뿌리와 배설물 개발의 장기 공 촛점 이미징을위한 단순한 챔버

여기에는 높은 수치의 조리개 목적과 침지 매질로서의 퍼플 루오로 데칼린을 사용하여 최대 3 일 동안 뿌리 및 배축 발달의 고해상도 공 초점 저속 이미징을위한 간단한 기술이 제시됩니다.

이 이미징 시스템의 전반적인 목표는 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 세포 이하 해상도에서 며칠에 걸쳐 식물 기관의 발달을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 다세포 유기체의 세포가 기관 형성 동안 성장과 증식 패턴을 어떻게 조정하는지와 같은 식물 형태 형성의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 설정이 간단하고 풍요로운 시스템과 같이 저속 촬영에 자주 사용되는 전문 장비에 의존하지 않는다는 것입니다.

우리는 잎 조직 내 이미징을 위한 과불화데칼린의 장점을 설명하는 New Phytologist의 Littlejohn과 Love의 간행물을 읽었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 시작하려면 유리 절단기를 사용하여 1mm 두께의 슬라이드에서 3mm 너비의 유리 스트립을 만듭니다. 그런 다음 시아노아크릴레이트 접착제 또는 양면 테이프를 사용하여 새 슬라이드의 너비를 가로질러 약 45mm 간격으로 스트립을 고정합니다.

금형 역할을 하기 위해 동일한 치수로 추가 슬라이드를 만듭니다. 이제 가스 투과성 PDMS 껌으로 같은 높이의 개스킷을 만드십시오. 두 번째 슬라이드에 약간의 절대 에탄올을 적시고 PDMS를 유리 스트립 높이까지 슬라이드에 평평하게 만듭니다.

다음으로, 블레이드에 앱솔루트 에탄올을 적시고 과도한 PDMS를 제거합니다. 에탄올에 젖은 공구가 PDMS에 달라붙지 않기 때문에 이는 매우 중요합니다. 그런 다음 PDMS를 스트립 높이까지 다시 평평하게 만듭니다.

그런 다음 묘목과 한천 슬래브를 고정할 PDMS에 구멍을 자릅니다. 일관된 캐비티 크기를 생성하기 위해 우리는 perspecs로 제작된 맞춤형 수제 절단기를 사용하지만 대신 면도날을 사용할 수 있습니다. 그런 다음 바깥쪽 가장자리 주위를 다듬어 개스킷을 약 2mm 두께로 만듭니다.

이제 PDMS 개스킷이 없는 슬라이드에 두 유리 스트립에 커버슬립을 놓습니다. 그런 다음 커버 슬립 아래의 공간으로 공간을 채울 수있을만큼 약 1 밀리리터의 따뜻한 액화 한천 배지를 피펫으로 만듭니다. 한천은 관심있는 실험 화합물을 포함 할 수 있습니다.

다음으로, 튜브에서 소량의 PFD를 흔들어 일부 PFD를 공기 평형화합니다. 한천이 굳으면 약 200마이크로리터의 PFD를 PDMS 개스킷에 넣되 완전히 채우지는 마십시오. 한천 슬래브에서 커버슬립을 제거하고 PDMS 젤 개스킷의 웰에 맞는 모양으로 자릅니다.

한천과 개스킷 벽 사이에 2-4mm의 간격을 두십시오. 그런 다음 공기 평형 PFD로 챔버를 완전히 채웁니다. 중력성 1차 뿌리를 이미지화하기 위해 셀룰로오스 막(cellulosic membrane)이 한천 슬래브 표면의 물리적 장벽으로 사용됩니다.

한천 슬래브는 또한 1.5% 한천이 아닌 0.8% 한천으로 더 부드러워야 합니다. 한천 블록과 거의 같은 치수의 멤브레인 조각을 자릅니다. 그런 다음 80% 에탄올로 살균하고 자연 건조시킵니다.

