May 22nd, 2018
팁 성장 하는 식물 세포, 꽃가루 관, 루트 머리, 등의 기능을 조사 하 고 미세 장치에서 protonemata, 매우 좁은 간격 (~ 1 μ m)을 통해 길게 하기 이끼 하는 방법을 설명 합니다.
이 방법은 끝에서 자라는 식물 세포가 세포의 물리적 장벽을 어떻게 통과하는지와 같은 식물 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존 현미경에서 마이크로미터 규모의 갭에서 세포의 변형 과정을 재구성하는 고해상도 이미지를 획득할 수 있다는 것입니다. 성장하는 꽃가루 관과 이끼 원생동물을 검사하기 위한 장치를 만들려면 먼저 약 11g의 PDMS를 만들어 4인치 주형에 넣습니다.
그런 다음 진공 챔버에서 20분 동안 금형의 가스를 제거합니다. 다음으로 섭씨 65도에서 90분 동안 곰팡이를 경화시킵니다. 경화되면 금형에서 PDMS 층을 벗겨내고 생검 펀치 도구를 사용하여 PDMS 내 채널의 액세스 구멍을 엽니다.
그런 다음 PDMS와 5cm 유리 접시를 공기 플라즈마에 50초 동안 노출시킵니다. 미세유체 네트워크를 밀봉하려면 PDMS 층을 유리 접시에 누르고 섭씨 65도에서 30분 동안 경화시킵니다. 모근 검사를 위해 설계된 마이크로 장치를 만들기 위해 두 개의 금형을 로드하고 경화시킵니다.
채널 구멍을 펀칭할 때는 2mm 펀치를 사용하십시오. 두 층을 모두 공기 플라즈마에 50초 동안 노출시킨 후 실체 현미경 아래에서 커버슬립을 포함하여 함께 결합합니다. 이를 위해 맞춤형 정렬 도구를 사용하십시오.
미세유체 네트워크를 밀봉하기 위해 오븐에서 30분 동안 어셈블리를 경화시킵니다. 경화 후 장치에서 커버 슬립을 제거하고 5cm 유리 접시에 옮깁니다. 꽃가루 튜브 마이크로 장치를 사용하기 전에 진공 챔버에서 20분 동안 가스를 제거하십시오.
끝이 가는 마이크로피펫을 사용하여 암술 주입구에 성장 배지를 추가합니다. 동일한 매체로 다른 웰을 로드합니다. 채널이 채워질 때까지 몇 분 정도 기다립니다.
한편, 촉촉한 종이 타월을 접시에 넣어 현지 습도를 유지하는 데 도움이 됩니다. 이제 T.fournieri 파란색과 흰색 꽃에서 꽃가루 알갱이를 수집하십시오. 해부 바늘을 사용하여 알갱이를 암술머리에 옮깁니다.
다음으로, 1cm 길이의 수분 스타일을 세로로 자른 다음 절단 스타일을 미세 유체 장치의 입구에 삽입합니다. 절단 스타일을 핀셋으로 미세유체 장치의 입구에 삽입할 때 스타일을 손상시킬 수 있으므로 스타일을 너무 세게 잡지 않는 것이 중요합니다. 그런 다음 테이프를 사용하여 접시에 뚜껑을 닫고 접시를 섭씨 28도의 인큐베이터로 옮겨 5-6시간 동안 어둠 속에 두어야 합니다.
층류 후드 아래에서 작업하면서 형질전환 A.thaliana Columbia 종자를 살균하는 것으로 시작합니다. 세척액에 5분 동안 담가둡니다. 그런 다음 오토클레이브 물로 씨앗을 철저히 헹굽니다.
멸균 상태가 되면 씨앗을 섭씨 4도의 어둠 속에서 48시간 동안 보관합니다. 며칠 후 사용하기 전에 마이크로 장치를 20분 동안 가스를 제거하십시오. 다음으로, 미세하게 기울어진 피펫을 사용하여 적절한 성장 배지를 장치의 웰에 로드하고 용액이 모든 채널을 통해 당겨질 때까지 몇 분 동안 기다립니다.
또한 습도를 유지하기 위해 축축한 종이 타월을 접시에 올려 놓으십시오. 이제 준비된 시드를 장치의 입구로 옮깁니다. 그런 다음 테이프를 사용하여 뚜껑을 단단히 닫고 접시를 지속적인 빛이 있는 섭씨 22도의 인큐베이터로 옮깁니다.
사용하기 전에 마이크로 장치를 밤새 UV 아래에서 살균하십시오. 다음 날 20분 동안 마이크로 장치의 가스를 제거합니다. 가스가 제거되면 마이크로웰에 적절한 성장 배지를 로드합니다.
채널이 점차적으로 채워지는 동안 습도를 유지하기 위해 약간의 오토클레이브 물로 마이크로 장치를 둘러쌉니다. 이끼 protonemata 조직의 작은 조각을 마이크로 장치의 입구로 옮깁니다. 이제 지속적인 빛 아래에서 섭씨 25도에서 장치를 배양하십시오.
2-3주 동안 자란 후 현미경으로 결과의 명시야 이미지를 촬영합니다. 끝에서 자라는 식물 세포는 토양의 뿌리 털 경로는 말할 것도 없고 전달관 및 미세유와 같은 생체 내 성장 경로를 따라 일련의 물리적 장벽을 만나게 됩니다. 제시된 미세유체 체외 세포 배양 플랫폼을 통해 꽃가루관, 뿌리털 및 이끼 원생체의 세 가지 유형의 식물 세포에서 팁 성장 과정을 검사할
수 있습니다.보기는 장치의 1미크론 간격을 통해 이루어집니다. 이 크기의 마이크로 갭은 깨지기 쉽기 때문에 특히 반복 사용 후에는 닫히는 경우가 있습니다. 따라서 실험을 수행하기 전에 갭이 손상되지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다.
꽃가루관 연구를 위해 살아있는 세포 이미징을 사용하여 꽃가루관의 정점 부위와 매우 작은 공간을 만났을 때 반응하는 식물핵 및 정자 세포의 형태학적 변화를 모니터링했습니다. 개발 후 이 기술은 식물 세포 생물학 분야의 연구자들이 매우 작은 공간에서 꽃가루관, 뿌리털, 이끼 원생동물과 같은 팁 성장 식물 세포의 신장 능력을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
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이 기사는 미세유체 장치의 좁은 틈을 통해 꽃가루관 및 이끼 원형질망과 같은 끝쪽으로 성장하는 식물 세포의 연장 능력을 조사하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 마이크로미터 규모의 세포 변형 과정을 고해상도로 촬영할 수 있게 합니다.
Studying tip-growing plant cell behavior in physically constrained environments provides mechanistic insights into cellular adaptation under mechanical stress, relevant for understanding growth regulation in complex tissues. This microfluidic platform enables high-resolution visualization of subcellular dynamics during barrier penetration, supporting hypothesis testing in cellular mechanics and predictive modeling of growth responses. The approach offers a scalable in vitro system to de-risk target validation in plant developmental pathways by linking physical constraints to molecular readouts.
The microfluidic elongation assay fits within early discovery workflows where understanding cellular responses to physical cues informs target selection and pathway validation.