Name: 매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 배우세요 미세유체 장치를 이용하여 꽃가루관과 이끼 원형체의 신장 능력을 연구하는 방법을. 1µm 미세 간극을 통한 세포 변형 과정을 고해상도 이미징으로 관찰할 수 있습니다.

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우리 감사 헤 쓰쓰이 D. 구리 유전자 변형 식물, 포함 T. fournieriRPS5Ap::H2B tdTomato 선, A. thaliana UBQ10pro::H2B mClover 선 각각 제공. 이 작품에 의해 연구소의 Transformative 바이오-의 분자 나고야 대학과 일본 고급 식물 과학 네트워크를 지원 했다. 이 작품에 대 한 재정 지원 일본 과학과 기술 기관에서 교부 금에 의해 제공 되었다 (ERATO 프로젝트 부여 없음. 남에 대 한 JPMJER1004), 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (번호. JP16H06465 고 남에 대 한 JP16H06464), 그리고 도전적인 탐구 연구 (no. 26600061에 대 한 부여 뉴욕 및 그랜트 no. 25650075와 15 K 14542와이 스에 대 한)에 대 한 과학 진흥 (JSP) 연구비를 위한 일본 사회.

1. PDMS Microdevice 꽃가루 관 성장 검사의 제작 및 Protonemata 이끼
참고: 우리는 실리콘 웨이퍼에 PDMS 몰드를 준비 하 maskless 사진 평판 장비를 사용. 시스템의 운영에 관한 세부 사항은이 원고에서 생략 됩니다. 표준 사진 평판 기술은9 는 포토 마스크를 사용 하 여이 원고에 설명 된 PDMS 몰드를 만드는 데 사용할 수 있습니다.
<ol><li>11g 사전 폴리머 PDMS 혼합물을 부 어 (탄성 기본: 10: 1의 비율로 경화제) 각 4 인치 형으로.</li>
	<li>형 단계 1.1 진공 챔버에 20 분에 드</li>
	<li>비 대류 오븐에서 90 분 65 ° C에서 경화 후, 금형에서 PDMS 레이어를 껍질 하 고 생 검 펀치를 사용 하 여 유체 채널에 액세스 구멍을 펀치. 참고: 꽃가루 관 장치에 대 한 구멍의 크기는 암 술의 직경을 반영 하기 위해 조정 될 해야 합니다. 이 값이 따라서 종에 의해 달라질 수 있습니다. 이 실험에서 우리는 암 술만 위한 1 m m 구멍 및 액체 중간 저수지에 대 한 1.5 m m 구멍 찍 었다고. 모스 protonemata 장치는 4mm 구멍 샘플 저수지에 대 한 사용 되었습니다.</li>
	<li>PDMS 층 및 유리 하단 접시 (지름에서 3.5-5 c m) 50 플라즈마 공기 노출 s.</li>
	<li>미세 네트워크를 완전히 봉쇄 비 대류 오븐에서 30 분 동안 유리 바닥 접시와 65 ° C에서 열 PDMS 레이어를 누릅니다.</li>
</ol>2. 루트 머리카락에 대 한 PDMS Microdevice의 제조
<ol><li>1.1-1.3 루트 및 루트 머리 렌에 대 한 두 개의 PDMS 레이어를 준비 하는 금형을 사용 하 여 단계를 반복 합니다. 참고: 루트 microdevice에서 액체 중간 저수지에 2mm 구멍을 사용.</li>
	<li>노출 50 플라즈마 공기 PDMS 레이어 모두 s.</li>
	<li>맞춤 바탕 화면 동기 기를 사용 하 여 stereomicroscope에서 2 개의 PDMS 층을 조립. 참고: 이러한 PDMS 레이어에 microchannels 서로 직면해 야 합니다. 조립, 전에 두 레이어에 정렬 마크 일치 하는지 확인 하십시오.</li>
	<li>미세 네트워크를 완전히 봉쇄 비 대류 오븐에서 30 분 65 ° C에서 열.</li>
	<li>생성 된 microdevice에서 커버 슬립을 제거 하 고 장치는 직경 5 cm 유리 하단 접시에 놓습니다.</li>
</ol>3. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 꽃가루 관 (Torenia fournieri)에 대 한
<ol><li>20 분에 대 한 수정된 니 매체 앞에서 설명한15 및 고압 121 ° C에서 매체를 준비 합니다. 참고: 수정 니 매체의 조성은 NH43 (80 mg/L), 알 것3 (125 mg/L), Ca (3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2포4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0.5 mg/L), H3보3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0.025 mg/L), 총2MoO4‧2H2O (0.025 mg/L), 자당 (50000 mg/L), 그리고 카 세 인 (500 mg/L). 준비 된 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 4 개월 동안 적어도.</li>
