Name: 컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 배우세요 컴퓨터 자동화 다중 전극 패치 클램프 기술로 최대 12개 신경세포를 동시에 기록하는 방법을. 이 기술은 신경 회로의 네트워크 특성을 고해상도로 분석하여 신경과학 연구의 효율성을 크게 향상시킵니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 패치 클램프 절차의 자동화를위한 개선에 유용한 조언을 길 라드 Silberberg 다음, 미셸 피나 텔리, 토마스 K. 버거, 루카 Gambazzi 및 소니아 가르시아에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 가치있는 조언과 소프트웨어 구현에 대한 지원은 Rajnish 란잔 감사합니다. 이 작품은 유럽 연합 (EU) 시냅스의 프로젝트에 의해 부분적으로 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 부분적으로 투자되었다.

1. 장비 준비 <ol><li> 컴퓨터에서 제어 조작기 <ol><li> 시리얼 포트 (RS-232)를 통해 컴퓨터에 각각의 미세 조작기 컨트롤러 박스를 연결합니다. </li><li> 쿼리 및 직렬 포트를 통해 전송 될 수 있도록 설정을 조정, 위치에 대한 명령을 구현합니다. 주어진 속도와 하드웨어 호환성 문제는 C / C + +는 프로그래밍 언어로 추천합니다. </li><li> 제로 모터 및 긍정적 인 움직임이 모터로부터 멀리 지향에 대하여 가장 근접한 위치가되도록 매니퓰레이터의 참조 시스템을 표준화한다. </li><li> 2mm 시편 초점면 (좌표 [0, 0, 2000]) 위의 중앙 위치에 현미경을 배치합니다. </li><li> 상점, 각 조작기 들어 피펫 팁이 현미경의 시야의 중심에서 관찰 될 수 있도록 로컬 좌표. 이것은 각 전극의 초기 기준점이다. </li></ol></li><li> 기기, 비즈니스LIZE 전극 포지션.이 실험 중에 각 전극의 위치를 추적 할 수 있어야하는 것은 매우 유용하다. 그래픽 표현이 달성의 가장 직관적 인 방법입니다. 이를 위해 기준 각 전극의 시스템과 현미경의는 일치해야합니다. 이를위한 간단한 방법이다 : <ol><li> 시야의 중심 전극의 선단을 가져온다. </li><li> 매니퓰레이터의 각 축의 위치 및 현미경 각축을 저장한다. </li><li> 매니퓰레이터 비교적 큰 운동 (1mm)의 x-축으로 실행한다. </li><li> 한 번 더 현미경의 이동 끝을 찾습니다. </li><li> 그것이 마지막으로 측정 한 이후 현미경 위치의 차이를 계산한다. 이러한 현미경 축 상 전극 축 이동의 돌출부이다. </li><li> Y 전극의 조작의 Z 축에 대한 2.5 - 반복 2.3 단계를 반복합니다. 이것은 현미경 상 돌기의 행렬 &lt;(결정 축을 허용강한&gt; 그림 2) 또한 코사인 매트릭스라고 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg"></li><li> 그것이 가능 좌표계 현미경에 지정된 위치에 도달하는 전극 매니퓰레이터에 필요한 입체적 움직임을 계산할 수 있도록이 행렬을 전환 : <img alt="식 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg"></li><li> 초기 기준점을 사용하고 코사인 행렬은 현미경의 각 전극의 위치를​​ 결정하는 코디네이터. </li><li> 현미경, 정기적으로 각 전극의 위치 좌표에 기초하여 그래픽 표시. 