생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

본 방법론의 전반적인 목표는 세포 반응 연구에 활용할 수 있는 고정된 생물활성 공간 단백질 패턴을 생성하는 것입니다. 이 방법은 생체 재료 전략을 통해 체내(in-vivo) 신호를 재현할 수 있게 합니다. 또한 이 기술은 순차적 성장 인자, 세포 간 신호 전달 및 공간 특이적 생화학적 단서와 같이 표준 배양 방법으로는 구현할 수 없는 특정 신호 모티프를 정밀하게 모방할 수 있게 합니다.

이 프로토콜은 기질 강도 조절과 단백질 패턴 형성을 위한 간편한 방법을 제공한다는 점에서 기존 방법들과 차별화되는 중요성을 가집니다. 이 방법은 조직 공학 및 재생 의학 기술을 더욱 발전시킬 수 있을 뿐만 아니라, 조직 발달 및 줄기 세포 운명과 같은 다른 시스템 연구에도 적용될 수 있습니다. 우선, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 멸균 조건 하에서 주요 하이드로젤 성분인 polyethylene glycol diacrylate, 광개시제인 lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate 및 ECM 단백질인 fibronectin의 스톡 솔루션을 준비하십시오.

개별 분주액을 사용하거나 보관하기 전에 0.22 micron 시린지 필터를 사용하여 각 용액을 여과 멸균하십시오. 그 다음, PEG-DA 용액을 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호하십시오. 광개시제 스톡 용액 또한 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호하고, 준비된 용액을 4 °C에서 최대 수개월 동안 보관하십시오.

피브로넥틴(fibronectin) 스톡 용액이 냉동된 경우, 멸균된 분주액을 얼음 위에서 수 시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 해동하십시오. 먼저 각 겔 몰드당 하나의 폴리에스터 시트를 오토클레이브 처리합니다. 그 다음, 각 겔 몰드당 두 개의 유리 슬라이드와 세 개의 플라스틱 스페이서를 70% 에탄올에 최소 2시간 동안 담가 두십시오.

또한, 각 겔 몰드당 5개의 바인더 클립을 70% ethanol에 10분 동안 담급니다. 유리 슬라이드, 스페이서 및 바인더 클립을 세포 배양 후드 내의 작은 오토클레이브 시트 위에 올려두고 수 시간 동안 자연 건조시킵니다. 다음으로, 유리 슬라이드 가장자리를 따라 0.5 millimeter 두께의 플라스틱 스페이서를 배치하여 하이드로겔 몰드를 준비합니다.

두 번째 슬라이드 글라스를 위에 놓은 다음, 바인더 클립을 사용하여 간격재를 서로 밀착시켜 단단히 고정합니다. 마지막으로, 사용 전 몰드를 후드 안에 넣고 UV 램프를 30분 동안 켜서 표면 멸균을 수행합니다. 멸균 과정 중간에 몰드를 뒤집어 양쪽 표면이 모두 노출되도록 합니다.

동반된 텍스트 프로토콜의 표 1에 기술된 대로 겔 전구체 용액을 조제하십시오. 그런 다음, PEG-DA, 피브로넥틴 및 광개시제 부피를 함께 혼합하여 하이드로겔을 생성합니다. 균질한 용액이 되도록 파이펫으로 강력하게 혼합하되, 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.

겔 전구체 용액을 겔 몰드의 두 유리 슬라이드 사이에 조심스럽게 피펫팅합니다. 그런 다음, 몰드를 UV 램프 아래에 두고 1~2분 동안 노출시켜 하이드로겔을 형성합니다. 겔화가 완료되면 바인더 클립을 제거하고, 양쪽 측면 스페이서에 반대 방향으로 압력을 가해 상단 유리 슬라이드를 부드럽게 제거합니다.

그 다음, 적절한 크기의 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 하이드로겔 샘플을 절단합니다. 반복 실험 및 대조군 샘플로 사용할 수 있도록 겔 직사각형에서 여러 개의 하이드로겔을 펀칭하여 추출합니다. 포토마스크를 70% ethanol에 10분 동안 담가 멸균합니다.

그런 다음, 세포 배양 후드 내에서 포토마스크를 자연 건조시킵니다. 다음으로, 표면 패턴 형성을 위해 절단된 각 하이드로젤 표면에 티올화 단백질 용액을 cm²당 1~2 µL씩 피펫으로 분주합니다. 균일한 단백질 고정화를 보장하기 위해서는 단백질 용액을 하이드로젤 표면에 고르게 도포하는 것이 중요합니다.

