱 용기에 셀 서스펜션 100 μLwell-1을 권장합니다. 당신은 일반적으로 약 100 스페로이드를 산출하는 96 웰 플레이트에서 잘 20,000 세포를 종화한다.</li>
	<li>
타일링 PSC 스페로이드 에 LM511-E8 (3일차)
	<ol>
<li>P1000 마이크로파이프를 사용하여 부드럽게 파이펫팅하여 15 mL 원추형 튜브에 PSC 스페로이드를 수집하고 중력에 의해 침전하기 위해 2 분 동안 실온에서 서 스페로이드를 둡니다. 상급자 흡인.</li>
		<li>스페로이드 도금 배지에서 현탁액을 4-스페로이드 cm-2의 밀도로 코팅되지 않은 6웰 배양 플레이트내로 분배하고 37°C 인큐베이터에서 배양하여 5% CO2를 3일 동안 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 혈생 유도 (0 일)
<ol><li>배지를 흡인하고, 37°C 인큐베이터에 Day0 분화 배지 및 배양액을 5% O2 및 5% CO2(저산소 인큐베이터)로 첨가한다. </li>
	<li>Day0 분화 배지에서 2일간의 배양 후, 배지를 흡인한 다음 저산소 인큐베이터에 Day2 분화 배지 및 배양을 추가합니다.</li>
</ol>4. 혈균 내피의 격리 (4일째)
<ol><li>이틀 후, 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 세척한다. 해리 액으로 세포를 헹구. 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 5% CO2를 배양하였다.</li>
	<li>1 mM EDTA에서 세포를 부드럽게 중단하여 단일 세포 수준으로 해리하고, 현탁액을 50 mL 원엽 튜브로 옮기고 세포를 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 버퍼.</li>
	<li>CD34+ 마이크로비드 100 μL을 추가하고 부드럽게 피펫을 추가하십시오. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 100 μL CD34+ 비드 당 최대 2,000만 개의 셀을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>40 μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 걸.</li>
	<li>자기 분리기로 CD34+ 셀을 분리합니다.</li>
</ol>5. 내피-투-조혈 전이의 유도 (EHT)
<ol><li>
피브로넥틴 코팅
	<ol>
<li>PBS에서 1 mg/mL 피브로넥틴을 희석하여 5 μg/mL 피브로넥틴 코팅 용액의 필요한 부피를 준비합니다.</li>
		<li>코팅 용액의 0.5 mL를 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 접시를 실온에서 30 분 동안 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분류된 CD34+ 세포를 200 x g에서 3분 동안. EHT 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.</li>
	<li>세포 카운터를 사용하여 실행 가능한 세포 밀도를 결정합니다. EHT 배지를 첨가하여 세포 밀도를 200,000 셀 mL-1로 조정한다.</li>
	<li>피브로넥틴 코팅용액을 잘 코팅하여 흡인하고 버린다. CD34+ 세포 현탁액 0.5 mL를 각 피브로넥틴 코팅에 잘 분배한다.</li>
	<li>저산소 인큐베이터에서 1주일 동안 배양한다.</li>
</ol>6. 조혈세포의 유동 세포분석
<ol><li>
부동 셀 컬렉션: 배양 배지를 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 전달합니다. 3 분 동안 200 x g에서 배지를 원심 분리합니다.</li>
	<li>
부착 셀 수집
	<ol>
<li>0.5 mL의 PBS로 세포를 두 번 씻습니다.</li>
		<li>해리 액으로 세포를 헹구고 잉여 액체를 흡인하십시오.</li>
		<li>플레이트를 37°C 인큐베이터에서 5분 동안 배양한다.</li>
		<li>FACS 버퍼의 1mL에서 셀을 다시 일시 중단합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부동 세포와 부착 셀을 혼합합니다.</li>
	<li>세포를 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리합니다. FACS 버퍼의 50 μL에서 다시 일시 중단합니다. 암흑에서 실온에서 1 시간 동안 항 CD34 및 항 CD45 항체로 세포를 배양합니다.</li>
	<li>PBS로 세포를 두 번 세척하고 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를 씻고 상수부를 흡인하고 0.5 μg / mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole로 FACS 버퍼의 0.5 mL에서 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>유세포계별로 CD34 및 CD45 발현을 측정합니다.</li>
</ol>7. 조혈 세포의 식민지 형성 단위 (CFU) 분석
<ol><li>
조혈 세포 컬렉션 : 배지를 배양물로부터 15 mL 원점 관으로 옮김을 전달한다. PBS로 우물을 두 번 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>세포를 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리합니다. EHT 매체의 1 mL에서 다시 일시 중단하십시오. 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 확인합니다.</li>
	<li>항생제로 보충된 메틸셀룰로오스 계 매물 3 mL에 10,000개의 세포에 해당하는 현탁액 부피를 추가하고 16 G 또는 18 G 주사기와 잘 5번 섞습니다.</li>
	<li>전체 메틸셀룰로오스 기반 용지 현탁액을 6웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다.</li>
	<li>37°C 인큐베이터에서 5% CO2를 2주 동안 배양하면서 촉촉한 상태로 유지하였다. 접시를 방해 하지 마십시오. 콜로니는 움직임에 민감합니다.</li>
	<li>2 주 후, 현미경으로 식민지를 계산합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li>
<li>Lancrin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haemangioblast+generates+haematopoietic+cells+through+a+haemogenic+endothelium+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.</a> Nature. 457, 892-895 (2009).</li>
<li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone%2C+Heart%2C+and+Other+Mesoderm+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li>
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<li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+controls+the+specification+of+definitive+and+primitive+hematopoiesis+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).</li>
<li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+definitive+haemogenic+endothelium+and+arterial+vascular+endothelium+represent+distinct+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.</a> Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).</li>
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<li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7, 41165(2017).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