우리는 전극의 위치마다 40 밀리 초를 그리는 C / C + + 그리기 라이브러리 (GDI +)를 사용하기로 결정했습니다. </li><li> 1.2.7 수 밀리의 위치 변경이 필요한 경우 매니퓰레이터 각도가 변경되거나마다, 예를 들면, 전극의 종류가 변경 될 때 - 반복 1.2.1 단계. </li></ol></li><li> positio를 저장 가능이러한 세포 또는 해부학 적 기준점으로 조직의 관련 기능의 NS는 현미경으로 조정합니다. </li><li> 영상을 획득하고 관련 정보를 오버레이. <ol><li> 기계적 현미경 카메라의 수평축과 현미경의 움직임의 x-축 정렬. </li><li> 컴퓨터에 라이브 비디오 및 오버레이 기능 및 소프트웨어 개발 키트 (SDK)를 가진 프레임 그래버 설치. </li><li> SDK와 함께 라이브 비디오 디스플레이의 동작을 구현합니다. </li><li> 현미경은 적절한 번역 및 스케일링 카메라 레퍼런스 시스템에 좌표계 변환합니다. </li><li> 약 40 밀리 초 (그림 3)의 정기적 인 라이브 결과 이미지에 카메라 좌표와 오버레이에 관련 기능을 그립니다. </li></ol></li><li> 컨트롤 앰프. <ol><li> 인터페이스로부터 증폭기 설정을 제어하는​​ 증폭기 소프트웨어를 이용한다. </li></ol></li><li> 공동오실로스코프를 ntrol. <ol><li> 시리얼 포트를 사용하여 PC에 오실로스코프를 연결합니다. </li><li> 전압 클램프 패치 클램프 절차의 여러 단계의 오실로스코프 규모, 커플 링 및 시간 해상도를 확인합니다 (예 : 전극 목욕, 인감 형성, 전체 셀 구성) 및 전류 클램프. </li><li> 앰프의 명령이 인터페이스에서 업데이트 될 때마다 적절한 오실로스코프 설정 명령을 보냅니다. </li></ol></li><li> 제어 피펫 압력. <ol><li> 도 4에 따른 압력 제어 장치를 조립한다. <ol><li> 적절 각 전자 부품을 공급하는 12 V / 5 V 전원을 사용한다. </li><li> 양압 버퍼 (100 ㎖ 용기) 한 막 펌프의 출력을 연결한다. </li><li> 음압 버퍼 (100 ㎖ 용기)에 하나의 막 펌프의 입구를 연결합니다. </li><li> pressu의 압력 센서에 피펫 홀더 튜브를 연결합니다제어 시스템 및 메인 압력 실에 연결되어 공압 밸브를 재. </li><li> 메인 압력 실에 연결된 밸브에 압력 각 버퍼를 연결합니다. </li><li> 메인 압력 구획과 대기 사이에 밸브를 연결합니다. </li><li> 메인 압력 실에 압력 센서를 연결합니다. </li><li> 각 버퍼에 압력 센서를 연결합니다. </li><li> 데이터 수집 보드에 압력 제어 시스템을 연결한다. </li><li> 하나의 아날로그 입력으로 각 압력 센서를 연결합니다. </li><li> 디지털 출력에 각 밸브를 연결합니다. </li></ol></li><li> 막 펌프에 연결을 제외한 모든 밸브를 열고 측정 된 압력을 뺀 모든 센서로부터의 오프셋 (offset) 대기의 압력을 제거합니다. </li><li> 압력 제어를 구현 <ol><li> 인터페이스의 각 피펫에 대한 긍정적 인 압력 제어를 활성화 또는 비 활성화시킬 수있는 컨트롤을 정의합니다. </li><li> 피펫에 대한 최소한의 긍정적 인 압력을 정의약 70 밀리바의의. </li><li> 활성 압력 제어하에 피펫의 압력이 설정 임계 값 아래로 떨어질 때마다 주기적으로 (매 0.5 초)을 검출한다. </li><li> 임계 값 초과시 피펫의 압력이 임계 값을 초과 할 때까지 짧은 기간 (20 밀리 초) 동안 문제의 피펫으로 메인 압력 실이 구획에 긍정적 인 압력 버퍼를 엽니 다. 다른 모든 밸브를 닫습니다. </li><li> 그 셀을 향한 최종 접근을 시작으로 더 압력 제어를 드 활성화. </li></ol></li><li> 씰 형성에 부정적인 압력을가 <ol><li> 모든 밸브를 닫고 실험을 누르면 버튼을 유지하여 필요로하는 시간에 대한 질문에 피펫으로 메인 압력 실이 구획을 향해 부정적인 압력 버퍼 밸브를 엽니 다. </li></ol></li></ol></li><li> 휴먼 인터페이스 장치에 명령을 중앙 집중화. <ol><li> 시판 wirele 연결PC에 SS 게임 패드. </li><li> 조이스틱 상태의 판독을 구현합니다. 