Name: 생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 배우세요 광중합 및 클릭 화학을 이용해 PEG 하이드로겔에 생리 활성 단백질 패턴을 고정하는 방법을. 이 기술은 세포 반응 연구와 조직 공학에 활용됩니다.

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이 연구는 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금에서 교부 금에 의해 주로 지원 되었다 (G.D. 하 12SDG12050083)는 건강의 국가 학회 (R21HL102773, G.D.에 R01HL118245)와 국립 과학 재단 (CBET 1263455 및 G.D. CBET-1350240).

1. 하이드로 겔 합성에 대 한 자료 준비 PEGDA, 리튬 페 닐-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (무릎), 그리고 fibronectin 무 균 조건 하에서 <ol><li>준비 재고 솔루션 기반 계산 (표 1A).
	<ol><li>밖으로 무게와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 화합물을 디졸브. 일반적으로, PEGDA 솔루션 농도 사이 50 및 200mg/mL (5-20% 무게/볼륨) 작업을 유지 관리 합니다. 살 균을 위한 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 PEGDA 솔루션 플라스틱. 
		참고: PEGDA 솔루션 호 일 빛에서 그들을 보호 하기 위해 배치로 덮여 유지. (권장) 각 실험에 대 한 PEGDA의 신선한 솔루션 준비.</li>
		<li>Reconstitute fibronectin 단백질 분말 제조 업체에 따라 &#39; s 추천. 1 mg/mL, aliquot에서 fibronectin 재고 솔루션을 유지 60 ~ 100 µ L aliquots에 그것을 사용까지-20 ° C에서 그들을 저장 하 고. 몇 시간 동안 4 ° C에서 aliquots를 녹 이십시오 또는 하룻밤 전에 사용. 단백질 주식 살 균 조건에 이미 제공 하지 않으면, 0.22 μ m 주사기 필터를 사용 하 여 살 균에 대 한. 
		참고: Fibronectin 셀 첨부 파일에 사용 됩니다. 다른 ECM 단백질 대용 될 수 있다.</li>
		<li>무릎 밖으로 무게를 재고 솔루션에 대 한 PBS에 녹; 전형적인 재고 농도 25 mg/mL 이다. 용 해와 어떤 문제가 sonicate. 살 균을 위한 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다. 호 일 포장으로 무릎을 커버 하 고 몇 개월까지 4 ° C에서 그것을 유지. 
		참고: 무릎은 photoinitiator는 광화학에 대 한 사용.</li>
	</ol></li> <li>하이드로 겔 형성에 대 한 살 균 유리 슬라이드 금형을 준비.
	<ol><li>오토 클레이 브는 폴리에스터 시트; 각 젤 형을 위해 필요할. 적어도 2 시간에 대 한 70% 에탄올에서 두 개의 유리 슬라이드와 각 젤 형에 대 한 3 명의 플라스틱 스페이서 (두께 0.5 m m)를 적시십시오 하지만 일반적으로 하룻밤 담가 수 있도록. 사용 하기 10 분 전에 대 한 70% 에탄올에 각 젤 형에 대 한 5 개의 바인더 클립을 담근 다.</li>
		<li>장소 유리 슬라이드, 스페이서, 및 작은 압력가 시트에 바인더 클립 있도록 공기 건조 몇 시간 동안 세포 문화 후드에서.</li>
		<li>유리 슬라이드의 가장자리 주위에 플라스틱 스페이서를 배치 하 여 준비 히드로 금형. 두 번째 유리 슬라이드를 위에 놓습니다. 바인더 클립 위에 긴 양쪽에 2 개 나란히 단단히 스페이서 보안. 
		참고: 경우이 제대로 조립 하지는 젤 솔루션 것입니다 밖으로 누출.</li>
		<li>표면 소독 셀 문화 형 후드 사용 하기 30 분 전에 대 한 자외선. 중간을 통해, 플립 두 표면 노출 형.</li>
	</ol></li></ol> 2. 무료 Thiol 단백질 수정 <ol><li>아민 단백질 (표 1A)에 thiol로 변환 하기 위한 스프레드시트에서 계산을 사용 하 여 재고 솔루션 준비.
	<ol>반응 버퍼 수 있도록 <li>pH 8에 PBS를 조정 하 고 5 mM EDTA를 추가. 피 펫 멸 균에 대 한 0.22 μ m 주사기 필터에 반응 버퍼. 
		참고: EDTA은 중요 하다, 그것은 이황화 결합 형성에서 thiols를 보호. Thiol 그룹 반응 발생에 대 한 그들의 감소 된 모양에서 유지 되어야 합니다.</li>
		<li>2 iminothiolane 밖으로 무게 (Traut &#39; s 시 약) 2 mg/mL (14mm)의 재고 솔루션 농도 대 한 반응 버퍼에 그것을 분해 하 고. 살 균을 위한 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다. 몇 개월까지 4 ° C에서 재고 솔루션 저장. 
		참고: 2-iminothiolane는 분자 단백질에 솔벤트 노출 무료 아민과 반응 하 고 무료 thiols로 그들을 변환 합니다.</li>
		<li>Reconstitute 0.1와 1 mg/mL 농도에서 반응 버퍼에 단백질. 하지 않는 한 이전 살 균, 살 균에 대 한 0.22 μ m 주사기 필터를 통해이 솔루션을 플라스틱. 
		참고:이 단백질은 하이드로 겔 표면에 무늬 생 화 확 적인 신호 이다. 또한, 단백질 농도 다를 수 있습니다, 높은 농도 이상적 강한 단백질 패턴.</li>
	</ol></li> <li>2 iminothiolane와 단백질 둘 다 재고 솔루션을 함께 혼합 하 여 반응; 표 1B를 사용 하 여 올바른 볼륨 비율. 일반적으로 단백질을 8:1 2 iminothiolane의 어 금 니 비율을 사용 하 여. 
	참고: 큰 단백질 이상 농도 희석, 2-iminothiolane의 높은 어 금 니 비율을 사용 합니다. 제조 업체를 참조 &#39; s 프로토콜 15.</li>
	<li>품 실 온에서 1 h에 대 한 반응. 제조 업체에 따라 나머지 반응에서 thiolated 단백질 제품을 제거 하려면 염 스핀 마이크로-열을 사용 하 여 &#39; s 프로토콜 16. 
	참고:이 수 지의 배제 한계는 5 KDa.</li>
	<li>사용 덮어 &#39; 단백질 당 무료 thiols의 수 양적 측정 분석 결과 s. 제조 업체에 따라 &#39; s 프로토콜 분석 결과 17.</li>
</ol> 3. 하이드로 겔 형성 <ol><li>만들기 젤 전조 솔루션 값에 따라 표 1 c에서 계산. 믹스 함께 PEGDA, fibronectin, 및 무릎 볼륨. 균질 성 해결책을 보장 하지만 거품을 만들지를 적극적으로 솔루션 플라스틱 솔루션은 빛 으로부터 보호 유지.</li>
