생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

이 방법론의 전반적인 목표는 세포 반응을 연구하는 데 사용되는 고정화된 생체 활성 공간 단백질 패턴을 만드는 것입니다. 이 방법을 사용하면 생체 재료 전략을 사용하여 생체 내 신호를 다시 요약할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 순차적 성장 인자, 세포 세포 신호 전달 및 공간별 생화학적 단서와 같은 표준 배양 방법을 사용하여 달성할 수 없는 특정 신호 전달 동기를 정확하게 모방할 수 있습니다.

이 프로토콜은 기질 강성과 단백질 패터닝을 조정하기 위한 간단한 방법을 제공하기 때문에 기존 방법에 중요합니다. 이 방법은 조직 공학 및 재생 의학 기술을 발전시킬 수 있지만 조직 발달 및 줄기 세포 운명과 같은 다른 시스템을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 먼저 주요 하이드로겔 성분인 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 광 개시제, 리튬 페닐-2, 4, 6-트리메틸벤조일포스피네이트 및 ECM 단백질인 피브로넥틴에 대한 원액을 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 멸균 조건에서 준비합니다.

필터는 개별 부분 표본을 사용하거나 보관하기 전에 0.22 미크론 주사기 필터를 사용하여 각 용액을 멸균합니다. 그런 다음 PEG-DA 용액을 호일로 싸서 빛으로부터 보호합니다. 광개시제 원액을 호일로 싸서 빛으로부터 보호하고 준비된 용액을 최대 몇 달 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오.

피브로넥틴 원액이 얼었다면, 멸균 부분 표본을 얼음 위에서 몇 시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 해동합니다. 각 젤 몰드에 대해 하나의 폴리에스터 시트를 고압증기멸균하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 각 젤 몰드에 대해 3개의 플라스틱 스페이서에 2개의 유리 슬라이드를 70% 에탄올에 최소 2시간 동안 담그십시오.

또한 각 젤 몰드에 대한 5개의 바인더 클립을 70% 에탄올에 10분 동안 담그십시오. 유리 슬라이드, 스페이서 및 바인더 클립을 세포 배양 후드의 작은 오토클레이브 시트에 놓고 몇 시간 동안 자연 건조할 수 있도록 합니다. 다음으로, 유리 슬라이드의 가장자리에 0.5mm 두께의 플라스틱 스페이서를 배치하여 하이드로겔 몰드를 준비합니다.

두 번째 유리 슬라이드를 위에 놓고 바인더 클립으로 스페이서를 나란히 단단히 고정합니다. 마지막으로 금형을 후드에 넣고 사용하기 전에 30분 동안 자외선을 켜서 금형을 표면 살균합니다. 살균 과정의 중간에 고소할 금형을 뒤집어 양쪽 표면을 모두 노출시킵니다.

겔 전구체 용액(gel precursor solution)을 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 표 1에 설명된 대로 생성합니다. 그런 다음 PEG-DA, 피브로넥틴 및 광 개시제 부피를 함께 혼합하여 하이드로겔을 생성합니다. 균질한 용액을 보장하기 위해 용액을 세게 피펫팅하되 기포가 생성되지 않도록 합니다.

젤 몰드의 두 유리 슬라이드 사이에 젤 전구체 용액을 조심스럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 곰팡이를 자외선 아래에 놓고 1-2분 동안 노출시켜 하이드로겔을 형성합니다. 젤이 겔화되면 바인더 클립을 제거하고 두 개의 측면 스페이서에 반대 압력을 가하여 상단 유리 슬라이드를 부드럽게 제거합니다.

그런 다음 적절한 크기의 생검 펀치를 사용하여 하이드로겔 샘플을 잘라냅니다. 겔 사각형에서 여러 개의 하이드로겔을 펀칭하여 복제 및 대조 시료 역할을 합니다. 포토 마스크를 70% 에탄올에 10분 동안 담가 살균합니다.

그런 다음 포토 마스크를 세포 배양 후드에서 자연 건조시킵니다. 다음으로, 표면 패터닝을 위해 절단된 각 하이드로겔의 표면에 티올 단백질 용액을 1-2 마이크로리터 제곱미터로 피펫팅합니다. 단백질 용액을 하이드로겔 표면 전체에 고르게 펴서 균일한 단백질 고정화를 보장하는 것이 중요합니다.