예를 들어, 판독마다 5 밀리 초를 수행하는 C / C + +에 대한 다이렉트 라이브러리를 사용합니다. </li><li> 버튼은 마지막 단계 이후, 프레스 릴리스 또는 계속 누르고 된 어느를 감지하는 이전 상태와 현재 상태를 비교합니다. </li><li> 게임 패드의 각 버튼에 기능을 할당합니다. 이 매핑의 예는도 5에 도시된다. </li></ol></li></ol> 2. 패치 클램프 절차 <ol><li> 관심 영역의 뇌 조각을 준비합니다. </li><li> 현미경의 변위 범위의 중앙에있는 관심 영역으로 관심의 뇌 조각을 놓습니다. </li><li> 셀 선택 <ol><li> 현미경으로 탐색하여 그 세포를 식별합니다. 좌표계를 현미경에 따라 세포의 위치를​​ 저장 바로 그 셀의 상단에 라이브 비디오 화면에 마우스를 클릭합니다. </li> 이미지에 중첩 될 셀 위치에 마커를 추가 할 그래픽 인터페이스는 글로벌 개요와 소프트웨어를 선택한 셀뿐만 아니라 마이크로 피펫을 표시합니다. 또한 셀의 이미지는 파일 '셀 #. JPG'에서 향후 참조를 위해 캡처됩니다. </ol></li></ol><li> 피펫으로 세포의 속성 <ol><li> 관심의 셀을 선택 한 후, 각 셀을 기록 할 피펫 할당합니다. 그래픽 인터페이스를 설정해야 할당 컨트롤을 제공합니다. 확인란 '쇼 최종 위치'를 선택하여 최종 구성의 미리보기를 시각화. </li><li> 최종 위치 미리보기가 원하는 또는 '전체 선택'을 체크 박스에 체크되는 각각의 펫을 선택합니다. 필요한 경우 더 나은 시각화를 위해 현재의 위치 표시를 사용하지 않도록 설정합니다. </li></ol></li><li> 피펫을 준비 <ol><li> (- 많은 피펫을 사용하는 경우 8 MΩ 일반적으로 최고 6) 위스콘신 피펫 채우기세포 내 솔루션을 토륨 및 그 소유자에로드. 자신의 고착에 headstages을 배치하지만, 피펫 팁으로 화장실에 손이 닿지 않도록 앞으로 그들을 밀어하지 않습니다. </li><li> 긍정적 인 압력 제어를 가능하게하고 끝은 깨끗한 남아 있는지 확인하기 위해 모든 피펫을 선택합니다. 조심스럽게 제자리에 각 headstage를 밀어 넣습니다. </li></ol></li><li> 피펫 팁을 찾기 <ol><li> 3mm 'A'버튼을 누른 채 버튼 R2를 눌러 조각 위의 초점을 중앙 위치로 현미경을 배치합니다. 버튼 L2를 눌러 이전 실험에서 저장된 A 버튼을 누른 상태에서 각 조작에 대한 해당 위치를 사용 참고 : 대부분의 경우에서 관찰하기에 충분해야한다이 때보기에서 피펫의 독특한 그림자 또는 피펫의 축을 따라 작은 움직임 하나가 있어야합니다. 피펫 모양에 약간의 차이에 대한 보상은 수동으로 수행해야합니다. </li><li> 초점에 피펫 팁을 가져와. (아직 [0, 0 2000] 위치에 있어야합니다) 현미경을 이동하지 않고 비디오 디스플레이의 빨간색 중앙 점에 끝을 놓으십시오. </li><li> 피펫 각 피펫 팁이있는 후 버튼 C를 누른 상태에서 버튼 Z를 눌러 디스플레이의 중심에 소프트웨어를 알려, 거꾸로 그 피펫을 보낼 수 있도록 단추 A를 누른 상태에서 하나의 버튼 L1을 눌러 찾을 수 있습니다 다음 </li></ol></li><li> 세포 접근 <ol><li> 모든 피펫 팁을 정밀하게 위치 된 각각의 피펫이 세포에 기인하면, 자동으로 각 셀에 가까운 피펫을 배치합니다. 단순히 세포의 그룹의 중심을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 팝업 메뉴에서 옵션을 '클러스터'를 선택합니다. , 표시이 시간에 위치 할 모든 피펫을 선택하고 '모두 선택 피펫으로 이동'을 클릭합니다 클러스터 옵션 창에서. 