	<li>플라스틱 젤 전조 솔루션 젤 형의 두 유리 슬라이드 사이 신중 하 게. 일반적으로, 금형에 800 그리고 1000 µ L 사이 볼륨을 추가 합니다. 노출 형 UV 빛을에 젤 솔루션 (파장: 365 nm, 전원: 3-4 mW/cm 2) 1-2 분은 하이드로 겔 형성. 
	참고: 그것은 기능을 패턴화 표면 단백질 제한으로 장기간된 자외선에 하이드로 겔을 노출 하지 마십시오.</li>
	<li>바인더 클립 제거 하 고 부드럽게 두 측면 스페이서에 압력 반대 위치에 적용 하 여 최고의 유리 슬라이드를 제거.</li>
	<li>적절 한 크기의 생 검 펀치를 사용 하 여 하이드로 겔 샘플을 잘라. 복제 역할 및 샘플 제어 젤 사각형에서 여러 hydrogels 퇴근.</li>
</ol> 4. 하이드로 겔 강성 측정 8mm 병렬 플레이트 고분자에 대 한 <ol><li>펀치 hydrogels는 8 개 m m 직경 생 검 펀치. 고분자에 한 하이드로 겔 샘플을 로드 (재료의 표 참조).</li>
	<li>낮은 병렬 플레이트 형상 만들기까지 직경에서 8 m m 즉 젤의 표면 접촉. 0.5 m m 두꺼운 하이드로 겔 샘플 0.5 m m의 간격 거리를 유지.</li>
	<li>0.1% 변형, 0.1 Hz 주파수, 및 37에 5 분에 대 한 수행 시간 스윕 ° C. 평균 G &#39; 각 시간 청소 값. 각 구성의 복제에 대 한 독립적인 hydrogels 실행. 
	참고: G &#39; 값 한다 안정적일 시간 포인트; 그들은, % 변형 및 주파수 스윕 적절 한 선택 하려면 수행 해야 하는 경우 값 14.</li>
</ol> 5. 단백질 패턴 <ol><li>준비 컴퓨터 원조 설계 (CAD) 프로그램을 사용 하 여 포토 마스크에 대 한 원하는 패턴. 고해상도 프린터를 사용 하 여 투명 시트에는 포토 마스크를 인쇄 합니다. 사용 하기 10 분 전에 대 한 70% 에탄올에는 포토 마스크를 담근 다. 사용 하기 전에 셀 문화 후드에 건조 공기를 포토 마스크 허용.</li>
	<li>표면 패턴화 된 하이드로 겔의 표면에 2 단계에서 준비 하는 thiolated 단백질 해결책을 추가 합니다. 플라스틱 thiolated 각 컷 아웃 젤의 표면에 단백질 해결책의 1-2 µ L/c m 2. 
	참고: 그것은 단백질 볼륨;을 최소화 하는 것이 중요 균등 하 게 하이드로 겔 샘플의 전체 표면을 커버 하기에 충분 한 추가.</li>
	<li>신중 하 게는 히드로의 표면에는 포토 마스크를 놓습니다. 포토 마스크 및 하이드로 겔 표면 사이 공기 방울을 허용 하지 않습니다. 부드럽게 눌러 모든 거품을 제거 하는 마스크에 그 형태.</li>
	<li>노출 UV 빛의 두 번째 라운드에 하이드로 겔 (파장: 365 nm, 전원: 3-4 mW/cm 2) 30-60 미에 대 한 
	참고: 패턴을 만들는 강력한 단백질 기능의 상실을 유발 하지 않고 충분 한 UV 빛에 노출 패턴에 중요 하다.</li>
	<li>Hydrogels 제거 하 unreacted 종 고 잘 배지 내의 각 히드로 PBS로 세척. 각 잘;에 젤을 배치할 때 조심 패턴화 된 표면 위로 얼굴 인지 다는 것을 확인 하십시오. 4 ° C에서 PBS에는 젤을 씻어 젤은 4에 적어도 2 주 동안 안정적인 ° c.</li>
</ol> 6. 셀 시드 Hydrogels 준비 <ol><li>뿌리기 전에 37 ° C에서 5-10 분에 대 한 기저 매체에 젤을 품 어. 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs), 성장 인자 없이 EGM 2 매체 사용 하 여. 각 추가 매체의 볼륨을 최소화 히드로 부동 방지 하기 위해 잘. 48-잘 접시 사용 매체의 250 µ L 볼륨.</li>
	<li>스핀 300 x에 접시 내려 g는 hydrogels 우물의 하단에 위치 하 고 부유 하지 3 분. 셀 뿌리기 직전 이렇게.</li>
</ol> 7. Hydrogels에 시드 셀 셀 시드를 위한 <ol><li>사용 표준 살 균 포유류 세포 문화 절차 및 실험 절차. 표준 세포 분리 프로토콜을 사용 하 여 조직 배양 플라스 크에서 HUVECs를 제거 합니다. 살 균 PBS 가진 조직 문화 접시를 세척 하 고 37에서 3-5 분에 대 한 트립 신으로 품 어 ° c.</li>
	<li>초과 셀 매체 또는 트립 신 중 화제 솔루션 trypsinized 세포 현 탁 액을 끄다.</li>
	<li>5 분 신중 하 게는 상쾌한을 제거 하 고 계속 셀 펠 릿 세포 현 탁 액 300 x g에서 원심 분리기에 아래로 회전.</li>
	<li>없는 성장 요인으로 기저 EGM-2에서 셀 펠 릿을 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀 카운팅을 위한.</li>
	<li>추가 75000 셀/cm 2 각 하이드로 겔을 천천히 잘을 방해는 젤 각 센터에 pipetting으로 표면. 위치에서 37 ° c. 셀 문화 인큐베이터에 잘 플레이트 대 한 일, 주기적으로 관찰을 위한 접시 제거.</li>
</ol> 8. Bioactivity의 평가 <ol><li>하룻밤에 37 ° C와 200 rpm에서 궤도 정지에서 파운드 국물에서 문화 E. 콜라이. 대장균 문화 아래로 회전 시키십시오, 가만히 따르다, 그리고 PBS의 최소 볼륨에서 셀 펠 릿을 다시 구성 하기. lysozyme 밖으로 무게 및 재고 솔루션 1 mg/mL에서 reconstitute.</li>
	<li>는 Microcentrifuge 튜브 lysozyme 재고 솔루션의 작은 양 (25 µ L) 플라스틱. 무릎 photoinitiator (0-12 m m)의 다양 한 레벨을 추가 하 고 UV 빛의 1 분 샘플을 노출. 별도 그룹에서 lysozyme 솔루션 랩 (2 mM)의 동일한 금액을 추가 하 고 다양 한 UV 빛 시간 샘플을 노출 (0-4 분). 각 치료에 대 한 복제를 포함.</li>
	<li>추가 동등한 양의 집중된 대장균 0.5 mg/mL의 최종 lysozyme 단백질 농도 대 한 각 lysozyme 샘플 솔루션. 실 온에서 4 h 혼합된 솔루션을 품 어. 
	참고:이 시간 기능 lysozyme lyse 세균성 세포 벽 및 솔루션으로 단백질을 풀어 수 있습니다.</li>
	<li>치료 lysozyme 긍정적인 통제에 대 한 대장균과 인 큐베이 팅을 사용 하 여이 100% 생리 활성 측정을 고려. PBS 부정적인 제어로 혼자와 incubated lysozyme 솔루션을 사용 하 여.</li>
	<li>세포 파편을 제거 하 고 상쾌한을 유지 샘플 아래로 회전 합니다. 척도 lysate 박테리아의 양을 측정 하는 상쾌한 내 단백질의 총 농도를 Bradford 분석 실험을 실행.</li>
	<li>실행 제조 업체에 따라 Bradford 분석 실험 &#39; s 프로토콜 18. 배 부정적인 제어에 비해 단백질 농도 변경 계산.</li>
</ol>