하이드로겔 표면에 포토 마스크를 조심스럽게 놓습니다. 마스크를 부드럽게 눌러 마스크와 하이드로겔 표면 사이에 형성되는 기포를 제거합니다. 다음으로, 하이드로겔을 자외선 아래에 놓고 30-60초 동안 두 번째 자외선에 노출시킵니다.

PBS로 하이드로겔을 세척하여 미반응 종을 제거하고 각 하이드로겔을 웰 플레이트 내에 배치하여 패턴 표면이 위를 향하도록 합니다. 그런 다음 섭씨 4도의 PBS에서 밤새 젤을 씻습니다. 웰에서 PBS를 제거한 다음 각 웰에 250마이크로리터의 기초 EGM2를 추가하고 섭씨 37도에서 5-10분 동안 겔을 배양합니다.

배양 중에 트립신은 표준 기술을 사용하여 거의 융합에 가까운 HUVEC 플레이트를 단일 세포 현탁액으로 분해합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 스핀다운하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 성장 인자를 추가하지 않고 세포 펠릿과 기저 EGM2를 다시 현탁시키고 일부 세포 현탁액을 혈구계에 추가합니다.

농도를 결정하기 위해 세포를 세십시오. 다음으로, 하이드로겔이 들어 있는 플레이트를 300 x G에서 3분 동안 스핀다운하여 하이드로겔이 웰 바닥에 있고 떠다니지 않는지 확인합니다. 하이드로겔이 우물 내에 떠다니지 않는 것이 중요합니다.

부유 하이드로겔은 세포 파종의 성공을 제한하고 하이드로겔 이미징에 문제를 일으킬 수 있습니다. 천천히 피펫 75, 000 세포를 각 하이드로겔 표면의 중앙에 제곱 센티미터하여 젤을 방해하지 않습니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.

며칠 동안 주기적으로 접시를 제거하여 단백질 패턴에 대한 반응으로 세포의 이동을 관찰합니다. 2-3일마다 미디어의 50%를 교환합니다. 하이드로겔을 형성할 때 다양한 전구체 PEG-디아크릴레이트 농도를 사용하여 원하는 기질 강성을 얻을 수 있습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 20% PEG-DA 용액은 100킬로파스칼 이상의 강성과 상관관계가 있습니다. 또한 광 개시제 농도와 UV 노출 시간을 모두 고려하는 것이 중요한데, 두 변수 중 하나가 증가하면 여기에서 리소좀의 생체 활성으로 표시되는 부착 분자의 생체 활성이 감소하기 때문입니다. 하이드로겔 형성 중 UV 노출을 최소화하는 것은 후속 단백질 고정 반응을 위해 유리 아크릴레이트 작용기를 유지하는 데 중요합니다.

자외선에 2분 이상 노출된 하이드로겔은 빨간색으로 표시된 고정된 단백질 패턴을 생성할 수 없습니다. 또한 단백질 패턴에 대한 UV 노출이 증가함에 따라 더 많은 단백질이 표면에 반응합니다. 올바르게 준비되면 이러한 패턴화된 하이드로겔 기질에서 세포를 배양하여 세포의 거동을 조작할 수 있습니다.

여기서, 내피 세포는 VEGF 패턴 PEG 하이드로겔의 표면에 균일하게 파종되었습니다. 파종 2일 후, 내피 세포가 고정화된 VEGF를 포함하는 하이드로겔의 공간 영역으로 이동하는 것이 관찰되었습니다. 이 프로토콜의 개발에 따라 연구원들은 체외 세포 시스템을 위한 새로운 생체 활성 플랫폼을 탐색하기 위해 이를 사용하여 모든 단백질 또는 펩타이드를 고정시킬 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 고정된 분자의 생체 활성을 유지하기 위해 광개시제 농도와 UV 노출 시간을 최소화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 PEG 하이드로겔에 생체 활성 단백질과 펩타이드를 패턴화하고, 시드 세포를 하이드로겔에 균일하게 패턴화하고, 그에 따른 세포 반응을 관찰하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.