당사의 피더 및 제노 프리 정의 유도 방법은 HE 세포를 확장 가능한 방식으로 유도하는 정확하고 비용 효율적인 플랫폼을 제공합니다. 종래의 프로토콜10,11,12,13,14에서 혈혈성 내피의 충실한 형성은 PSC 콜로니 밀도 및 크기의 정밀한 제어의 부족에 의해 방해되고 있다, 모르포겐/사이토카인 기반 의 방향 분화의 효율성에 영향을 미칩니다. 우리는 기존의 프로토콜에서 각 독립적 인 배치에서 혈생 내피 유도의 불일치를 경험했다. 새로운 프로토콜은 PSC 콜로니 밀도 및 크기의 엄격한 조절을 가능하게하여 혈우병 내피 유도의 불일치를 극복합니다.
우리는 스페로이드의 균일 한 형성을 악용하고 이어서 총 4 일 만에 HE를 형성하기 위해 피더 및 제노가없는 정의 된 조건을 전달했습니다. 우리는 스페로이드 형성이 HE 세포의 일관된 형성을 보장한다는 것을 3개의 독립적인 세포주를 사용하여 확인했습니다. 대표적인 결과로서, 409B2 세포주들은 3개의 독립적인 실험에 기초하여 12.7%-23.6% CD34+ 세포 효율을 산출하였다. PSC 스페로이드 타일에 중요한 요소는 LM511-E8입니다. 우리는 우리의 경험에 있는 Matrigel 또는 전신 라미닌 제품과 같은 그밖 매트릭스로 이것을 대체하는 것을 추천하지 않습니다. 우리는 중피소노노이드가 마트리겔에서 쉽게 분리되어 분화 과정에서 손실되는 것을 경험했습니다. 그리고 마트리겔 이나 전체 길이 라미닌 은 사전 코팅없이 세포를 고정하지 않습니다.
이 프로토콜의 잠재적제한은 PSC 유지 관리 매체에 의존하여 PSC를 유지 관리한다는 것입니다. 우리는 StemFit와 같은 다른 매체를 시험했습니다, 그러나 우리는 혈생 유도를 손상했습니다. 아마도 세포는 우리의 짧은 시간 (4 일) 유도 프로토콜에서 다능성 상태에서 출구에 저항했다. 다른 매체에서 PSC를 유지하는 경우, PSC 유지 보수 배지에 세포를 적응시키고 분화하기 전에 몇 개의 구절을 수행하는 것이 좋습니다. 이 플랫폼은 세포의 체계적인 조작 및 분석, 그리고 잠재적 인 임상 사용을위한 조혈 세포의 기성 생산 및 대규모 유도를 허용합니다. 이 시스템의 장기적인 목표는 책임있는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하고 약물 스크리닝을 수행하기 위해 인간화 된 마우스 모델에서 면역 결핍 질환을 모델링하는 것입니다.