<ol><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-effects+of+matrix+low+elasticity+and+aligned+topography+on+stem+cell+neurogenic+differentiation+and+rapid+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth.</a> Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).</li>
<li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cells+Mater%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).</li>
<li>Ye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Stiffness+and+Nanoscale+Spatial+Organization+of+Cell-Adhesive+Ligands+Direct+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate.</a> Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li>
<li>Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+tethered+TGF-beta1+with+encapsulated+chondrocytes+in+a+PEG+hydrogel+system+enhances+extracellular+matrix+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production.</a> J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).</li>
<li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decorin+moieties+tethered+into+PEG+networks+induce+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).</li>
<li>Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gradients+of+chemotropic+factors+from+immobilized+patterns+to+guide+axonal+growth+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration.</a> Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).</li>
<li>Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+controlled+simultaneous+patterning+of+multiple+growth+factors+in+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).</li>
<li>Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+hydrogels+with+immobilized+ephrinA1+for+therapeutic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).</li>
<li>McCall, J. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+photopolymerizations+provide+a+facile+method+to+encapsulate+proteins+and+maintain+their+bioactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity.</a> Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).</li>
<li>Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rheological+characterization+of+hydrogels+for+tissue+engineering+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).</li>
<li>Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf</a> (2017).</li>
<li>Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf</a> (2017).</li>
<li>Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf">https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf</a> (2017).</li>
<li>Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf</a> (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에는 생물 학적 응용에 대 한 생리 활성 단백질 패턴을 만들기 위한 방법을 제공 한다. 다른 실험을 위해이 프로토콜에 맞게 만들 수 있는 몇 가지 수정이 있다. 첫째, 셀 첨부 파일 요구 사항을 다른 세포 유형에 대 한 달라질 수 있습니다. 가난한 셀 첨부 파일은 젤을 처음 관찰 된 경우 솔루션 내에 전조 ECM 단백질의 농도 증가 시키는 것이 좋습니다. 다른 ECM 단백질 fibronectin, 콜라겐, laminin, 또는 조합을의 다른 종류를 포함 하 여 대신 사용할 수 있습니다. 각 유형에 새로운 셀, 셀 첨부 히드로 패턴화 이전 최적화 되어야 합니다. 이 프로토콜은 또한 사용자 설계 포토에 대 한 수 있습니다. 원하는 응용 프로그램에 따라, 포토 생산할 수와 함께 다양 한 크기, 모양, 및 전반적인 패턴 기능. 균일 한 동원 정지는 포토 마스크의 부재에서 얻을 수 있습니다.
이 프로토콜에는 특정 제한이 있습니다. 대표 결과에 강조...

