조각 패치 클램프 기술 학습 유도 소성을 분석 하기 위한

안녕하세요, 제 이름은 Dai Mitsushima입니다. 여기서는 훈련되지 않은 동물의 패치 클램프 데이터와 비교하여 훈련된 동물의 뇌 절편을 제작하는 방법을 보여드리겠습니다. 이를 통해 학습으로 유도된 시냅스 가소성을 분석할 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Hiroyuki Kida입니다. 본 실험에서는 Rotor rod test를 이용하여 운동 주행의 신경 메커니즘을 조사하였습니다. Rotor rod test는 설치류의 운동 인지 능력을 평가하는 데 널리 사용됩니다.

이 방법의 장점은 회전자 속도를 높여 테스트 중 발견 수준을 변경할 수 있다는 것입니다. 로터로드 테스트. 운동 과제 수행 전, 로터로드 장치는 300초 동안 4에서 40 rpm까지 가속되는 가속 모드로 설정해야 합니다.

쥐는 각 테스트당 10회 시도를 수행하도록 하였습니다. 시도 간 시간 간격은 30초였습니다. 첫 번째 훈련 세션 동안, 쥐들은 대개 저속에서도 로트에서 떨어지거나 때로는 잘못된 방향으로 걷기도 합니다.

하지만 반복 훈련 후에는 쥐가 더 빠른 속도로 걸을 수 있게 됩니다. 로드 위에서의 잠복기를 측정함으로써, 해당 기술에 대한 쥐의 학습 성과를 추정할 수 있습니다. 여기에서 로터 로드 테스트 결과를 확인할 수 있습니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이, 운동 기술을 습득하는 데 이틀간의 훈련으로 충분합니다. 첫 번째 시도에서의 잠복기와 비교했을 때, 사후 분석 결과 훈련 마지막 날의 최종 시도에서 유의미한 개선이 나타났습니다. 로드 위에서의 잠복기를 측정함으로써 쥐의 기술 학습 성능을 추정할 수 있습니다.

다음으로, 억제 회피 시험에 대해 보여드리겠습니다. 이 시험은 맥락적 학습 능력을 분석하는 데 유용합니다. 억제 회피 장치는 트랩 도어로 구분된 밝은 구역과 어두운 구역으로 구성되어 있습니다.

훈련 세션 동안, 쥐를 밝은 구역에 두고 환경에 적응할 수 있도록 짧은 시간을 줍니다. 문이 열리면 쥐는 자유롭게 어두운 구역으로 들어갈 수 있습니다. 쥐가 어두운 구역으로 들어가면 문을 닫고 2초 동안 약한 전기 충격을 줍니다.

시험 완료 후 30분 동안 케이지에서 휴식을 취한 뒤, 쥐들을 장치의 밝은 구역에 다시 배치합니다. 전기 충격 30분 후, 학습된 쥐들은 어두운 구역에 진입하기까지의 잠복기가 일관되게 더 길게 나타났습니다. 여기서 억제 회피 시험의 결과를 확인할 수 있습니다.

전기 충격 후, 쥐들은 평소에는 선호하지 않는 밝은 쪽에 머물며 어두운 구역을 피하는 법을 학습했습니다. 이러한 어두운 구역을 피하려는 경향은 맥락 기억의 습득을 나타냅니다. 훈련 후의 뇌 절편.

절개 전, 모든 가위, 지혈鉗(hemostat) 및 비커를 분쇄 얼음으로 냉각합니다. 여기서는 해부를 위한 준비 과정을 확인할 수 있습니다. 뇌 해부는 가능한 한 신속하게 수행해야 합니다.

깊은 마취 후, 쥐를 잘게 부순 얼음이 담긴 얕은 트레이에 놓고 복강을 열기 위해 절개합니다. 횡격막을 절개한 후, 추가로 측면 절개를 수행합니다. 흉강을 열기 위해서는 지혈鉗(hemostat)를 사용하여 늑연골을 집어 고정해야 합니다.

심장을 노출시킨 후, 18-gauge 스테인리스 스틸 바늘을 좌심실 후벽에 삽입합니다. 바늘 끝이 대동맥 벽을 통해 보여야 합니다. 우심이(right auricle)를 절개한 후 관류를 시작합니다.

바늘과 주사기 모두에 먼저 가스 처리된 얼음처럼 차가운 해부 완충액을 채워야 합니다. 관류 전에 모든 기포를 제거해야 합니다. 먼저, 두개골 후면을 절개하십시오.