	<li>26% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 압력가 이온된 수를 사용 하 여 준비 하 고 0.3 µ m 기 공 필터 솔루션을 필터링. 참고: 준비 중간 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 1 개월.</li>
	<li>3.1 및 3.2 1:1 (v/v) 비율에 단계에서 준비 하는 시 약을 혼합. 참고:이 매체 준비 되어야 한다 신선한 각 사용에 대 한.</li>
</ol>4. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 루트 머리카락 (애기 thaliana)에 대 한
<ol><li>0.215% (w/v) 村 重 & Skoog 매체, 0.05% (w/v) MES, 1% (w/v) 자당과 이온된 수 한 천 1% (w/v)의 솔루션을 준비 합니다. 압력솥 20 분 동안 121 ° C에서 솔루션.</li>
</ol>5. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 모스 Protonemata (Physcomitrella patens)에 대 한
<ol><li>전 모스 protonemata BCDAT 중간16 페 트리 접시에 품 어. 참고: BCDAT 매체의 조성은 1mm MgSO4, 10 m m 알 것3, 45 µ M FeSO4, 1.8 m m KH2포4 (pH 6.5 코와 조정), 추적 요소 솔루션 (0.22 μ M CuSO4, 0.19 µ M ZnSO4, 10 µ M H3보 3, 0.1 µ M 총2MoO4, 2 µ M MnCl2, 0.23 µ M CoCl2및 0.17 µ M 기), 1 m m CaCl2및 5 밀리미터 diammonium (+)-주석산.</li>
	<li>문화는 microdevice에서 BCDATG 매체에 이끼. 참고: BCDATG 매체는 0.5% (w/v) 포도와 BCDAT 매체. 준비 된 매체는 1 개월 4 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 생체 외에서 Culturing T. fournieri 는 Microdevice에서 꽃가루 관의
<ol><li>진공 챔버에 꽃가루 관 microdevice을 놓고 20 분 드.</li>
	<li>진공 약 실에서 있는 microdevice를 제거 하 고 아주 좋은 팁는 micropipette를 사용 하 여 암 술 입구에 성장 매체를 소개. 같은 매체에 그들의 정상에 남아 있는 우물 채우십시오. 내부는 microchannels 만든 진공에 의해 매체와 모든 microchannels 가득 때까지 몇 분 동안 기다립니다.</li>
	<li>접시에 습도 유지 하기 위해 유리 하단 접시에 몇 가지 젖은 종이 타월을 놓습니다.</li>
	<li>야생-타입에서 꽃가루 곡물을 전송 해 부 바늘을 사용 하 여 그것의 오명에 T. fournieri '파란색과 흰색' 꽃. 참고: 또한 유전자 변형 T. fournieri 와 함께이 실험 실시 '바이올렛 왕관' 꽃 ( RPS5Ap::H2B-tdTomato 17선), 붙일 레이블된 정자 세포와 식물 핵을 포함 하는 꽃가루 관.</li>
	<li>잘라 좋게 스타일 (1 ㎝ 길이)는 블레이드를 사용합니다.</li>
	<li>그림 2와 같이 장치에 컷된 스타일을 삽입 합니다.</li>
	<li>접시에는 뚜껑을 넣고 테이프로 봉인.</li>
	<li>어둠 속에서 5-6 h 28 ° C에 인큐베이터에 장치를 넣습니다.</li>
</ol>7. A. thaliana 루트 머리는 Microdevice에서의 생체 외에서 Culturing
참고: 단계 7.1 7.9 (제외 7.3 및 7.5) 층 류 후드에서 수행 되어야 한다.
<ol><li>A. thaliana 컬럼비아 (열-0)에서 종자 소독와 유전자 변형 라인 UBQ10pro::H2B mClover (형광 핵 마커 포함) 5 분에 대 한 살 균 액체 (5% (v/v) 가구 표 백제와 0.02% (v/v) 트라이 톤 X-100)에서 그들을 몸을 담글 하 여.</li>
	<li>철저 하 게 린스 압력가 마로 소독 물 살 균된 씨.</li>
	<li>어둠 속에서 4 ° C에서 2 일 동안 물에 씻어 서 씨앗 저장 합니다.</li>
	<li>밤새 UV 빛에서 microdevice를 소독.</li>
	<li>진공 챔버에는 microdevice을 놓고 20 분 드.</li>
