사용 모성 유전자 제품의 기능 조작 체외 난자의 성숙

이 프로토콜의 전반적인 목표는 제브라 피쉬 난모세포의 체외 성숙을 수행하고, 원하는 경우 수정 전에 모계 유전자 산물을 기능적으로 조작하는 것입니다. 이 방법은 배아에 대한 모계의 기여의 중요성과 관련된 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체외에서 난모세포를 배양한 다음 수정 및 생존 가능한 배아를 생산하는 것입니다.

그리고 원하는 경우, 수정 직후 초기 배아에서 작용하는 모계 유전자 산물의 기능적 조작을 허용합니다. 우선, 체외 배양 조작 8-10일 전에 망사를 사용하여 원하는 균주의 단일 수컷 물고기와 단일 암컷 물고기 여러 세트를 짝짓기 탱크로 옮깁니다. 하룻밤 동안 짝짓기 탱크에 두십시오.

다음 오후까지 물고기가 짝짓기를 할 수 있도록 한 후, 어망을 사용하여 짝짓기 중에 알을 낳는 암컷을 분리하여 별도의 수조에 넣습니다. 이 암컷에게 하루에 두 번 거의 같은 양의 소금물, 새우, 생선 음식 플레이크가 포함된 식품 혼합물을 먹이십시오. 멸균 상태에서 L-글루타민(PH 7.0)이 포함된 Leibovitz의 L-15 배지 20ml를 50ml 원뿔형 튜브에 추가합니다.

그런 다음 10 Normal 수산화나트륨을 사용하여 PH 9.0으로 만듭니다. L-15 Medium 9ml를 50ml 원뿔형 튜브 2개에 추가합니다. 그런 다음 한 튜브에는 DHP를, 다른 튜브에는 DHP를 표시합니다.

DHP 튜브에 DHP 10마이크로리터, DH2O 490마이크로리터, 10%BSA 500마이크로리터를 추가합니다. DHP 튜브에 100마이크로리터의 10밀리그램 겐타마이신, 400마이크로리터의 DH2O 및 500마이크로리터의 10%BSA를 추가합니다. 난모세포를 박리하려면 먼저 DH2O에 0.2%트리카인 원액을 준비하고 하나의 어금니 트리스 PH 9.0으로 PH 7.0으로 완충합니다.

이 용액을 섭씨 4도로 유지하십시오. 시설의 일일 조명 주기가 끝나기 0-4시간 전에 250ml 비커에 0.2% 트리케인 원액(PH 7.0) 20ml를 80ml의 생선 물에 넣고 섞습니다. 물고기가 익숙한 하루가 끝나고 4시간 이내에 절차를 시작하는 것이 중요합니다.

그렇지 않으면 난모세포가 제대로 성숙하지 않습니다. 숟가락을 사용하여 트리카인 용액에서 안락사된 생선을 모아 생선 물에 짧게 헹굽니다. 그런 다음 생선을 종이 타월 위에 올려 여분의 물을 흡수합니다.

깨끗한 면도날을 사용하여 가슴 지느러미 수준에서 안락사된 물고기의 목을 베십시오. 그런 다음 해부 가위로 물고기의 복부 쪽을 세로로 절개하여 앞쪽 끝에서 항문 부위까지 연장합니다. 페트리 접시에 물고기를 올려 놓고 입사광이 있는 해부 현미경 아래에 놓습니다.

그런 다음 한 쌍의 절개 겸자를 사용하여 난소 부분을 분리하고 조직을 Leibovitz의 L-15 Meidum, DHP 4ml가 들어 있는 35 x 10mm 배양 접시로 옮깁니다. 이제 해부 겸자로 난모 세포를 난포 덩어리에서 부드럽게 분리하십시오. 초기 단계 4개의 난모세포를 분류하는데, 이 난모세포는 거의 최대 크기이며 짙은 불투명한 세포질과 난모세포 내에 비대칭으로 위치한 쉽게 보이는 생식 소포(GV)를 특징으로 합니다.

초기 단계의 난모세포는 버리고 반투명한 성숙한 5단계 난자는 버립니다. 유리 목초지 피펫을 사용하여 초기 단계의 4개의 난모세포를 4ml의 Leibovitz의 L-15 배지와 DHP가 함유된 두 번째 35 x 10mm 플라스틱 배양 접시로 옮깁니다. 플러스 DHP 용액을 포함하는 최소량의 마이너스 DHP 배지를 접시로 옮깁니다.

mRNA를 주입하는 경우 주입 직전에 RNA 등급의 역삼투압수와 0.2몰 염화칼륨을 사용하여 mRNA를 0.1몰 염화칼륨의 최종 용액으로 희석합니다. 주입 직전에 Morpholinos 또는 MO를 주입하는 경우 RNA 등급 역삼투압 물과 0.2 몰 염화칼륨을 사용하여 MO를 원하는 농도로 희석하여 0.1 몰 염화 칼륨의 최종 농도를 달성합니다. 그런 다음 주입을 수행하려면 미세한 집게로 수동으로 난모세포를 잡고 당긴 유리 모세관 피펫으로 만든 바늘을 사용하여 야생형 4기 난모세포에 약 1나노리터를 주입합니다.