포토마스크를 하이드로젤 표면에 조심스럽게 놓습니다. 마스크와 하이드로젤 표면 사이에 형성된 기포를 제거하기 위해 마스크를 살며시 누릅니다. 다음으로, 하이드로젤을 UV 램프 아래에 두고 30~60초 동안 2차 UV 광노출을 수행합니다.

반응하지 않은 물질을 제거하기 위해 하이드로젤을 PBS로 세척하고, 패턴 표면이 위를 향하도록 각 하이드로젤을 웰 플레이트에 배치합니다. 그 다음, 4 °C의 PBS에서 젤을 하룻밤 동안 세척합니다. 웰에서 PBS를 제거한 후, 각 웰에 250 µL의 basal EGM2를 추가하고 37 °C에서 5~10분 동안 젤을 배양합니다.

배양 중, 표준 기술을 사용하여 거의 confluent 상태인 HUVEC 플레이트를 트립신으로 처리해 단일 세포 현탁액으로 만듭니다. 그다음, 세포 현탁액을 원심 분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 세포 펠릿을 성장 인자가 첨가되지 않은 basal EGM2로 재현탁하고, 세포 현탁액의 일부를 헤모사이토미터에 넣습니다.

세포 수를 측정하여 농도를 결정합니다. 다음으로, 하이드로젤이 포함된 플레이트를 300 x G에서 3분 동안 원심분리하여 하이드로젤이 웰 바닥에 위치하고 떠 있지 않도록 합니다. 하이드로젤이 웰 내에서 떠 있지 않게 하는 것이 매우 중요합니다.

부유하는 하이드로겔은 세포 시딩의 성공률을 제한하며 하이드로겔 이미지 촬영 시 문제를 일으킬 수 있습니다. 겔이 흐트러지지 않도록 각 하이드로겔 표면 중앙에 cm²당 75,000 cells를 천천히 피펫팅하십시오. 그 다음, 플레이트를 37 °C의 세포 배양 인큐베이터에 넣으십시오.

며칠 동안 주기적으로 디쉬를 꺼내 단백질 패턴에 반응하는 세포 이동을 관찰합니다. 2~3일마다 배지의 50%를 교체합니다. 하이드로젤을 형성할 때, 원하는 기질 강도를 얻기 위해 다양한 전구체 PEG-diacrylate 농도를 사용할 수 있습니다.

여기서 20% PEG-DA 용액은 100 kPa 이상의 강성과 상관관계가 있음을 보여줍니다. 또한 광개시제 농도와 UV 노출 시간 모두를 고려하는 것이 중요한데, 두 변수 중 어느 하나라도 증가하면 리소좀의 생물학적 활성으로 나타나는 부착 분자의 생물학적 활성이 감소하기 때문입니다. 하이드로겔 형성 중 UV 노출을 최소화하는 것은 이후의 단백질 고정화 반응을 위한 자유 아크릴레이트 작용기를 유지하는 데 매우 중요합니다.

2분 이상 UV 광선에 노출된 하이드로젤은 빨간색으로 표시된 고정 단백질 패턴을 형성할 수 없습니다. 또한, 단백질 패턴에 대한 UV 노출 시간이 증가함에 따라 더 많은 단백질이 표면과 반응합니다. 올바르게 제작되었을 때, 이러한 패턴화된 하이드로젤 기질 위에 세포를 배양하여 세포의 거동을 조절할 수 있습니다.

본 실험에서는 혈관내피세포를 VEGF 패턴 PEG 하이드로젤 표면에 균일하게 파종하였습니다. 파종 2일 후, 혈관내피세포가 고정된 VEGF가 포함된 하이드로젤의 공간적 영역으로 이동하는 것이 관찰되었습니다. 본 프로토콜을 활용하여 연구자들은 임의의 단백질이나 펩타이드를 고정함으로써 인비트로(in-vitro) 세포 시스템을 위한 새로운 생체활성 플랫폼을 탐색할 수 있습니다.

이 실험 절차를 수행할 때, 고정된 분자의 생물학적 활성을 유지하기 위해 광개시제 농도와 UV 노출 시간을 최소화하는 것이 중요함을 기억하십시오. 이 영상을 시청하고 나면, PEG 하이드로젤 위에 생물학적 활성 단백질과 펩타이드를 패턴화하는 방법, 하이드로젤 위에 세포를 균일하게 파종하는 방법, 그리고 그에 따른 세포 반응을 관찰하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.