	<li>장치는 micropipette 사용 하 우물에 성장 매체를 소개 합니다. 진공에서 매체와 모든 microchannels 채웁니다 때까지 몇 분 정도 기다립니다.</li>
	<li>접시에 습도 유지 하기 위해 유리 하단 접시에 압력가 젖은 종이 타월을 놓습니다.</li>
	<li>장치의 입구에 소독된 씨앗을 전송 합니다.</li>
	<li>접시에는 뚜껑을 넣고 테이프로 봉인.</li>
	<li>연속 하얀 빛 아래에서 22 ° C에서 인큐베이터에 수직으로 장치를 놓습니다.</li>
	<li>외피의 4-10 일 후 루트 머리 성장 확인. 밝은 분야와는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 형광 이미지를 얻을.</li>
</ol>8. 피. patens (이끼) 미세 장치에서 Protonemata의 생체 외에서 Culturing
참고: 단계 8.2 8.6 (8.3)을 제외 하 고 층 류 후드에서 수행 되어야 한다.
<ol><li>25 ° c.에 연속 하얀 빛 아래에서 1 주일 동안 배양 접시에 셀로판으로 덮여 BCDAT 매체에 P. patens 스트레인 Gransden 200418 preculture</li>
	<li>UV 광원을 층 류 두건에서 하룻밤 microdevice 소독.</li>
	<li>진공 챔버에는 microdevice을 놓고 20 분 드.</li>
	<li>성장 매체는 micropipette 사용 하 우물에 소개. 진공에서 매체와 모든 microchannels 채웁니다 때까지 몇 분 정도 기다립니다.</li>
	<li>접시는 접시에 습도 유지 하기 위해 microdevice를 주변에 압력가 물을 추가 합니다.</li>
	<li>microdevice의 입구에 모스 protonemata 조직의 작은 조각을 전송 하 고 연속 하얀 빛 아래에서 25 ° C에서 인큐베이터에서 조직 문화.</li>
	<li>외피의 2-3 주 후 모스 protonemata 성장 확인. 현미경을 사용 하 여 밝은 필드 이미지를 얻을.</li>
</ol>9. T. fournieri 꽃가루 관 성장 시간 경과 영상
<ol><li>이미지 수집 하드웨어를 갖춘 거꾸로 형광 현미경에는 microdevice를 배치 (예., CCD 카메라) 및 소프트웨어. Microgap 위치를 찾아. 참고: 이미지 수집 소프트웨어 사용 했습니다 상용 제품 (자료 테이블). µManager와 같은 오픈 소스 현미경 소프트웨어 사용할 수 온라인 (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager) 이기도합니다. 더 높은 해상도 이미지를 현미경에 현미경 콘덴서를 설치 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>모든 10 필드 밝은 이미지를 캡처 현미경 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 s.</li>
	<li>관찰 하기 위해 붙일 레이블된 정자 세포와 RPS5Ap::H2B tdTomato 라인의 꽃가루 관 식물 핵, 561 nm 레이저는 견본을 비추는 및 대역 통과 광 필터를 사용 하 여 (578/105 nm). 참고: 꽃가루 관 성장의 시간 경과 이미지는 자주 체포 되었다, 비록 이미징 성장에 영향을 미치는 듯 하지 않았다. 그러나, 그것은 항상 레이저 강도, 노출 시간, phototoxicity 및 photobleaching는 fluorophore의 최소화 하기 위해 시간 간격을 최소화 하 고 좋습니다.</li>
	<li>이미지의 명암과 밝기를 조정 하 고 ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용 하 여 비디오 파일을 준비.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 위의 결과 얻기 위해 정확 하 게 지켜질 필요가 있다. 첫째, PDMS 층 및 유리 하단 접시 표면 둘 다 대우 되어야 한다 플라즈마로 충분 한 양의 결합 하기 전에 시간에 대 한. 그렇지 않으면, 팁 성장 세포는 microgaps를 건너는 동안 PDMS 층 유리 표면에서 분리 로컬 수 있습니다. 루트 머리와 모스 protonemata 프로토콜에서 다른 중요 한 단계는 microdevice의 살 균입니다. 일반적으로, 루트 머리카락과 모스 protonemata 세포는 몇 주에 대 한 교양은 microdevice에 있이 필요가 있다. 없이 장치를 살 균, 미생물은 이러한 팁 성장 세포의 성장에 영향을 미칠 수 번성 수 있습니다. 실험 반나절 내 결론은 꽃가루 관 장치의 살 균, 중요 하지 않습니다. 우리는 정기적으로 살 균 없이 꽃가루 관 장치를 사용 하 고 실험 하는 동안 어떤 바람직하지 않은 효과 관찰 하지 않았다.
아닌 디자인 관심사의 세포에...