셀 동작에 영향을 주는 많은 자극을 확인 하 고 있습니다. 일반적으로, 일반적인 셀 자란 기법; 세포질 응답 유도 용 해 요소에 의존 그러나,이 접근 방식에는 한계가 있다. 이러한 메서드는 일반적으로 모든 신호 모티브를 정확 하 게 표시 수 없습니다 vivo에서. 이러한 신호 메커니즘 등 분리 된 성장 인자, 세포-세포 신호, 공간 특정 생 화 확 적인 신호입니다. 또한, 기판 강성 셀 동작 및 줄기 세포 분화에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 하 고 일반적인 셀 자란 사례1,2를 사용 하 여 쉽게 조작 하지는. 소재 접근 이러한 신호 메커니즘을 탐험을 시작 하는 새로운 플랫폼을 제공 합니다. 특히, hydrogels 기판 강성3,4, immobilizing 단백질 및 펩 티 드5,6, 튜닝 하 고 공간적으로 특정 패턴7, 을 만들기 위한 우수한 후보자는 8.
Hydrogels 건설 기계 조직 공학 세포 외 기질 (ECM)9,10그들의 생물 및 생 화 확 적인 공통점 때문에 일반적으로 사용 됩니다. 천연 고분자 생체 고 신체의 많은 조직에서 발견 되는 건설 기계에 대 한 일반적인 선택입니다. 천연 고분자를 사용 하 여 기판으로의 한계는 그들은 bioconjugation에 대 한 쉽게 조작된 화학 moieties 부족 이다. 다른 한편으로, 합성 hydrogels 같은 말뚝,으로 우수한 플랫폼 대상된 화학11,12. 또한, 말뚝 hydrogels 세포질 응답을 유도 하지 않습니다 하 고 따라서 생리 건설 기계를 만들기 위한 불활성 등뼈로 사용 됩니다.
만들려면 생리 hydrogels, photopolymerization 그리고 thiol ene 클릭 화학 반응 고용 됩니다. 이 photoreactions는 photoinitiator와 UV 광원을 필요로합니다. Photoinitiators는 UV 빛을 소개 하 고, 채권 양식 기를 휴식. 논문 래 디 칼 개시 반응에 필요 하지만 단백질 bioactivity12,13에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, photoinitiator 및 단백질 bioactivity를 유지 하기 위해 자외선 노출 시간을 최적화 하기 위해 결정적 이다.
이 방법에서는, hydrogels 아크릴-아크릴 체인 성장 photopolymerization 통해 합성 됩니다. 못-빛 (PEGDA) 단위체 분기 폴리머 네트워크는 하이드로 겔의 구조에 대 한 책임을 형성 하기 위하여 서로 함께 반응. 솔루션 내에 젤 선구자 PEGDA 단위체의 농도 기판 강성을 제어 합니다. 때문에 작은 크기는 하이드로 겔의 기 공, fibronectin 같은 ECM 단백질 셀 첨부 파일을 위해 하이드로 겔 내에서 쉽게 통합 될 수 있다. 마지막으로, 이러한 hydrogels 생리 활성 펩 티 드 표면 패턴 또는 단백질 thiol ene 통해 클릭 화학 반응. 여기, 하이드로 겔 시스템 내에서 unreacted 무료 아크릴레이트 단백질 또는 펩 티 드 UV 빛에 노출 되 면에 있는 무료 thiols와 반응 합니다. 단백질 또는 펩 티 드 히드로 표면에 움직일 수 있다, 후는 히드로 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 동안 bioactivity의 손실 없이. 이 편의성, 유연한 실험 계획 및 연구소 간의 협력에 대 한 가능성을 제공 합니다. 전반적으로,이 플랫폼 biomechanical 및 공간 생 화 확 적인 제어, 서로 독립적으로, 세포질 행동에 영향을 기회에 대 한 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>PEG-diacrylate (PEGDA)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-3400</td><td>합성하거나 다른 벤더를 통해 구매할 수도 있습니다. 다른 분자량을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>리튬 페닐 -2,4,6- 트리메틸 벤조일 포스피 네이트 (LAP)</td><td></td><td></td><td>실험실에서 합성</td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>코닝</td><td>356008</td> 라미닌, 마트리겔 인산염 완충 식염수 (PBS) 시그마 D8537-500ML <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포토 마스크</td><td>파인 라인 이미징</td><td>n / a</td><td>고해상도 DPI의 투명 시트에 맞춤 인쇄</td></tr>와 같은 다른 세포 부착 단백질을 사용할 수 있습니다.<tr><td>바인더 클립</td><td>다양한 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소형 UV 광원 (365nm)</td> <td>UVP</td><td>UVP-21</td><td>다른 UV 광원을 사용할 수 있으며 전력 보정이 필요합니다.</td></tr><tr><td>2-이미노티올란(피어스 트라우트) s 시약)</td><td>Thermo Sci.</td><td>26101</td><td></td></tr><tr><td>엘먼 s 시약: DTNB; 5,5-디티오-비스(2-니트로벤조산)</td><td>Thermo Sci.</td><td>22582</td><td></td></tr><tr><td>인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td></td><td>통로 번호 6-10</td></tr><tr><td>EGM-2 Media</td><td>Lonza</td><td>CC31-56, CC-3162</td><td>EGM-2 성장 인자가없는 실험을 사용하였다. 세포 유지를 위해 전체 EGM-2 매체를 사용했습니다:</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin EDTA</td><td>Life Tech</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizer,</td><td>Life Tech</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>, Various Venders</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser, Sci. Bright-line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>0.22&마이크로; m 필터</td><td>셀 트리트</td>먼트 <td>229743</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Sci.</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 스페이서</td><td>다양한 벤더</td><td></td><td>0.5mm 두께</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>BICCA</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>바이오-쉴</td>드 <td>바이오-쉴</td>드 <td>19-150-0010</td><td></td></tr><tr><td>브래드포드 시약&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>탈염 수지 - Sephadex G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>95016-754</td><td></td></tr><tr><td>Microspin Columns</td><td>Thermo Sci.</td><td></td><td></td>PI69725</tr><tr><td>AR-G2 rehometer</td><td>TA 기기</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