혈액학 및 면역 학적 장애에 대한 새로운 치료법의 개발은 환자에서 파생 된 자가 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 통한 질병 모델링 및 높은 처리량 약물 스크리닝을위한 강력한 플랫폼의 부족으로 인해 방해받고 있습니다. 다능성 줄기 세포 (PSC). 유도된 (i)PSC 기술의 돌파구는 환자의 세포에서 질병을 모델링하는 약속을 보유합니다, 그러나 참을성 있는 iPSCs에서 기능성 HSC의 설치는 애매했습니다. 인간 PSC에서 HSC를 파생시키기 위하여는, 배아 패터닝 및 전사프로그램의 적당한 유도는 열쇠 1, 2,3,4, 5,6, 7,8. 최근 조혈발달의 진전은 HSC 개발9에서 혈생내피(HE)의 역할을 입증하고있다. HE는 PSC로부터 유도될 수 있고 유전자 전달10,11, 12,13과같은 하류 개입에 순응한다. HE를 플랫폼으로 사용하여, 5가지 전사 인자(ERG,HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1)의조합을 통해 장기간 이식하고 다중 계보14로 분화하는 기능성 HSC를 성공적으로 유도하였다. 그러나, PSCs에서 HE의 가변적이고 비효율적인 생성은 임상 사용을 위한 조혈 세포의 기성 생산 및 대규모 유도와 더불어 세포의 체계적인 조작 그리고 분석을 방해했습니다.
여기서, 우리는 피더- 및 제노 가없는 정의 된 조건으로 4 일 안에 HE를 도출하는 비용 효과적이고 정확한 방법을 설명합니다. 이 방법에서는 iMarix-511에서 스페로이드 형성 및 자발적인 재평화는 HE 세포의 효율적인 유도에 중요한 PSC 콜로니의 일관된 밀도를 보장합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>15575</td><td>0.5 M EDTA</td></tr><tr><td>40 &mu; M 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>40&mu; M 세포 여과기</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>6웰 플레이트</td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240-112</td><td>페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B</td></tr><tr><td>항-CD34 항체</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07776</td><td>항-CD34 항체</td></tr><tr><td>항-CD45 항체</td><td>Biolegend</td><td>304012</td><td>항-CD45 항체</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP-010</td><td>BMP4</td></tr><tr><td>CD34 마이크로비즈</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-703</td><td>CD34 마이크로비즈</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Wako</td><td>038-23101</td><td>CHIR99021</td></tr><tr><td>Essential 6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15165-01</td><td>혈인성 기초 배지</td></tr><tr><td>Essential 8</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15169-01</td><td>중배피 기초 배지</td></tr><tr><td>Ezsphere SP 마이크로플레이트 96well</td><td>AGC</td><td>4860-900SP</td><td>미세 가공 플라스틱 용기&nbsp;</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biosera</td><td>FB-1365/500</td><td>FCS</td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>Millipore</td><td>FC010-100MG</td><td>피브로넥틴</td></tr><tr><td>Flt-3L</td><td>R& D 시스템</td><td>308-FK-005</td><td>Flt-3L</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>L-글루타민</td></tr><tr><td>IL-6/IL-6R&알파;</td><td>R& D 시스템</td><td>8954-SR</td><td>IL-6/IL-6R&알파;</td></tr><tr><td>iMatrix-511</td><td>Matrixome</td><td>892 001</td><td>LM511-E8</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민</td></tr><tr><td>MACS 완충제</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td>자기 분리 완충제</td></tr><tr><td>Methocult 4435MethoCult&trade; H4435 농축</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>04435</td><td>메틸셀룰로오스 기반 매체</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>85850</td><td>PSC 유지 관리 매체</td></tr><tr><td>PBS</td><td>nacalai tesque</td><td>14249-24</td><td>PBS</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Wako</td><td>031-24291</td><td>SB431542</td></tr><tr><td>SCF</td><td>R& D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>SCF</td></tr><tr><td>Stemline II 조혈 줄기 세포 확장 매체</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0192-500ML</td><td>조혈 기초 매체</td></tr><tr><td>TPO</td><td>R& D Systems</td><td>288-TPN</td><td>TPO</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td>해리 솔루션</td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R& D 시스템</td><td>293-VE-010</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>와코</td><td>253-00513</td><td>Y-27632</td></tr></tbody></table>

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

인간 다능성 줄기 세포 (PSCs)에서 기능성 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)를 유도하는 것은 혈액학 및 악성 장애를 치료하는 자가 이식에 대한 어려운 목표였습니다. 혈우병 내피 (HE)는 전사 인자에 의해 기능성 HSPC를 생산하거나 강력한 방식으로 림프구를 유도하는 의무 플랫폼입니다. 그러나 HE를 파생하는 현재의 방법은 수율에 비용이 많이 들거나 가변적입니다. 이 프로토콜에서는 피더 및 제노가 없는 정의된 조건에서 4일 이내에 HE를 도출하는 비용 효율적이고 정밀한 방법을 확립했습니다. 그 결과 HE는 내피-투-조혈 전이를 겪고 CD34+CD45+ 클로노제닉 조혈 전구를 생산했다. 기능성 HSPC를 생성하기 위한 당사의 플랫폼의 잠재적 용량은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 분야가 있을 것입니다.