그 다음 측면 절개를 하고, 이어서 중앙 절개를 통해 뇌를 노출시킵니다. 적출 후, 뇌를 기포가 발생하는 얼음처럼 차가운 완충액에 5분 동안 담가둡니다. 적출을 진행하기 전, 거름종이를 얼음처럼 차가운 완충액으로 적셔야 합니다.

그 후, 뇌를 얼음으로 냉각된 스테인리스 스틸 스테이지 위에 놓습니다. 뇌 절편의 정확한 절단 각도를 확보하기 위해서는 절단 스테이지의 각도가 매우 중요합니다. 각도가 부정확할 경우 표적으로 하는 피라미드 뉴런이 절단될 가능성이 있습니다.

트리밍 후, Vibratome 스테이지 위에 순간접착제 한 방울을 떨어뜨립니다. 강력한 접착을 위해 거름종이를 사용하여 과도한 해부 버퍼를 제거해야 합니다. Vibratome을 사용하여, 기포가 발생하는 얼음 냉각 버퍼 내에서 얇은 뇌 슬라이스를 제작할 수 있습니다.

우리의 표적 영역은 일차 운동 피질입니다. 표적 뇌 영역은 아이리스 가위를 사용하여 다듬어낼 수 있습니다. 인터페이스 챔버는 플라스틱 식품 용기를 사용하여 만들 수 있습니다.

인터페이스 챔버의 덮개는 가스를 가두어 두기 위해 필요합니다. 슬라이스는 적외선-DIC 현미경을 사용하여 관찰합니다. 여기에서 일차 운동 피질의 Layer 2/3 뉴런 예시를 확인할 수 있습니다.

패치 기록 피펫을 적절한 세포 내 용액으로 채웁니다. 전류 클램프 분석에 사용되는 용액은 전압 클램프 분석용 용액과 다릅니다. 대표적인 결과입니다.

전류 클램프(current clamp) 기법은 세포의 내재적 특성을 분석하는 데 유용합니다. 로터 로드(Rotor rod) 훈련 후, 일차 운동 피질의 Layer 2/3 뉴런에서 전류 클램프 데이터를 얻을 수 있었습니다. 패널 A는 전류 주입에 의해 유도된 전형적인 트레이스를 나타냅니다.

패널 B는 주입된 전류와 스파이크 수 사이의 관계를 나타냅니다. 1일 동안 훈련된 쥐는 스파이크 유도가 적게 일어난 반면, 2일 동안 훈련된 쥐는 훈련되지 않은 쥐보다 훨씬 더 많은 스파이크를 유도했습니다. 하단 패널에서 볼 수 있듯이, 1일 동안 훈련된 쥐는 더 낮은 휴지 전위, 더 높은 스파이크 임계값 및 더 깊은 후과분극을 보였습니다.

2일 동안 훈련된 쥐는 더 높은 휴지 전위와 막 저항을 나타냈습니다. 전압 클램프 기술은 학습으로 유도된 시냅스 가소성을 분석하는 데 유용합니다. 여기에서 맥락 훈련 후 CA1 뉴런의 데이터를 확인할 수 있습니다.

우리는 글루타메이트 또는 GABA의 단일 소포에 의해 유도된 CA1 뉴런의 미세 시냅스 후 전류를 측정하였습니다. 패널 A와 B는 미세 시냅스 후 전류의 대표적인 트레이스를 보여줍니다. Tetrodotoxin 존재 하에서, 동일한 뉴런 내의 미세 EPSC는 -16 mV에서, 미세 IPSC는 0 mV에서 순차적으로 측정되었습니다.

패널 C는 훈련되지 않은 군, 훈련된 군, 짝지어지지 않은 군 및 워크스루 쥐의 소형 EPSC 및 소형 IPSC 진폭의 2차원 도표를 보여줍니다. 패널 D는 소형 빈도에 대한 도표를 보여줍니다. 하단 패널에서 볼 수 있듯이, 맥락 훈련은 흥분성 및 억제성 시냅스 모두를 유의하게 강화하여 뉴런으로 들어오는 시냅스 입력의 다양성을 증진시켰습니다.

요약하자면, 전류-클램프(current-clamp) 기법은 학습으로 유도된 세포 특성의 변화를 분석하는 데 유용합니다. 또한, 전압-클램프(voltage-clamp) 기법은 흥분성 및 억제성 시냅스에서 학습 유도 가소성을 분석하기 위한 강력한 도구입니다. 이러한 분석의 자세한 결과는 다음의 출판물에서 확인할 수 있습니다.