많은 생물학 자극 셀 동작 및 줄기 세포 분화에 영향을 미칠 수 있다. 일반 셀 문화 접근 제어 셀 동작에 매체 내의 수용 성 요소에 의존합니다. 그러나, 녹는 추가 특정 매트릭스 바인딩된 성장 인자와 같은 모티프, 신호, 셀 셀 신호, 및 일반적인 영향 세포에는 공간 생 화 확 적인 신호를 모방 수 없습니다. 또한, 기판 강성 같은 매트릭스의 생물 속성 하지 쉽게 조작 되 기존의 셀 경작 관행을 사용 하 여 셀 운명에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이 방법에서는, 우리는 합성 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels 광화학을 사용 하 여에 꽃무늬 생리 활성 단백질을 제공 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 플랫폼 기판 강성 및 공간 생 화 확 적인 신호는 독립적으로 제어할 수 있습니다. 이러한 hydrogels 순수 관련 강성 값의 큰 범위를 얻을 수 있습니다. 또한, 이러한 hydrogels 표면 생리 활성 펩 티 드와 photopatterned 또는 단백질 thiol ene 통해 클릭 화학 반응. 이러한 메서드는 표면 동원 정지 후 단백질 기능을 유지 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 어떤 단백질 또는 펩 티 드의 다양 한 패턴을 만들에 적용할 수 있는 다양 한 프로토콜입니다. 마지막으로, 이러한 생리 hydrogels의 표면에 시드 셀 그들은 공간 특정 신호에 응답 시간이 지남에 모니터링할 수 있습니다.