낙인에 꽃가루 곡물 발 아, 후 각 곡물 계란 세포 및 중앙 셀 더블 수정에 대 한 난에 정자 세포를 운반 단일 꽃가루 관을 생성 합니다. 꽃가루 관 스타일을 통해 연장 하 고 결국은 난을 도달 하는 그들의 방법1에 따라 여러 지도 신호를 감지 하 여. 신장, 동안 꽃가루 관 발생 하는 일련의 물리적 장벽; 전송 추적 셀, 채워집니다 그리고 꽃가루 관 그들의 대상 (그림 1A)2도달 하 난의 분 micropylar 개통을 입력 해야 합니다. 따라서, 꽃가루 관은 그들의 주위에서 압축 스트레스를 견 뎌 하는 동안 물리적 장애물을 관통할 수가 있어야 합니다. 루트 머리 포장된 토양 입자 (그림 1B)의 형태로 환경에서 물리적 장애물을 견딜 해야 합니다 팁 성장 하는 식물 세포의 또 다른 유형입니다.
꽃가루 관의 다양 한 기계적 특성 연구, turgor 압력 및 영역의 셀의 꼭대기, 초기 plasmolysis3,방법4 와 셀룰러 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정 될 수 있는 강성을 포함 한 (CFM) 5 , 6, 각각. 그러나, 이러한 방법은 혼자 꽃가루 관 성장 경로 따라 물리적 장벽을 통해 elongating 수 인지 공개 하지 않습니다. 모니터링 vivo에서 꽃가루 관 신장 수는 대체 기법 두 광자 현미경7이다. 그러나,이 방법으로, 그것은 개별 꽃가루 관의 형태학 적 변화를 관찰 하기 어려운 난 조직 깊숙한. 또한, 루트 머리 성장 토양에서 수 수 시각 계산 x 선 단층 촬영 (CT) 및 자기 공명 영상 (MRI)8를 사용 하 여 낮은 해상도와. 여기, 우리는 기존의 현미경에는 셀의 변형 과정의 고해상도 이미지를 사용할 수 있는 방법 제시.
여기에 설명 된 방법의 전반적인 목표는 꽃가루 관, 루트 머리를 포함 하 여 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 시각화 하 고 protonemata 매우 작은 공간에서 이끼입니다. 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 렌이이 원고에 광학 투명 하 고 공기 침투성, 우리 수 장치 내부에 살아있는 세포를 문화 고 현미경 아래에서 그들의 성장 행동 관찰. 그것은 또한 마이크로 만들 수 ~ 금형의 사용과 소프트 리소 그래피 기술9 나노미터 스케일 공간. 이러한 기능은 물리적으로 밀폐 된 환경에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 공부 수 있습니다.
이 작품에서는, 우리는 미세 장치에 1 µ m 넓은 간격 (높이 4 µ m)를 건설 하 고 원통형 꽃가루 관 (약 8 µ m)의 직경 보다 훨씬 작은 이러한 인공 장애물을 관통 하는 꽃가루 관의 기능을 검사. 이 실험 플랫폼 microgaps 꽃가루 관의 응답을 시각화 하 고 셀의 변형 과정을 추적 하 고 응답의 시간 경과 이미지를 캡처 수 있습니다. 우리는 또한 렌 루트 머리카락과 모스 protonemata의 침투 능력을 조사 하는 데 사용할 수 있는 개발. 여러 렌 공장 루트10,11,12,13 모스 protonemata14 성장과 높은 해상도에서 시각화를 가능 하 게 날짜에 보고 되었습니다. 우리의 장치에 루트 머리 성장 채널 시리즈 루트 성장 챔버에 수직으로 연결 하 고 개별 루트 머리 (직경에서 약 7 µ m)는 1 µ m 넓은 간격으로 유체 채널 가이드. 우리는 또한 이끼를 경작이 물리적 장벽에 대 한 그들의 응답을 검사 하는 microgaps를 포함 하는 microdevice에서 protonemata (직경에서 약 20 µ m). 제안 된 미세 기반 접근 방식을 다른 현재 사용할 수 있는 방법으로 시험 될 수 있는 매우 작은 공간을 통해 연장 하는 다양 한 팁 성장 하는 식물 세포의 기능을 탐구 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>다우코닝</td><td>실가드184</td><td></td></tr><tr><td>무라시게 & Skoog Medium</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>392-00591</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>50 mm 유리 바닥 접시</td><td>Matsunami 유리</td><td>D210402</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 유리 바닥 접시</td><td>Iwaki&nbsp;</td><td>3971-035</td><td></td></tr><tr><td>수술용 블레이드</td><td>Feather</td><td>No.11</td><td></td></tr><tr><td>생검 펀치</td><td>Harris</td><td></td><td>Uni-Core</td></tr><tr><td>젤 로딩 팁</td><td>Bio-Bik</td><td>124-R-204</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>이 맞춤형 현미경</td></tr><tr><td>에 대한 카탈로그 번호를 사용할 수 없습니다.MetaMorph 이미징 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

