3: DNA 메틸화 분석

DNA 메틸화(DNA methylation)는 다양한 세포 맥락에서 유전자 발현에 영향을 미치는 DNA의 화학적 변형입니다. 많은 연구자들은 비정상적인 DNA 메틸화가 암과 같은 질병과 관련이 있기 때문에 이 과정의 메커니즘과 기능에 관심이 있습니다.

이 비디오에서는 DNA 메틸화의 원리와 이를 감지하는 방법을 다룹니다. 그런 다음 이러한 방법 중 하나인 중아황산염 분석 및 이 기술의 일부 응용 분야에 대한 일반적인 프로토콜을 살펴보겠습니다.

먼저 DNA 메틸화가 무엇이며 어떻게 검출할 수 있는지 살펴보겠습니다.

이 생화학적 과정에서 세포는 DNA의 시토신 염기에 메틸 그룹으로 알려진 화학 태그를 추가합니다. 대부분의 메틸화된 사이토신은 동일한 DNA 가닥의 구아닌(guanine) 염기 옆에서 발생하며, 이러한 인접 뉴클레오티드와 이들을 연결하는 포스포다이에스테르 결합(phosphodiester bond)을 "CpGs"라고 합니다. 대부분의 척추 동물 CpG는 메틸화되어 있지만, 메틸화되지 않은 CpG는 CpG 섬에서 서로 가깝게 발생하는 경향이 있습니다. 활발하게 발현된 유전자의 프로모터, 및 기타 다양한 조절 서열 요소 근처.

DNA 메틸화의 변화가 유전자 조절에 어떻게 기여하는지는 여전히 집중적인 연구의 대상입니다. CpG 섬의 메틸화는 특정 유전자의 기원 부모 특이적 표현인 게놈 각인과 같은 후성유전학적 과정에서 보이는 안정되어 있는, 장기 유전자 침묵시키기, 뿐 아니라 X 염색체 불활성화, 여성 포유류의 각 세포에 있는 2개의 X 염색체의 한의 침묵을 위해 중요한 것을 보입니다. CpG 섬의 비정상적인 메틸화로 인한 중요한 유전자의 억제는 또한 암으로 이어질 수 있는 통제되지 않은 세포 성장에 기여하는 것으로 나타났습니다. 기계적으로, DNA 메틸화는 전사 인자(transcription factor)가 프로모터(promoter)와 결합하는 것을 막거나, 히스톤(histone)을 변형하고 염색질(chromatin)을 전사적으로 허용되지 않는 상태로 리모델링하는 단백질을 모집함으로써 유전자 침묵(gene silencing)에 기여할 수 있습니다.

DNA의 메틸화 상태를 감지하는 방법에는 여러 가지가 있습니다.

한 가지 기술인 HELP 분석법은 HpaII 및 MspI라고 하는 두 가지 제한 엔도뉴클레아제를 포함하며, 이들은 각각 메틸화되지 않은 CCGG 염기서열만 절단하거나 메틸화되고 메틸화되지 않은 CCGG 염기서열만 절단합니다. 이 두 효소에 의해 생성된 소화 패턴을 비교함으로써 DNA의 메틸화 상태를 추론할 수 있습니다.

메틸화 DNA 면역침전(methylated DNA immunoprecite) 또는 ? MeDIP,? 메틸화된 시토신에 결합하여 메틸화된 DNA 염기서열을 농축하는 항체를 사용합니다.

마지막으로, 중아황산염 분석은 메틸화되지 않은 사이토신을 우라실로 전환하는 화학 반응을 수행하여 DNA에서 메틸화된 사이토신과 메틸화되지 않은 사이토신을 구별하는 데 사용됩니다. 이 변환 후, 중아황산염 처리된 DNA를 PCR에 적용하고 염기서열을 분석하며 참조 게놈과 비교할 수 있습니다. 메틸화되지 않은 사이토신은 참고 문헌에 존재하지만 중아황산염 분석 및 PCR 후 티민으로 대체된 사이토신입니다. 중아황산염 처리된 DNA를 질량 분석법에 적용함으로써 연구자들은 또한 "메틸화 에피그램"을 만들 수 있습니다. 게놈에서 서로 다른 CpG를 선형으로 나타내고 각각의 메틸화 정도를 나타냅니다. 이러한 에피그램은 연구자들이 서로 다른 세포 유형 간의 메틸화 패턴을 비교하고자 할 때 특히 유용합니다.

이제 중아황산염 분석을 위한 프로토콜에 대해 자세히 살펴보겠습니다.