못 hydrogels의 표면에 생리 패턴을 만들 수 프로토콜은 그림 1에 나와 있습니다. 스프레드시트 볼륨 및 각 재고 솔루션 (테이블 1A)에 대 한 농도 계산 하기 위해 개발 되었다. 단백질은 하이드로 겔의 표면에 움직일 수는 2-iminothiolane (그림 1B)로 수정 됩니다. 이 반응은 표 1B에서 볼륨을 사용 하 여 수행 됩니다. 선구자 히드로 솔루션 10% 무게/볼륨 랩 (그림 1A)와 PEGDA의 준비가 되어 있습니다. 다양 한 전조 PEGDA 농도 원하는 기판 강성 (그림 2A)를 사용할 수...

이 방법에서는, 우리 photopolymerization를 사용 하 고 제공 하는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels의 표면에 단백질 또는 펩 티 드 패턴을 만들 수 클릭 화학 기법 움직일 생리 신호 vitro에 세포질 응답의 연구에 대 한 .

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

본 방법론의 전반적인 목표는 세포 반응 연구에 활용할 수 있는 고정된 생물활성 공간 단백질 패턴을 생성하는 것입니다. 이 방법은 생체 재료 전략을 통해 체내(in-vivo) 신호를 재현할 수 있게 합니다. 또한 이 기술은 순차적 성장 인자, 세포 간 신호 전달 및 공간 특이적 생화학적 단서와 같이 표준 배양 방법으로는 구현할 수 없는 특정 신호 모티프를 정밀하게 모방할 수 있게 합니다.이 프로토콜은 기질 강도 조절과 단백질 패턴 형성을 위한 간편한 방법을 제공한다는 점에서 기존 방법들과 차별화되는 중요성을 가집니다. 이 방법은 조직 공학 및 재생 의학 기술을 더욱 발전시킬 수 있을 뿐만 아니라, 조직 발달 및 줄기 세포 운명과 같은 다른 시스템 연구에도 적용될 수 있습니다. 우선, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 멸균 조건 하에서 주요 하이드로젤 성분인 polyethylene glycol diacrylate, 광개시제인 lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate 및 ECM 단백질인 fibronectin의 스톡 솔루션을 준비하십시오.개별 분주액을 사용하거나 보관하기 전에 0.22 micron 시린지 필터를 사용하여 각 용액을 여과 멸균하십시오. 그 다음, PEG-DA 용액을 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호하십시오. 광개시제 스톡 용액 또한 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호하고, 준비된 용액을 4 °C에서 최대 수개월 동안 보관하십시오.피브로넥틴(fibronectin) 스톡 용액이 냉동된 경우, 멸균된 분주액을 얼음 위에서 수 시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 해동하십시오. 먼저 각 겔 몰드당 하나의 폴리에스터 시트를 오토클레이브 처리합니다. 그 다음, 각 겔 몰드당 두 개의 유리 슬라이드와 세 개의 플라스틱 스페이서를 70% 에탄올에 최소 2시간 동안 담가 두십시오.또한, 각 겔 몰드당 5개의 바인더 클립을 70% ethanol에 10분 동안 담급니다. 유리 슬라이드, 스페이서 및 바인더 클립을 세포 배양 후드 내의 작은 오토클레이브 시트 위에 올려두고 수 시간 동안 자연 건조시킵니다. 다음으로, 유리 슬라이드 가장자리를 따라 0.5 millimeter 두께의 플라스틱 스페이서를 배치하여 하이드로겔 몰드를 준비합니다.두 번째 슬라이드 글라스를 위에 놓은 다음, 바인더 클립을 사용하여 간격재를 서로 밀착시켜 단단히 고정합니다. 마지막으로, 사용 전 몰드를 후드 안에 넣고 UV 램프를 30분 동안 켜서 표면 멸균을 수행합니다. 멸균 과정 중간에 몰드를 뒤집어 양쪽 표면이 모두 노출되도록 합니다.동반된 텍스트 프로토콜의 표 1에 기술된 대로 겔 전구체 용액을 조제하십시오. 그런 다음, PEG-DA, 피브로넥틴 및 광개시제 부피를 함께 혼합하여 하이드로겔을 생성합니다. 균질한 용액이 되도록 파이펫으로 강력하게 혼합하되, 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.겔 전구체 용액을 겔 몰드의 두 유리 슬라이드 사이에 조심스럽게 피펫팅합니다. 그런 다음, 몰드를 UV 램프 아래에 두고 1~2분 동안 노출시켜 하이드로겔을 형성합니다. 겔화가 완료되면 바인더 클립을 제거하고, 양쪽 측면 스페이서에 반대 방향으로 압력을 가해 상단 유리 슬라이드를 부드럽게 제거합니다.그 다음, 적절한 크기의 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 하이드로겔 샘플을 절단합니다. 