PSC 식민지를 형성하는 회로도는 그림 1A에도시되어 있습니다. PSC 스페로이드는 하루 동안 마이크로 제작 된 플라스틱 용기에 형성됩니다. 대표적인 결과로, 20,000 409B2 셀은 다른 세포주가 더 높은 밀도 (마이크로 제작 플라스틱 용기의 96 웰 당 30,000-40,000 셀)를 필요로 할 수 있지만, 마이크로 제작 플라스틱 용기의 96 웰 당 처리 될 수있다. 이러한 구체는 LM511-E8이 있는 배양 접시에 도금될 때 거의 2차원 배양으로 자발적으로 평평해지게 된다.
혈생 유도의 회로도는 그림 1B에예시되어 있습니다. PSC 콜로니가 750 μm의 직경으로 성장하면 배지가 순차적으로 변경되어 중피 오르가노이드를 유도합니다. PSC 콜로니는 4일째까지 순차적 배지 변화에 의해 중피소노이드로 분화하는 동안 점차 맑은 쪽 위구조가 될 것이다. 4 일째에, 혈혈 내피내피통은 자기 선별에 의해 중피 성 오르가노이드에서 지정되고 이어서 EHT 배지에 있는 섬유넥틴에 도금됩니다. 5-1000만 CD34+CD45-세포는 1백만 PSC를 함유하는 스페로이드로부터 예상된다(도 1C).
세포가 형태학적으로 내피에서 조혈세포로 변하는 것이 관찰된다(보조영상1). 7일째에 조혈 칵테일과 자극시 조혈 전구 세포의 대표적인 상 대비 이미지는 도 2A에나와 있다. 조혈 세포 식민지는 배양에서 나타났다.
대표적인 유세포분석 플롯은 도 2B에도시되어 있다. 전체 배양은 조혈 칵테일로 자극되고 7일째에는 유세포측정에 의한 CD34 및 CD45의 발현을 분석한다. 조혈 전구 세포는 CD34 및 CD45를 발현한다.
CFU 분석은 CD34+ CD45+ 조혈 전구 세포로부터의 과립구/대식세포 콜로니의 생성을 나타내고 있다(도 2C). 추정 된 식민지 수는 10,000 셀 당 38 CFU-G / M입니다 (그림2D)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2.jpg"> 그림 1: 바둑판식 PSC 콜로니 및 혈생 내피를 통한 후속 조혈 분화의 회로도. (A) PSC 식민지를 형성하는 개략적 과정. PSC는 PSC 유지 보수 매체에서 LM511-E8 코팅 6웰 플레이트에 유지됩니다. 4일째에, 세포는 해리용액을 사용하여 단일 세포 수준으로 분리및 해리되고, 이어서 Y-27632로 PSC 유지 보수 매체에서 마이크로 제조 플라스틱 용기에 도금되고 하룻밤 동안 배양하여 스페로이드를 형성한다. 3일째에 스페로이드는 PsC 유지 보수 매체에 LM511-E8로 도금되고 3일 동안 배양됩니다. 0일째가 되면 스페로이드는 거의 2차원 배양으로 자발적으로 평평해지게 됩니다. 스케일 바 = 200μm. (B) 0일째에, 배지는 Day0 분화 배지로 대체되고 저산소 인큐베이터에서 배양된다. 분화의 2일째에, 배지는 Day2 분화 매체로 대체된다. 혈생 내피 농축의 4일째에, CD34+ 세포는 6일 동안 EHT 배지에서 섬유넥틴 코팅 된 12 웰 플레이트상에 자성으로 분류되고 배양된다. (C) CD45 및 CD34의 대표적인 유동세포계 플롯은 CD34로 분류된 4일째 세포의 발현이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig2.jpg"> 그림 2: 조혈 특성 분석. (A) 7일째에 조혈칵테일로 자극을 받은 후 조혈 전구세포의 대표적인 위상 대비 이미지. 스케일 바 = 200μm. (B) 7일째에 조혈 칵테일과 자극시 전체 배양물의 CD45 및 CD34의 대표적인 유동 세포분석 플롯. (C) 11일째 조혈 전구 세포로부터 생성된 과립구/대식세포 콜로니의 대표적인 상 대비 이미지. 배율 막대 = 500μm. (D) 10,000셀당 CFUs 수입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Video" src="/files/ftp_upload/59823/59823vid1.jpg"> 보조 비디오 1: EHT 비디오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/EHT_video.avi">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서, 우리는 피더-및 제노프리 조건에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 혈생 내피를 정밀하게 형성하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 프로그램을 가질 것이다.

