Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석

이 방법의 전반적인 목표는 두 개 이상의 세포간 접합 단백질이 세포 내에서 공동 국소화되는지 여부를 확인하고 공동 면역침전을 통해 물리적 상호 작용을 추가로 평가하는 것입니다. 이 방법은 정상 발달 및 유방암과 같은 질병에서 연접부가 수행하는 역할을 포함하여 유선의 생물학에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 저렴한 비용으로 생체 내에서 단백질-단백질 상호 작용에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다는 것입니다.

동면역 형광 염색을 수행하려면 냉동고에서 적절한 현미경 슬라이드를 회수하십시오. 실온에서 15분 동안 4% 포름알데히드에 절편을 담가 즉시 고정합니다. 그런 다음 슬라이드를 실온에서 인산염 완충 식염수에 담그십시오.

다음 단계로 진행할 때까지 슬라이드를 그대로 둡니다. 시중에서 판매되는 소수성 장벽 또는 발수 실험실 펜을 사용하여 슬라이드의 각 섹션을 동그라미로 만듭니다. 즉시 PBS 방울을 조직에 추가하고 나머지 절차 동안 슬라이드를 인간 조직학 챔버에 놓습니다.

실온에서 30분 동안 100-200마이크로리터의 3% 소 혈청 알부민-트리스 완충 식염수, 0.1% 폴리소르베이트-20으로 각 조직 단면을 차단합니다. 샘플이 차단되는 동안 TBS 0.1%폴리소르베이트-20에서 항체를 희석하여 1차 및 2차 항체 용액을 준비합니다. 흡인에 의해 차단 용액을 제거한 후, 희석된 1차 항체 100-200마이크로리터에 절편을 실온에서 60분 동안 배양합니다.

그런 다음 흡인에 의해 1차 항체 용액을 제거하고 250-500마이크로리터의 TBS 0.1% 폴리소르베이트-20으로 5분 동안 절편을 세척합니다. 세척을 두 번 반복하기 전에 흡인으로 세척 용액을 제거하십시오. 세척 용액을 흡입하고 100-200 마이크로리터의 적절한 Fluoro-4 접합 2차 항체를 실온에서 60분 동안 배양합니다.

흡인에 의해 2차 항체액을 제거한 후 TBS 0.1%폴리소르베이트-20 250-500마이크로리터로 절편을 5분간 세척한다. 세척액을 제거하고 두 번 반복합니다. 관심 있는 후속 단백질에 대해 1차 및 2차 신체의 적절한 조합을 사용하여 이 단계를 반복합니다.

최종 세척을 제거한 후 실온에서 5분 동안 1밀리리터당 1밀리그램 DAPI 및 TBS 0.1% 폴리소르베이트-20을 100 - 200 마이크로리터로 절편을 배양하여 핵 염색을 수행합니다. DAPI 용액을 흡입하고 수용성, 비형광 장착 매체 및 커버 슬립을 사용하여 슬라이드를 장착합니다. 슬라이드를 섭씨 4도의 냉장고에 최소 8시간 동안 평평하게 놓습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광 현미경 이미징을 진행합니다. 500-1000 마이크로 그램의 용해물을 수집하고 PBS에서 각 1.5 밀리리터 튜브에 200 마이크로 리터의 최종 부피로 희석합니다. 용해물의 첫 번째 튜브에 관심 항원에 대한 항체를 추가하고 얼음 위에 보관하십시오.

섭씨 4도의 온도에서 저속으로 튜브-롤러 믹서에서 밤새 튜브를 배양합니다. 다음 날, 50마이크로리터의 마그네틱 비드를 새 1.5ml 튜브에 넣어 사전 세척합니다. 구슬이 들어 있는 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 구슬이 자석 쪽으로 이동하도록 합니다.

200마이크로리터 피펫을 사용하여 비드에서 보관 버퍼를 제거합니다. 500마이크로리터의 PBS 0.1%폴리소르베이트-20을 첨가하여 비드를 세척하고 튜브를 10초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 비드가 자석 쪽으로 이동하도록 합니다.

200마이크로리터 피펫으로 피펫팅하여 과도한 세척 버퍼를 제거합니다. 용해물 항체 반응 복합체를 비드에 추가하고 롤러 믹서에서 실온에서 90분 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드가 자석 쪽으로 이동하도록 합니다.

200마이크로리터 피펫을 사용하여 흡인하여 용해물을 버리고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 500마이크로리터의 PBS를 넣고 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 이전과 같이 액체를 제거하여 비드를 두 번 세척합니다. 세척 단계에서는 와류를 피하고 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.

와류 없이 PBS 0.1%폴리소르베이트-20으로 비드를 한 번 세척하고 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 마지막 세척 버퍼를 폐기합니다. 용리하려면 튜브에 0.2 몰산 글리신 20마이크로리터를 추가하고 롤러 믹서에서 7분 동안 흔듭니다. 몇 초 동안 고속으로 원심분리한 후 상층액을 얼음처럼 차가운 새 튜브에 모읍니다.