반복 실험 및 대조군 샘플로 사용할 수 있도록 겔 직사각형에서 여러 개의 하이드로겔을 펀칭하여 추출합니다. 포토마스크를 70% ethanol에 10분 동안 담가 멸균합니다.그런 다음, 세포 배양 후드 내에서 포토마스크를 자연 건조시킵니다. 다음으로, 표면 패턴 형성을 위해 절단된 각 하이드로젤 표면에 티올화 단백질 용액을 cm²당 1~2 µL씩 피펫으로 분주합니다. 균일한 단백질 고정화를 보장하기 위해서는 단백질 용액을 하이드로젤 표면에 고르게 도포하는 것이 중요합니다.포토마스크를 하이드로젤 표면에 조심스럽게 놓습니다. 마스크와 하이드로젤 표면 사이에 형성된 기포를 제거하기 위해 마스크를 살며시 누릅니다. 다음으로, 하이드로젤을 UV 램프 아래에 두고 30~60초 동안 2차 UV 광노출을 수행합니다.반응하지 않은 물질을 제거하기 위해 하이드로젤을 PBS로 세척하고, 패턴 표면이 위를 향하도록 각 하이드로젤을 웰 플레이트에 배치합니다. 그 다음, 4 °C의 PBS에서 젤을 하룻밤 동안 세척합니다. 웰에서 PBS를 제거한 후, 각 웰에 250 µL의 basal EGM2를 추가하고 37 °C에서 5~10분 동안 젤을 배양합니다.배양 중, 표준 기술을 사용하여 거의 confluent 상태인 HUVEC 플레이트를 트립신으로 처리해 단일 세포 현탁액으로 만듭니다. 그다음, 세포 현탁액을 원심 분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 세포 펠릿을 성장 인자가 첨가되지 않은 basal EGM2로 재현탁하고, 세포 현탁액의 일부를 헤모사이토미터에 넣습니다.세포 수를 측정하여 농도를 결정합니다. 다음으로, 하이드로젤이 포함된 플레이트를 300 x G에서 3분 동안 원심분리하여 하이드로젤이 웰 바닥에 위치하고 떠 있지 않도록 합니다. 하이드로젤이 웰 내에서 떠 있지 않게 하는 것이 매우 중요합니다.부유하는 하이드로겔은 세포 시딩의 성공률을 제한하며 하이드로겔 이미지 촬영 시 문제를 일으킬 수 있습니다. 겔이 흐트러지지 않도록 각 하이드로겔 표면 중앙에 cm²당 75,000 cells를 천천히 피펫팅하십시오. 그 다음, 플레이트를 37 °C의 세포 배양 인큐베이터에 넣으십시오.며칠 동안 주기적으로 디쉬를 꺼내 단백질 패턴에 반응하는 세포 이동을 관찰합니다. 2~3일마다 배지의 50%를 교체합니다. 하이드로젤을 형성할 때, 원하는 기질 강도를 얻기 위해 다양한 전구체 PEG-diacrylate 농도를 사용할 수 있습니다.여기서 20% PEG-DA 용액은 100 kPa 이상의 강성과 상관관계가 있음을 보여줍니다. 또한 광개시제 농도와 UV 노출 시간 모두를 고려하는 것이 중요한데, 두 변수 중 어느 하나라도 증가하면 리소좀의 생물학적 활성으로 나타나는 부착 분자의 생물학적 활성이 감소하기 때문입니다. 하이드로겔 형성 중 UV 노출을 최소화하는 것은 이후의 단백질 고정화 반응을 위한 자유 아크릴레이트 작용기를 유지하는 데 매우 중요합니다.2분 이상 UV 광선에 노출된 하이드로젤은 빨간색으로 표시된 고정 단백질 패턴을 형성할 수 없습니다. 또한, 단백질 패턴에 대한 UV 노출 시간이 증가함에 따라 더 많은 단백질이 표면과 반응합니다. 올바르게 제작되었을 때, 이러한 패턴화된 하이드로젤 기질 위에 세포를 배양하여 세포의 거동을 조절할 수 있습니다.본 실험에서는 혈관내피세포를 VEGF 패턴 PEG 하이드로젤 표면에 균일하게 파종하였습니다. 파종 2일 후, 혈관내피세포가 고정된 VEGF가 포함된 하이드로젤의 공간적 영역으로 이동하는 것이 관찰되었습니다. 본 프로토콜을 활용하여 연구자들은 임의의 단백질이나 펩타이드를 고정함으로써 인비트로(in-vitro) 세포 시스템을 위한 새로운 생체활성 플랫폼을 탐색할 수 있습니다.이 실험 절차를 수행할 때, 고정된 분자의 생물학적 활성을 유지하기 위해 광개시제 농도와 UV 노출 시간을 최소화하는 것이 중요함을 기억하십시오. 이 영상을 시청하고 나면, PEG 하이드로젤 위에 생물학적 활성 단백질과 펩타이드를 패턴화하는 방법, 하이드로젤 위에 세포를 균일하게 파종하는 방법, 그리고 그에 따른 세포 반응을 관찰하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜에서는, 우리는 기술의 기반이되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 방법 및이 기본 기술이 모두 2 차원 입체 문화에 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하도록 수정할 수 있습니다을 증명 패러다임.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