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

우리는 인간 다능성 줄기 세포에서 생성 혈액 세포를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 혈우병 내피 세포의 일관되고 정확한 수율을 얻을 수 있다는 것입니다. 우리는 우리의 플랫폼이 치료 화합물에 대한 질병 모니터링 및 선별에 광범위한 응용 프로그램을 가능하게 할 것으로 기대합니다.이 기술은 혈액학 및 면역학 연구에 특히 유익합니다. 이 방법은 인간 혈액 세포의 유전 적 개입 또는 유전자 편집에 적용 될 수있다. 그것은 혈우성 내피 세포에서 벡터의 쉬운 유도를 허용합니다.가장 중요한 점은 PSC 콜로니타이핑을 위한 LM511-E8 코팅입니다. 코팅을 건너뛰거나 다른 매트릭스로 대체하지 않는 것이 좋습니다. 우리는 해리 버퍼와 함께 세포를 헹구는 방법과 LM511-E8로 플레이트를 코팅하는 방법을 보여주기 때문에 시각적 데모가 중요합니다.mTeSR1 배지에서 LM511-E8 코팅 6웰 플레이트에서 인간 만능 줄기 세포 또는 hPSC를 70~80%로 성장시다. 혈진 유도 4 일 전에, 매체를 흡인 하 고 PBS와 함께 두 번 세척. 해리 용액으로 세포를 헹구고 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오.PSC 유지 보수 매체에서 세포를 다시 중단하고 서스펜션을 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 이송한다. 세포를 3분 동안 200배 G로 원심분리합니다. 초퍼를 흡인하고 PSC 도금 배지에서 세포를 재일시 중단합니다.원고 지시에 따라 PSC 서스펜션을 미세 가공 플라스틱 용기에 플레이트하고 하룻밤 동안 배양합니다. 혈우성 유도 3일 전에 PSC 구형 튜브를 15밀리리터 원추형 튜브로 부드럽게 피펫하고 실온에서 2분 동안 방치하여 중력에 침전시합니다. 슈퍼네티드를 흡인하고 스페로이드 도금 매체에서 스페로이드를 재중단합니다.서스펜션을 LM511-E8 코팅 10센티미터 배양 접시에 평방 센티미터당 4개의 스페로이드밀도로 분배하고 3일 동안 배양합니다. 3 일 후, 배지를 흡인, 저산소 인큐베이터에서 2 일 동안 세포를 배양 제로 분화 배지를 추가합니다. 그런 다음, 하루 0 매체를 흡인하고, 2일째 분화 매체를 추가하고, 문화를 2일 더 넣습니다.이틀 후, 매체를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 씻는다. 해리 용액으로 세포를 헹구고 37도에서 30 분 동안 배양하고 이산화탄소5 %를 사용하십시오. 인큐베이션 후, 부드럽게 하나의 밀리모어 EDTA에서 그들을 다시 중단하여 세포를 소양.서스펜션을 50밀리리터 원내 튜브로 옮기고, 세포를 3분 동안 200회 G로 원심분리합니다. 체퍼를 흡인하고 자기 분리 버퍼의 300 마이크로 리터로 세포 펠릿을 재중단합니다. CD34 양성 마이크로비드 100마이크로리터를 세포에 넣고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다.실온에서 30분 동안 배양한 다음 40마이크로미터 셀 스트레이너를 사용하여 서스펜션을 변형시키고 자기 분리기를 사용하여 CD34 양성 세포를 분리합니다. 밀리리터 섬유넥틴 코팅 용액 당 5 마이크로그램의 0.5 밀리리터를 24개의 웰 배양 플레이트의 각 웰에 분배하고, 30분 동안 실온에서 플레이트를 배양한다. 한편, 정렬된 CD34 양성 세포를 3분 동안 200배 G로 선별하고, EHT 배지의 1밀리리터에서 펠릿을 재연한다.세포 카운터를 사용하여 실행 가능한 세포 밀도를 결정하고, EHT 배지를 추가하여 밀리리터당 세포 밀도를 200, 000 세포로 조절한다. 섬유네틴 코팅 된 우물에서 코팅 용액을 흡면하고 폐기하고 CD34 양성 세포 현탁액의 0.5 밀리리터를 각 우물에 분배합니다. 1 주일 동안 저산소 인큐베이터에서 세포를 배양.부동 세포를 수집하려면 배양 배지를 15 밀리리터 원내 형관으로 옮기고 원심분리기를 3분 동안 200회 G로 이송한다. 그런 다음 슈퍼 네티퍼를 흡인합니다. 부착 된 세포를 수집하려면 PBS의 0.5 밀리리터로 두 번 씻고 해리 버퍼로 헹구습니다.