Vivo에서, 팁 성장 하는 식물 세포의 물리적 장벽; 시리즈를 극복 하기 위해 필요한 그러나, 연구 방법론 등 제한적인 조건에서 세포 행동을 시각화에 부족 합니다. 이 문제를 해결 하려면 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 기판에 성장 챔버 팁 성장 식물, 마이크로 조작 좁은 간격 (~ 1 μ m)의 시리즈를 포함 하는 셀에 대 한 개발 했습니다. 이 투명 한 소재를 사용 하면 시간 경과 영상에 의해 microgap 침투 하는 동안 개별 셀에 팁 신장 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 그들은 관통는 microgap 꽃가루 관의 형태학 변화 관찰이 실험 플랫폼을 사용 하 여 합니다. 우리이 과정 붙일 레이블된 식물 핵의 모양에 동적 변화와 꽃가루 관에서 정자 세포를 점령. 또한, 우리 1 µ m 간격 침투 루트 머리카락과 모스 protonemata의 기능을 시연 했다. 이 체 외에 플랫폼은 물리적으로 제한 된 공간에 개별 세포 응답을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 팁 성장 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

그림 1에서 볼 수 있듯이 팁 성장 하는 식물 세포에서 발생 하는 일련의 그들의 성장 경로 비보따라 물리적 장벽. 미세 체 외에서 세포 문화 플랫폼이이 연구에 사용 검사는 성장 하는 팁의 세 가지 유형의 1 µ m 인공 격차 (그림 3를 통해 식물 세포 (꽃가루 관, 루트 머리, 및 모스 protonemata)에서 프로세스 그림 4, 그림 5). 꽃가루 관 연구에 대 한 라이브 셀 이미징 꽃가루 관 뿐만 아니라 식물 핵의 꼭대기 지역에 형태학 상 변화 및 발생 (보충 영화 1, 2)는 매우 작은 공간에 대 한 응답에서 정자 세포 모니터링 하 사용 되었다.
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팁 성장 하는 식물 세포, 꽃가루 관, 루트 머리, 등의 기능을 조사 하 고 미세 장치에서 protonemata, 매우 좁은 간격 (~ 1 μ m)을 통해 길게 하기 이끼 하는 방법을 설명 합니다.