이 비디오는 연쇄 중합 및 하이드로 겔의 합성을 가능하게, 폴리 (에틸렌 글리콜) 메타 크릴 레이트 신속하고 효율적인 방법을 도시한다. 그것은 유사하게 작용의 효율성을 평가하는 문제 해결 및 고급 수정에 대한 제안을 제공하고, 일반 하이드로 겔의 특성 기술을 설명하는 펩티드, 세부 일반적인 분석 방법으로 메타 크릴의 기능을 소개하는 방법을 보여줍니다.

전자 레인지를 이용한 폴리의 기능화 (에틸렌 글리콜) 및 체인 중합 및 하이드로 겔 형성에있는 사용을위한 온 수지 펩티드

우리는 최소한의 비용 또는 전문 지식을 갖춘 ECM 단백질의 직접적인 결합을 허용 히드 록시 PAAm라는 새로운 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 제시한다. 마이크로 콘택트 프린팅 휴대 mechanostransduction을 연구 천연 세포 미세 환경의 많은 큐들의 독립적 제어를 용이하게하여 히드 록시 PAAm의 조합은 하이드로 겔.

mechanotransduction의 큐의 영향 디커플링에 대한 히드 록시 PAAm 히드로 겔의 제조

우리는 수성 환경에서 골격 표면의 세포 친화도를 수정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 이산화 티타늄 광촉매를 이용하여 광조사된 영역에서 유기 필름을 분해합니다. 우리는 그것이 현장 및 현장 모두에서 스캐폴딩 단백질의 미세 도메인을 생성하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

산화 티타늄을 사용하여 수성 환경에서 단백질과 세포를 포토 패터닝<sub&gt; 2</sub&gt; 광촉매

세포 및 약물 전달을 위한 장치로서 RGD 기능성 하이드로겔을 합성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차에는 알킨 변성 폴리아크릴산(PAA)과 RGD-아지드 유도체 사이의 구리 촉매 알카인-아지드 고리첨가(CuAAC)가 포함됩니다. 하이드로겔은 마이크로파 보조 중축합을 사용하여 형성되며 물리화학적 특성이 조사됩니다.

치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

우리는 3차원 세포 배양 응용을 위한 합성 하이드로겔 매트릭스의 광 매개 형성 및 후속 생화학적 패터닝을 위한 순차적 프로세스를 설명합니다. 세포 적합성 photoclick chemistry를 가진 하이드로겔의 구성 및 변형이 입증되었습니다. 또한 패턴을 정량화 및 관찰하고 이러한 하이드로겔 내에서 세포 생존력을 결정할 수 있는 손쉬운 기술이 제시됩니다.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

우리의 전반적인 목표는 세포가 지시된 축색 성장으로 이끌어 내는 세포외 단서를 어떻게 감지하는지 이해하는 것입니다. 여기에서는 축세포 자성장 및 경로 찾기를 제어하는 특정 이벤트를 연구하기 위해 세포 외 매트릭스 구성 요소의 정의된 마이크로 패턴을 생성하는 데 사용되는 단백질의 빛 유발 분자 흡착의 방법론을 설명합니다.

세포외 매트릭스 단백질에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 마이크로 패터닝을 위한 PRIMO 시스템을 사용하여 단백질의 빛 유발 분자 흡착

이 프로토콜은 생물 공학 적 배경이 제한된 사람들이 간단하고 접근 할 수있는 리소 그래피프리 마이크로 패터닝 방법을 소개합니다. 이 방법은 세포 형태를 변조하기 위한 관심있는 모양의 마이크로 패턴 세포 외 매트릭스 단백질에 맞춤형 레이저 컷 스텐실을 활용합니다. 미세 패터킹에 대한 절차는 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 입증된다.

레이저 컷 스텐실을 사용한 간단한 리소그래피 없는 단일 셀 마이크로패터닝

거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

이 프로토콜은 환경 조건을 사용하여 펩타이드가 하이드로겔로 자가 조립되도록 하는 세 가지 빠르고 간단한 준비 방법을 제시합니다. 또한 펩타이드 하이드로겔의 특성 분석이 설명되어 이러한 간단한 조건에서 기계적으로 안정적인 펩타이드 하이드로겔을 형성할 수 있음을 보여줍니다.

기계적으로 안정적인 자체 조립 펩타이드 하이드로겔의 제조

배우세요 광중합 및 클릭 화학을 이용해 PEG 하이드로겔에 생리 활성 단백질 패턴을 고정하는 방법을. 이 기술은 세포 반응 연구와 조직 공학에 활용됩니다.

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

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