그 세포의 각 클러스터에 대해이 작업을 반복합니다. </li><li> PE수동으로 최종 접근을 rform. 세포를 기준으로 피펫의 위치를​​ 다르게 지정하지만, 일반적으로 200 ㎛ 떨어져 조직 외부 피펫의 선단을 유지하는 충분한 수직 방향 피펫 및 그 위에 200 ㎛의 축에서 셀로부터 단순히 수 . 피펫의 위치가 완료 될 때까지 기다렸다가 버튼 C를 누른 상태에서 버튼 R1을 누르면 피펫으로 현미경 이동 </li><li> 비디오 디스플레이의 아무 곳이나 그 끝에 현미경을 집중하고 버튼 C.에게 사각형 격자를 누른 상태에서 B 버튼을 눌러 각 피펫의 위치를​​ 재 보정하면 간단히 피펫의 식별 된 위치를 나타내는 표시됩니다. 위치가 정확하지 않으면 버튼 C를 유지하면서, 비디오 디스플레이와 버튼을 누르면 Z의 중앙 점에 팁의 위치를 </li></ol></li><li> 세포 부착 된 구성을 설정 <ol><li> 현재 피펫에 대한 관심의 세포가 제대로 있는지 확인표시. 그렇지 않으면 중앙 빨간 점과 함께 관심의 세포에 맞게 현미경을 이동합니다. 마크 피펫 거리에 할당 된 셀에서 200 ㎛의 위치를​​ C 버튼을 누른 상태에서 버튼을 눌러 C. L2 버튼을 누른 상태에서 버튼 Y를 눌러 셀, 현미경은 자동으로 해당 위치로 이동합니다. </li><li> 이 빨간 점을 일치하도록 피펫의 위치를​​ 조정합니다. 버튼 X를 누른 상태에서 버튼 R1을 눌러 오프셋 피펫을 조정 </li><li> 천천히 기인 셀에 피펫 접근 버튼 X를 누른 상태에서 버튼을 L1을 눌러 테스트 펄스를 활성화합니다. </li><li> 세포막의 표면에 딤플의 형성을 관찰시인가 압력이 셀에 도달 할 수 있도록 버튼 Z 채 Y 버튼을 누름으로써 부압의 짧은 펄스를 적용한다. 약-65mV의 유지 가능성이 버튼 X를 누른 상태에서 버튼 L2를 눌러이 시점에서 설립한다 </li></ol></li><li> 전체 - 세포 구성<ol><li> 기가 시일은 각 셀에 대해 형성되면, 부압을인가함으로써 세포막을 파열 시작. </li></ol></li><li> 녹음을 수행 <ol><li> 당신의 레코딩을 수행하는 자극 / 수집 시스템을 사용합니다. 한 번에 펄스 또는 하나의 개별 셀에 펄스의 기차를 적용하고 기록 세포 사이의 연결을 매핑하는 나머지 셀에 반응을 관찰합니다. </li></ol></li><li> 피펫을 떼다 <ol><li> 녹음이 완료되면, 테이블 라디오 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 조직에서 서서히 피펫을 떼다. 피펫은 자신의 축을 따라 짧은 거리를 후퇴 가지고 '을 떼 -&gt; 피펫 500 μm의'를 선택합니다. (몇 가지 긍정적 인 압력을 적용하여 조언을 취소 도움이 될 수 있습니다) 세포의 잠재력 드리프트를 관찰합니다. </li><li> 모든 방법을 다시 피펫을 떼다, '빠른'에 위치 결정 속도를 설정하고 같은 작업을 반복하지만, '모든'옵션을 선택합니다. 사용을 제거부드럽게 headstages을 슬라이딩 홀더에서 피펫을 풀면 피펫. 그것은이 크게 피펫 팁의 위치를​​ 방해 할 수 있기 때문에 해당 소켓에 홀더를 왜곡되는 것을 방지하는 데 유용합니다. </li></ol></li>

<ol><li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473(2010).</li>
<li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense%2C+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons%3A+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network%3A+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition%2C+excitation+and+bistable+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li>