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

이 방법은 끝에서 자라는 식물 세포가 세포의 물리적 장벽을 어떻게 통과하는지와 같은 식물 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존 현미경에서 마이크로미터 규모의 갭에서 세포의 변형 과정을 재구성하는 고해상도 이미지를 획득할 수 있다는 것입니다. 성장하는 꽃가루 관과 이끼 원생동물을 검사하기 위한 장치를 만들려면 먼저 약 11g의 PDMS를 만들어 4인치 주형에 넣습니다.그런 다음 진공 챔버에서 20분 동안 금형의 가스를 제거합니다. 다음으로 섭씨 65도에서 90분 동안 곰팡이를 경화시킵니다. 경화되면 금형에서 PDMS 층을 벗겨내고 생검 펀치 도구를 사용하여 PDMS 내 채널의 액세스 구멍을 엽니다.그런 다음 PDMS와 5cm 유리 접시를 공기 플라즈마에 50초 동안 노출시킵니다. 미세유체 네트워크를 밀봉하려면 PDMS 층을 유리 접시에 누르고 섭씨 65도에서 30분 동안 경화시킵니다. 모근 검사를 위해 설계된 마이크로 장치를 만들기 위해 두 개의 금형을 로드하고 경화시킵니다.채널 구멍을 펀칭할 때는 2mm 펀치를 사용하십시오. 두 층을 모두 공기 플라즈마에 50초 동안 노출시킨 후 실체 현미경 아래에서 커버슬립을 포함하여 함께 결합합니다. 이를 위해 맞춤형 정렬 도구를 사용하십시오.미세유체 네트워크를 밀봉하기 위해 오븐에서 30분 동안 어셈블리를 경화시킵니다. 경화 후 장치에서 커버 슬립을 제거하고 5cm 유리 접시에 옮깁니다. 꽃가루 튜브 마이크로 장치를 사용하기 전에 진공 챔버에서 20분 동안 가스를 제거하십시오.끝이 가는 마이크로피펫을 사용하여 암술 주입구에 성장 배지를 추가합니다. 동일한 매체로 다른 웰을 로드합니다. 채널이 채워질 때까지 몇 분 정도 기다립니다.한편, 촉촉한 종이 타월을 접시에 넣어 현지 습도를 유지하는 데 도움이 됩니다. 이제 T.fournieri 파란색과 흰색 꽃에서 꽃가루 알갱이를 수집하십시오. 해부 바늘을 사용하여 알갱이를 암술머리에 옮깁니다.다음으로, 1cm 길이의 수분 스타일을 세로로 자른 다음 절단 스타일을 미세 유체 장치의 입구에 삽입합니다. 절단 스타일을 핀셋으로 미세유체 장치의 입구에 삽입할 때 스타일을 손상시킬 수 있으므로 스타일을 너무 세게 잡지 않는 것이 중요합니다. 그런 다음 테이프를 사용하여 접시에 뚜껑을 닫고 접시를 섭씨 28도의 인큐베이터로 옮겨 5-6시간 동안 어둠 속에 두어야 합니다.층류 후드 아래에서 작업하면서 형질전환 A.thaliana Columbia 종자를 살균하는 것으로 시작합니다. 세척액에 5분 동안 담가둡니다. 그런 다음 오토클레이브 물로 씨앗을 철저히 헹굽니다.멸균 상태가 되면 씨앗을 섭씨 4도의 어둠 속에서 48시간 동안 보관합니다. 며칠 후 사용하기 전에 마이크로 장치를 20분 동안 가스를 제거하십시오. 다음으로, 미세하게 기울어진 피펫을 사용하여 적절한 성장 배지를 장치의 웰에 로드하고 용액이 모든 채널을 통해 당겨질 때까지 몇 분 동안 기다립니다.또한 습도를 유지하기 위해 축축한 종이 타월을 접시에 올려 놓으십시오. 이제 준비된 시드를 장치의 입구로 옮깁니다. 그런 다음 테이프를 사용하여 뚜껑을 단단히 닫고 접시를 지속적인 빛이 있는 섭씨 22도의 인큐베이터로 옮깁니다.사용하기 전에 마이크로 장치를 밤새 UV 아래에서 살균하십시오. 다음 날 20분 동안 마이크로 장치의 가스를 제거합니다. 가스가 제거되면 마이크로웰에 적절한 성장 배지를 로드합니다.채널이 점차적으로 채워지는 동안 습도를 유지하기 위해 약간의 오토클레이브 물로 마이크로 장치를 둘러쌉니다. 이끼 protonemata 조직의 작은 조각을 마이크로 장치의 입구로 옮깁니다. 이제 지속적인 빛 아래에서 섭씨 25도에서 장치를 배양하십시오.2-3주 동안 자란 후 현미경으로 결과의 명시야 이미지를 촬영합니다. 끝에서 자라는 식물 세포는 토양의 뿌리 털 경로는 말할 것도 없고 전달관 및 미세유와 같은 생체 내 성장 경로를 따라 일련의 물리적 장벽을 만나게 됩니다. 제시된 미세유체 체외 세포 배양 플랫폼을 통해 꽃가루관, 뿌리털 및 이끼 원생체의 세 가지 유형의 식물 세포에서 팁 성장 과정을 검사할 수 있습니다.보기는 장치의 1미크론 간격을 통해 이루어집니다. 이 크기의 마이크로 갭은 깨지기 쉽기 때문에 특히 반복 사용 후에는 닫히는 경우가 있습니다. 따라서 실험을 수행하기 전에 갭이 손상되지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다.꽃가루관 연구를 위해 살아있는 세포 이미징을 사용하여 꽃가루관의 정점 부위와 매우 작은 공간을 만났을 때 반응하는 식물핵 및 정자 세포의 형태학적 변화를 모니터링했습니다. 개발 후 이 기술은 식물 세포 생물학 분야의 연구자들이 매우 작은 공간에서 꽃가루관, 뿌리털, 이끼 원생동물과 같은 팁 성장 식물 세포의 신장 능력을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