미성숙 및 주입된 난모세포를 섭씨 26.5도의 DHP 배지에서 계속 배양합니다. 약 30분마다 난모세포가 손상되지 않은 상태로 유지되고 점진적으로 반투명하게 되어 적절한 성숙을 진행하고 있는지 확인합니다. 목초지 피펫을 사용하여 용해되는 난모세포를 제거합니다.

그리고 매체의 품질을 유지하기 위해 실험실 쓰레기 비커에 버리십시오. 신선한 DHP 배지 부피의 약 절반으로 배양 배지를 교환하여 난모세포 용해량에 따라 명확한 용액을 유지합니다. 대부분의 난모세포가 반투명해지고 GV가 더 이상 나타나지 않는 경우 매우 미세한 집게를 사용하여 난모세포와 난모세포 사이의 공간이 늘어난 영역의 난포막을 찢습니다.

막의 일부를 벗겨내고, 벗겨진 부분을 누른 상태에서 막에서 난모세포를 굴려 빼냅니다. 또 다른 중요한 단계는 난포막을 제거하는 것입니다. 이 층이 완전히 제거되지 않으면 수정과 융모막 확장이 방해됩니다.

최소한의 배지에서 모낭화된 난모세포를 배양 DHP 배지 몇 방울이 있는 페트리 접시에 옮기고 수정을 진행합니다. 난모세포 성숙 단계가 거의 끝나갈 무렵, 그리고 혈포가 형성되기 전에, 500마이크로리터의 행크 용액(Hank's Solution)에 5명의 수컷의 고환을 사용하여 정자 용액을 준비합니다. DHP 배양 배지에서 고가분화된 난모세포에 10-50마이크로리터의 정자 용액을 추가합니다.

그런 다음 10초 동안 기다립니다. 피펫을 사용하여 E3 배지 몇 방울을 난모세포에 추가합니다. 1분 정도 기다린 다음 E3 매체를 사용하여 플레이트를 플러딩합니다.

수정된 배아가 발달하도록 한 후, 투과광 광학 장치가 있는 해부 현미경을 사용하여 분열 단계를 통한 진행을 관찰하여 이전에 수정 및 병기에 대해 설명한 바와 같이 성공적인 수정을 보장합니다. GFP의 발현에서 볼 수 있듯이, 체외 배양에서 온 난모세포는 2시간 이내에 난모세포 발달 전반에 걸쳐 외인성 mRNA에서 단백질을 생산할 수 있습니다. 그러나 난자 형성의 4단계에서 배양 조건을 시작하는 난모세포만이 성숙한 5기 난모세포로 발달할 수 있습니다.

이 실험에서 주입된 야생형 오로라 B mRNA는 해당 유전자인 세포섬에서 돌연변이의 표현형 효과를 구출합니다. 대조군의 배아는 또한 해당 돌연변이 표현형을 나타내기 위해 발달할 수 있습니다. translation-blocking Morpholino의 주입은 lrmp-MO를 난모세포에 주입하는 것에서 알 수 있듯이 알려진 돌연변이 표현형을 성공적으로 표현할 수 있으며, 이는 해당 돌연변이 무의미한 주기의 돌연변이 표현형을 모방합니다.

mRNA 코딩은 또한 야생형 또는 돌연변이 난모세포에 주입하여 초기 배아 내에서 해당 산물을 시각화할 수 있습니다. 예를 들어, 여기에서 볼 수 있듯이 Sass6-mCherry 단백질은 중심솜 마커 Gamma tubulin에 의해 표지된 병소에 국한됩니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행한다면 약 5-6시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 절차를 서두르지 말고 혈포 형성 및 수정 전에 난모세포가 적절하게 성숙할 수 있도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 배아 고정과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 관심 유전자의 구출 또는 RNA 또는 단백질의 국소화와 같은.

개발 후, 이 기술은 초기 배아 발생 분야의 연구자들이 제브라피시에서 모계 유전자 산물의 기여를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라 피쉬 난모세포의 체외 성숙을 통해 모계 유전자 산물을 기능적으로 조작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.