<li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li>
<li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single%2C+Genetically+Targeted+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003(2011).</li>
<li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLM+Microscopy%3A+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

즉각적인 문제는 우리가 일반적으로 기술 된 과정 성공률 관한 생긴다. 높은 성공률에 대한 준비는 필수적이다. 피펫은 기록 된 세포의 존재에 대한 적절 팁 구멍이 있어야합니다. 막힌 피펫을 피하기 위해 세포 내 액을 여과하는 것도 중요하다. 매우 깨끗하고, 갓 뽑아 피펫은 다른 요구 사항입니다. 이항 분포는 이러한 문제를 최종 수율에 영향을 미치는 방법을 이해하는 데 사용할 수있는 간단한 모델입니다. 그것은 80 % 시각적 피드백 개별 뉴런을 기록 더의 성공률을 달성하기 위해 경험과 적절한 장비와 실험을 기대하는 것이 합리적이다. 초보자 중요한 준비 단계가 간과 특히, 매우 낮은 성공률을 달성 할 것으로 예상 할 수있다. 이 비율은 실험 당 기록 된 세포의 숫자가 변환되는 방법을 그림 10에서 볼 수 있습니다. 동시에 패치 조개의 수 또한 증가PED 신경 가능성이 조작기의 소형화와 차례로 세부 사항에 상당한주의를 필요로하는 절차의 신뢰성 향상을 필요로하지만, 완전히 실현 가능한 것입니다. <...

마이크로 미터 정밀도로 다수의 사이트를 기록하고 자극하는 능력은 실험적 신경 시스템의 더 나은 이해를 달성하기 위해 매우 유용하다. 대부분의 기술은이를 위해 개발되었습니다 만, 어느 것도 submillivolt 해상도가 서브 스레숄드 활동 및 개별 시냅스 잠재력을 공부에 필수적인 패치 클램프 기술에 의해 달성 할 수 없습니다. 여기에서 우리는 동시에 녹음하고 신경원 연결성의 연구를위한 충분한 정밀도로 각 셀을 다수 자극 겨냥 열두 전극 컴퓨터 보조 패치 - 클램프 시스템의 개발을 포함한다. 많은 다른 애플리케이션이 같은 시스템에 대해 생각 될 수 있지만, 뉴런의 그룹 내에서 가능한 연결의 수가 문제 뉴런의 수의 제곱에 비례하여 성장한다는 관련 시냅스 연결의 연구에 특히 잘 빌려 준다. 따라서, 세 개의 전극 시스템에게 테스트 수 있지만최대 6 개의 연결의 발생과 가장 자주 열두 뉴런을 기록, 단일 한 기록은 최대 132 연결의 발생을 테스트하고 자주 (그림 1) 하나 이상의 다스을 관찰 할 수 있습니다. 연결 수십 동시에 관측 가능 소규모 네트워크의 구성을 분석하고, 그렇지 않으면 1 프로빙 할 수없는 네트워크 구조의 통계적 성질을 유추 ​​할 수있다. 또한, 수많은 세포의 정확한 자극은 시냅스 후 세포 2 모집의 정량화 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>40X Immersion Objective</td></tr><tr><td>Manipulators</td><td>Luigs Neumann</td><td>SM-5</td><td>Serial protocol used</td></tr><tr><td>증폭기</td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>SDK