development-microfluidic-devices-to-study-elongation-capability-tip

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 세포 캡처 및 문화를 활성화할 수 있습니다 microfluidic 장치의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는 이러한 microfluidic 채널 내에서 홈과 같은 패턴 microstructures는 셀 수있는 부두 내에서 낮은 전단 응력 영역을 작성하는 데 사용됩니다.

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

우리는 클린 룸이나 부드러운 리소그래피 필요없이 여러 독특한 변종에 유사한 동적 조건을 적용 할 수있는 마이크로 유체 장치를 생산하는 간단한 방법을 제시한다.

여러 고유 긴장 유학을위한 마이크로 유체 장치

출처: 케이빈, M. T. 외 Bacillus subtilis의 단세포 미세유체 분석. J. Vis. Exp. (2018)이 영상은 단일 세포 수준에서 박테리아 성장을 관찰하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 이 연구는 미세한 도랑 내에 갇힌 비운동성 박테리아 세포가 형광 현미경 아래에서 지속적으로 영양을 공급받고 영상화되는 과정을 보여줍니다. 이 장치는 여러 세대에 걸친 세포 분열 및 계통 추적의 실시간 시각화를 가능하게 합니다.

마이크로플루이딕 시스템에서 단일 세포 해상도로 박테리아 성장 추적

이 프로토콜에서는 원핵 생물의 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 생물반응기(PLBR)의 제작, 설정 및 기본 작동이 소개됩니다. 산업적으로 관련된 미생물을 원리 증명으로 분석하여 기존 방법으로는 거의 불가능했던 특정 기간 동안의 성장 속도, 형태 및 표현형 이질성에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

미생물 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 바이오리액터: 제작, 시스템 설정 및 작동

우리는 미크론 크기의 긴축의 시퀀스를 통해 전송하여 셀에 대한 척도를 측정하기 위해 마이크로 유체 기반 분석을 보여준다.

미세 유체 기술은 셀 변형능을 검사 할

유체 구성 요소와 통합된 미세 가공 장치는 생체 내 미세 환경을 모방한 세포 연구를 위한 체외 플랫폼을 제공합니다. 우리는 단일 또는 공존하는 화학적/전기적/전단 응력 자극 하에서 세포 반응을 연구하기 위해 폴리메틸메타크릴레이트 기반 미세유체 칩을 개발했습니다.

단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

우리는 예를 들어 새 균의 subtilis 를 사용 하 여 개별 세균성 세포 계보의 미세 분석 하는 방법을 제시. 메서드를 긴밀 하 게 제어 하 고 균일 한 성장 조건 셀 세대의 수백의 관찰 함으로써 미생물학에 전통적인 분석 방법의 단점을 극복 했다.

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

이 프로토콜은 미세소관 고분자 역학을 조사하는 데 적합한 미세유체 장치의 설계 및 제작에 대해 자세히 설명합니다. 미세 가공, 자동화된 흐름 제어 및 컴퓨터 모델링 기술의 합성은 세포 세포골격을 in vitro 프로빙하는 데 이상적으로 적합한 유연한 시스템을 가능하게 합니다.

미세소관 고분자 역학 조사를 위한 미세유체역학 기반 접근법 개발

배우세요 미세유체 장치를 이용하여 꽃가루관과 이끼 원형체의 신장 능력을 연구하는 방법을. 1µm 미세 간극을 통한 세포 변형 과정을 고해상도 이미징으로 관찰할 수 있습니다.

매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발

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