각 튜브에 대해 세척 및 용리 단계를 반복합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 4x 버퍼를 40마이크로리터의 용출 샘플에 추가합니다. 즉시 색이 파란색으로 바뀔 때까지 용리된 샘플에 한 번에 한 방울씩 어금니 트리스를 추가하고 다음 튜브로 진행합니다.

용출된 샘플을 섭씨 70-90도에서 10분 동안 끓입니다. 준비된 용해물과 침전된 샘플을 SDS-PAGE 아크릴아미드 겔에 나란히 로드합니다. 약 95분 동안 또는 이동하는 단백질의 가장자리가 겔의 바닥에 도달할 때까지 100볼트의 실행 버퍼에서 겔을 실행합니다.

그런 다음 표준 프로토콜을 사용하여 겔을 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다. 그런 다음 5% 분유 TTBS를 넣고 저속으로 로커에서 1시간 동안 멤브레인을 막습니다. 침전이 성공적이었는지 확인하려면 침전된 단백질에 대해 첫 번째 항체를 사용하여 멤브레인을 조사합니다.

제조업체에서 권장하는 농도의 5% 분유 TTBS에 희석하십시오. 천천히 교반하면서 섭씨 4도의 흔들리는 플랫폼에서 밤새 멤브레인을 배양합니다. 다음 날, 교반이 심한 흔들 플랫폼에서 TTBS로 멤브레인을 5분씩 세 번 세척합니다.

그런 다음 TTBS에 희석된 양고추냉이 과산화효소와 접합된 적절한 2차 항체에 멤브레인을 실온에서 천천히 교반하면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. TTBS를 흔들며 흔들리는 플랫폼에서 TTBS를 사용하여 각각 5분씩 3-6회 세척합니다. 시판되는 루미놀 용액으로 멤브레인을 배양하여 2차 항체의 신호를 분석하고 제조업체의 지침을 따릅니다.

화학발광 이미징 시스템을 사용하여 신호를 검출합니다. 상호 작용하는 단백질을 식별하려면 동일한 블롯에 적절한 항체를 사용하여 이 단계를 반복합니다. 유선에서 간극연접(gap junction), 부착연접(adherence junction) 및 밀접연접(tight junction) 성분이 함께 상호 작용할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 동면역형광분석(co-immunofluorescence) 분석을 수행했습니다.

동면역형광분석법(co-immunofluorescence assay)은 부착연접(adherens junction)의 일체형 단백질인 베타-카테닌(beta-catenin)과 간극연접 단백질인 코넥신(Connexin) 26이 수유 7일째에 생쥐 유선의 세포막에서 노란색으로 반사되는 것처럼 공동 국소화하는 것을 보여줍니다. 세포핵은 파란색 DAPI 염색으로 시각화됩니다. 임신 18일째에 유선의 냉동 절편을 절단하고 녹색으로 표시된 밀접연접 단백질인 Claudin 7, 빨간색으로 표시된 접착 연접 단백질인 E-Cadherin, 산호색으로 표시된 간극연접 단백질인 Connexin 26에 대해 면역형광 염색했습니다.

핵은 파란색 DAPI로 염색되었습니다. E-Cadherin 및 Claudin 7 공동 국소화는 노란색에서 밝은 주황색으로 표시되는 반면, Connexin 26 및 E-Cadherin 및 Claudin 7 공동 국소화는 흰색 반점 염색을 초래했습니다. 어떤 접합 단백질이 세포막에서 서로 섞이고 물리적으로 함께 묶여 있는지 알아내기 위해 수유 마우스의 유선(mammary synline) 조직을 사용하여 공동 면역침전을 수행했습니다.

결과는 간극연접의 구성 요소인 Connexin 43이 E-Cadherin 및 Claudin 7과 상호 작용하지만 Claudin 3과는 상호 작용하지 않는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 상호 면역침전(reciprocal immunoprecipitation)에 의해 확인되었다. E-Cadherin이 면역침전되었을 때 Connexin 43 및 Claudin 7과 상호 작용했습니다.

이 기술을 마스터하면 4-8개의 슬라이드에 대한 동시 면역 형광을 위해 2일 만에 완료할 수 있으며, 적절하게 수행되면 다음 날 슬라이드를 이미지화할 수 있습니다. co-immunofluorescence 절차를 시도하는 동안, 서로 겹치지 않는 파장을 가진 다른 공간에서 발생하는 다른 Fluoro 4 conjugated antibodies를 선택하고 co-immunoprecipitation에 사용되는 항체와 호환되는 적절한 protein A 또는 G magnetic bead를 선택하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 쥐 유선에서 세포 간 접합의 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

작업은 매우 위험하며 이 절차를 수행하는 동안 항상 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.