used</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Till Photonics</td><td>VS 55</td><td>BNC analog output</td></tr><tr><td>Framegrabber</td><td>Data Translation</td><td>DT3120</td><td>SDK used</td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Tektronix</td><td>TDS 2014</td><td>시리얼 통신</td></tr><tr><td>데이터 수집</td><td>InstruTECH</td><td>ITC 1600</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td>사용 라이브러리 (.dll)</td></tr><tr><td>압력 밸브</td><td>SMC</td><td>SMC070C-6BG-32</td><td></td></tr><tr><td>압력 센서</td><td>Honeywell</td><td>24PCDFA6G</td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 펌프</td><td>Schego</td><td>Optimal</td><td></td></tr></tbody></table>

컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

패치 클램프 기술은 개별 신경 세포 또는 세포 내 구획에서 전기 활동을 기록하기위한 가장 잘 확립 된 방법 오늘입니다. 그럼에도 불구하고, 안정된 기록을 실현에도 개별 세포에서 상당한 복잡도의 시간 소모적 인 절차 남아있다. 효율적인 정보 표시와 함께 여러 단계의 자동화가 크게 더 큰 신뢰성과 녹음의 큰 숫자를 수행하는 적은 시간 experimentalists 에의을 지원할 수 있습니다. 대규모 기록을 달성하기 위하여, 우리는 가장 효과적인 접근법은 완전히 공정을 자동화하기 위하여 만 실험 단계를 단순화하고 효율적 실험자의 경험 및 비주얼 피드백을 도입하면서 인간의 오류의 가능성을 줄일 수없는 결론 지었다. 이러한 목표를 마음에 담아두고, 우리는 하나의 인터페이스에서 다중 전극 패치 클램프 실험, COMMERC에 필요한 모든 컨트롤을 중앙 집중식으로 컴퓨터를 이용한 시스템을 개발ially 사용할 수있는 무선 게임 패드, 컴퓨터 화면에 실험 관련 정보 및 안내 신호를 표시하는 동안. 여기에서 우리는 우리가 기록 구성을 달성하기 위해 필요한 시간을 감소시키고 실질적으로 동시에 성공적 뉴런 다수의 기록 가능성을 높일 수 시스템의 다른 구성 요소를 설명한다.

상술의 방법으로 우리는 다음 거의 동시에 신경 세포의 큰 숫자 패치 클램프 따라서 작게 배로 동시에 최대 열두 뉴런의 전체 - 세포의 기록을 행하는 것에 성공. 쥐의 체 감각 피질의 레이어 V에 기록 된 피라미드 뉴런 사이의 직접 시냅스 연결의 네트워크의 예는 그림 6에 나와 있습니다. 주어진 세포 유형에 대한 간 체세포의 거리의 함수로서 접속 확률 정보의 판정은 다중 전극 패치 - 클램프 시스템 (1)을 효율적으로 수행 할 수있는 그 대표적인 측정이다. 최근 사진 자극은 데이터 3,4를 얻는 훨씬 더 효율적인 방법으로 표시하기 시작했다. 중요하게, 그러나, 다중 전극 패치 - 클램프 시스템으로 취득한 데이터는 실험자가 더욱 연구중인 네트워크의 맵핑뿐만 아니라 인트라 가진 고해상도 염색을 얻을 수세포는 염료를 확산. 다중 전극 패치 클램프 실험에서 모든 세포는 종종 사진 자극 칼슘 이미징과 같은 다른 기술의...

다중 전극 패치 클램프 녹음은 복잡한 작업을 구성한다. 여기에서 우리는 실험 단계의 많은 자동화함으로써, 성능과 녹음 수의 질적 향상으로 이어지는 프로세스를 가속화 할 수 방법을 보여줍니다.