잉여 액체를 흡인하고 5 분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하십시오. Facs 버퍼의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 부동 및 부착 셀을 혼합합니다. 3 분 동안 혼합 된 세포를 200 배 G로 원심 분리 한 다음 슈퍼 나탄을 흡인하고 Facs 버퍼의 50 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다.팍스 버퍼의 50 마이크로리터에서 항 CD34 및 항 CD45 항체를 희석;세포에 추가하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 세포를 배양. 그런 다음 PBS로 셀을 두 번 씻고, 매 씻은 후 3 분 동안 200 회 G에서 원심 분리합니다. 슈퍼나티를 흡인시키고 0.5 밀리리터의 팩 버퍼에서 셀을 재연하여 밀리리터 당 0.5 마이크로그램을 사용할 수 있습니다.유동 세포측정에 의해 CD34 및 CD45 발현을 측정합니다. 조혈 세포를 수집하려면 배양 배지를 15 밀리리터 원내 튜브로 이송한다. PBS로 우물을 두 번 부드럽게 헹구어 나머지 세포를 수집합니다.3 분 동안 200 배 G에서 세포를 원심 분리 한 다음 슈퍼 나탄을 흡인하고 EHT 매체의 1 밀리리터에서 다시 중단합니다. 세포를 계산한 후, 10, 000 세포를 메틸셀룰로오스 이격 된 매체의 3 밀리리터에 추가하고 항생제로 보충하고 16 게이지 주사기를 사용하여 5 번 혼합합니다. 전체 미디어 서스펜션을 6웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다.세포를 촉촉하게 유지하려면 접시의 빈 우물에 물 이나 PBS를 추가하십시오. 2 주 동안 세포를 배양하여 식민지가 운동에 민감하기 때문에 접시를 방해하지 않도록하십시오. 2 주 후, 현미경으로 식민지를 계산합니다.세포 형태학적으로 조혈 칵테일과 자극시 내피세포에서 조혈세포로 바뀝니다. 조혈 세포 식민지는 문화에 등장. 조혈 선조 세포는 CD34 및 CD45를 발현하므로 유동 세포측정은 CD34 및 CD45의 발현을 분석하여 조혈 세포 식민지의 존재를 확인하는 데 사용된다.콜로니 형성 단위 분석은 CD34 양성 및 CD45 양성 조혈 선조 세포로부터 과립구 또는 대식파지 콜로니의 생성을 시연하였다. 콜로니 수는 10, 000 세포당 38개의 식민지 형성 단위로 추정되었다. 가장 중요한 단계는 PSC 스페로이드를 집계하는 것입니다.표면 메트릭이 이 프로토콜의 효율성에서 가장 결정적인 요소라는 것을 발견했습니다. 이 절차는 자연적으로 발생하는 세포 및 대식세포와 같은 부적 세포의 기성 생산에 선행될 수 있습니다. 이 플랫폼을 통해 연구자들은 인간 조혈 개발의 주요 결정적 요인을 탐구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

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정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

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여기에서는 만능 줄기 세포를 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC) 유사 세포로 분화할 수 있는 프로토콜인 확장된 내피 세포 배양 방법(EECM)에 대해 설명합니다. 이들 세포는 내피 세포 부착 분자 발현을 보여주므로 시험관 내에서 면역 세포 상호작용을 연구하기에 적합한 인간 혈액-뇌 장벽 모델입니다.

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학습하세요 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화를 위한 피더 및 제노 프리 프로토콜을. LM511-E8 코팅과 유세포 분석을 활용하여 일관된 수율의 CD34/CD45 양성 조혈 전구세포를 생성하는 이 방법은 혈액학 및 면역학 연구에 활용됩니다.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

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