먼저 수산화나트륨을 게놈 DNA 제제에 첨가한 다음 95°C에서 배양합니다. 이것은 DNA를 변성시키고 그 염기를 후속 화학 반응에 접근할 수 있도록 합니다. 그런 다음 메타중아황산나트륨을 변성된 DNA 혼합물에 도입하고 두 가지 화학 반응 단계가 발생합니다. 첫 번째 단계인 설폰화(sulfonation) 동안에는 메틸화되지 않은 시토신에 아황산염 그룹이 첨가되어 시토신 설포네이트(cytosine sulfonate)를 형성합니다. 그런 다음 하이드로릭 탈아미노화 중에 시토신 설포네이트에서 아미노기를 제거하여 우라실 설포네이트를 생성합니다.

화학 반응의 이러한 첫 번째 단계를 촉진하기 위해 DNA 제제에는 증발을 방지하고 메타중아황산나트륨의 농도를 유지하는 데 도움이 되는 미네랄 오일이 겹쳐져 있습니다. 그런 다음 반응을 55? 어둠 속에서 C. 이 단계에서는 퀴놀과 같은 산화를 방지하는 제제도 혼합물에 첨가됩니다.

미네랄 오일이 없는 우라실 설포네이트를 포함하는 변형된 DNA를 수집하기 위해 혼합물을 원심분리하고 가장 낮은 액체층을 회수합니다. 그런 다음 이 용액의 DNA를 정제합니다.

다음으로, 수산화 나트륨을 DNA 혼합물에 첨가 한 다음 37 °C에서 배양합니다. 이것은 desulfonation을 유도하기 위해 수행되며, 이는 짐작할 수 있듯이 uracil sulfonate에서 아황산염 그룹을 제거하여 uracil을 형성하고 화학 반응을 완료합니다.

마지막으로, 혼합물은 아세트산 암모늄을 첨가하여 중화되고 DNA는 에탄올 침전에 의해 수집됩니다. 중아황산염으로 전환된 DNA가 정제되면 PCR 및 염기서열분석을 거칩니다.

이제 중아황산염 분석의 기본 기술에 대해 논의했으므로 몇 가지 실험 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

일부 연구자들은 중아황산염 분석을 사용하여 게놈 각인을 조사합니다. 여기에서 연구자들은 모계와 부계 DNA를 구별할 수 있도록 유전적 차이가 있는 애기장대(Arabidopsis)의 두 가지 변종을 교배했습니다. 그런 다음 생성된 배아와 관련 배유 또는 배아를 지지하는 조직의 메틸화 패턴을 비교했습니다. 이 방법을 사용하여 과학자들은 단백질 인코딩 유전자인 MEA의 모계 대립유전자에 있는 CpG가 배아에서는 메틸화되는 경향이 있지만 배유에서는 메틸화되지 않는 경향이 있음을 발견하여 조직 특이적 각인을 나타냅니다.

다른 연구자들은 환경적 또는 사회적 요인이 메틸화 패턴을 어떻게 변화시킬 수 있는지 이해하기 위해 이 기술을 사용하고 있습니다. 여기에서 새끼 쥐는 스트레스를 유발하기 위해 어미와 분리되었고, 이후 뇌 조직이 분리되었습니다. 중아황산염 처리된 DNA의 염기서열분석 후, 과학자들은 호르몬 인코딩 유전자인 AVP의 메틸화 패턴이 특정 뇌 영역에서 "분리"된 것으로 변경되었음을 확인했습니다. PUPS, 초기 생활 경험의 장기적인 생물학적 효과에 대한 가능한 분자 메커니즘을 제안합니다.

마지막으로, 많은 연구자들은 개별적이고 고유한 세포 간의 메틸화 패턴을 쉽게 비교할 수 있도록 중아황산염 분석을 최적화하려고 노력하고 있습니다. 여기에서 연구원들은 중아황산염 분석 방법을 수정하여 모든 단계가 아가로스에 내장된 개별 마우스 난모세포에 대해 수행되도록 하여 DNA 손실을 방지하는 데 도움이 되었습니다. 이 방법을 사용하여 연구원들은 여러 메틸화 패턴을 제공하는 세포를 찾아 다른 세포에 오염된 단일 난모세포 샘플을 쉽게 식별할 수 있었습니다.

메틸화 민감성 분석에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 여기에서는 DNA 메틸화가 유전자 조절에 미치는 역할, 연구자들이 게놈의 메틸화 영역을 식별하는 데 사용하는 방법, 중아황산염 분석을 위한 일반화된 프로토콜, 그리고 마지막으로 이 기술의 일부 응용 분야에 대해 논의했습니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!