건조되면 멤브레인을 액체 성장 배지에 담근 다음 한천 표면으로 옮깁니다. 시작하려면 한천에 최대 3 개의 묘목을 조심스럽게 놓습니다. 그들의 포지셔닝은 매우 중요합니다.

자엽과 hypocotyl은 PFD에서 떠 다니는 한천 가장자리에 매달려 있어야합니다.성장을 위해 묘목 사이에 공간이 제공되어야합니다. 묘목이 너무 커서 챔버에 맞지 않으면 말릴 수 있습니다.

그런 다음 선택한 목표와 일치하는 두께의 커버슬립을 사용하여 챔버를 닫습니다. 가장자리를 따라 부드럽게 눌러 유리 스트립과 접촉하도록 합니다. 다른 유리 슬라이드를 사용하여 커버 슬립을 부드럽게 눌러 두 개의 유리 스트립에 고르게 놓이

그런 다음 세로로 반으로 자른 미세 기공 수술 테이프를 사용하여 커버 슬립을 고정합니다. 이제 이미징하기 전에 표본이 약 30분 동안 가라앉도록 합니다. 챔버를 위해 애기장대 탈리아나 묘목을 준비하려면 먼저 씨앗을 70% 에탄올로 살균하십시오.

그런 다음 보충된 배지에 심습니다. 심은 씨앗을 섭씨 4도에서 2-4일 동안 층화합니다. 그런 다음 심은 씨앗을 섭씨 22도로 옮기고 16시간의 일일 광 주기로 수직 방향으로 자랍니다.

측면 뿌리를 이미지화하려면 7-10일 동안 식물을 성장시킨 다음 이미징 챔버로 옮깁니다. 이미징 챔버에서 생리학적 속도로 자라는 측근은 30분마다 기록되었습니다. 측면 뿌리는 또한 비교를 위해 동일한 매체의 표준 페트리 플레이트에서 성장했습니다.

개별 뿌리의 성장 속도는 두 설정 모두에서 많이 달랐지만 범위는 두 조건 모두에서 비슷했습니다. 전반적으로 성장률은 길이가 길어질수록 증가했습니다. 이미징 챔버 또는 플레이트에 있는 식물의 성장 속도는 성장의 첫 27시간 동안 구별할 수 없었습니다.

두 그룹 모두 동일한 평균 측근 길이로 시작했습니다. 원형질막 마커(plasma membrane marker)와 미세소관 마커(micro tubule marker)를 함께 발현하는 측근(lateral roots)을 이미징 챔버에서 1시간 간격으로 이미지화했습니다. 뿌리는 그 위치에서 매우 안정적이어서 몇 시간 동안 컨포칼 이미징을 할 수 있었습니다.

증식의 시각적 지표는 실험 전반에 걸쳐 관찰되었습니다. 분열 세포에서는 pre-prophase, bands, mitotic spindles 및 phragmoplasts를 모두 확인할 수 있습니다. 3일 동안 처음 48시간 동안은 이미징 챔버에서 페트리 플레이트와 비교하여 측면 뿌리 성장이 크게 다르지 않았지만 72시간이 지나면 평균 성장률이 떨어졌습니다.

그러나 챔버에 있는 뿌리의 상당 부분은 여전히 72시간 동안 판의 뿌리와 비슷한 속도로 자랐습니다. 일단 마스터하면 모든 것이 순조롭게 진행되면 15분 안에 두 개의 슬라이드를 만들 수 있습니다. 이 이미징 시스템을 사용하여 약물 치료의 효과를 연구할 수 있지만 세척 실험을 위해서는 관류 시스템과 같은 다른 더 복잡한 방법이 필요합니다.

개발 후, 이 기술은 식물 형태 형성을 뒷받침하는 세포 사건을 추적할 수 있는 저렴하고 간단한 수단을 제공했으며, 특히 애기장대 탈리아나의 측면 뿌리에서 기관 형성을 공유하는 공간 요구의 세포 가장자리의 역할을 탐구하기 위해 사용했습니다.