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

이 절차의 전반적인 목표는 전체 셀 모드에서 최대 12개의 셀에 대한 패치 클램프 기록을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 관심 있는 각 셀의 위치를 표시하고 각 셀에 피펫을 할당하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 각 파이펫의 팁을 찾아 할당된 세포 옆으로 파이펫을 자동으로 이동하는 것입니다.다음으로, 한 번에 하나의 피펫으로 각 세포에 접근합니다. 세포막과 단단히 밀봉하기 위한 마지막 단계는 세포막을 파열하고 전체 세포 기록을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 컴퓨터 지원 다중 전극 패치 클램프 기록은 고해상도로 작은 신경 회로의 네트워크 특성을 보여주는 데 사용됩니다.수동 패치 클램프와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 네트워크에서 관찰할 수 있는 연결의 수가 기록되는 뉴런 수의 제곱에 따라 증가한다는 것입니다. 이 기술의 시각적 시연은 패치 클램프 단계가 복잡하고 수행해야 하는 속도로 인해 배우기 어려울 수 있기 때문에 중요합니다. 현미경의 변위 범위 중앙에 관심 영역이 있는 뇌 절편을 배치하여 이 절차를 시작합니다.다음으로, 관심 있는 셀을 식별합니다. 그런 다음 현미경 좌표계를 기반으로 세포의 위치를 저장합니다. 그래픽 인터페이스는 전체 개요를 위해 선택한 셀과 마이크로 파이펫을 표시하며, 소프트웨어는 이미지에 오버레이될 셀 위치에 마커를 추가합니다.또한 나중에 참조할 수 있도록 세포의 이미지가 캡처됩니다. 관심 있는 셀을 선택한 후 그래픽 인터페이스에서 할당 컨트롤을 설정하여 개별 셀을 기록하는 데 사용할 파이펫을 할당합니다. show final positions(최종 위치 표시) 확인란을 선택하여 최종 구성의 미리보기를 시각화합니다.이제 세포 내 용액으로 피펫을 준비하고 홀더에 놓습니다. 헤드 스테이지를 고정 장치에 배치하되 앞으로 밀지 마십시오. 피펫 팁으로 수조를 만지지 않으려면 양압 제어를 활성화하고 모든 피펫을 선택하십시오.팁이 깨끗하게 유지되도록 하려면 각 헤드 s를 부드럽게 밉니다.tage 제자리에 있습니다. 다음으로, 버튼 A를 누른 상태에서 R 두 버튼을 눌러 슬라이스 위 2mm의 초점으로 현미경을 중앙 위치에 배치합니다.이 시점에서 버튼을 누른 상태에서 L 두 버튼을 눌러 이전 실험에서 저장된 각 매니퓰레이터에 대한 해당 위치를 사용하면 A.At 피펫의 독특한 그림자가 보이거나 피펫 축을 따라 작은 움직임이 충분해야 합니다. 그것을 관찰하기 위해. 피펫 모양의 약간의 차이에 대한 보상은 수동으로 수행해야 합니다.다음으로, 피펫 팁에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 팁을 비디오 디스플레이의 빨간색 중앙 점에 놓습니다. 현미경을 움직이지 않고 컨트롤러의 C 버튼을 누른 상태에서 Z 버튼을 눌러 피펫이 디스플레이 중앙에 있음을 소프트웨어에 알립니다.개별 파이펫 팁을 찾은 후 해당 파이펫을 뒤로 보내면 버튼 a를 누른 상태에서 L 버튼 하나를 눌러 다음 파이펫을 찾을 수 있습니다. 모든 파이펫 팁이 정확하게 배치되고 각 파이펫이 셀에 속합니다. 그래픽 표현 창에서 세포 그룹의 중앙을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 팝업 메뉴에서 cluster 옵션을 선택하기만 하면 파이펫을 해당 세포 가까이에 자동으로 배치할 수 있습니다.클러스터 옵션(cluster options) 창에서 현재 배치하고자 하는 모든 파이펫을 선택하고 선택된 파이펫과 함께 go(이동)를 클릭합니다. 관심 있는 셀의 각 클러스터에 대해 이 절차를 반복합니다. 최종 접근법을 수행하려면 세포를 기준으로 피펫의 위치를 피펫 축의 셀에서 200미크론 떨어진 곳으로, 수직 방향으로 200미크론 위로 지정하여 피펫 팁을 조직 외부에 유지하기에 충분합니다.그런 다음 피펫의 위치 지정이 완료 될 때까지 기다립니다. 그런 다음 C. 버튼을 누른 상태에서 R 버튼을 눌러 현미경을 피펫 쪽으로 이동합니다. 비디오 디스플레이의 아무 곳에서나 현미경을 팁에 초점을 맞추고 C 버튼을 누른 상태에서 B 버튼을 눌러 각 피펫 위치를 재보정합니다. 피펫의 식별된 위치를 나타내는 사각형 그리드가 잠시 나타나야 합니다. 위치가 올바르지 않으면 팁을 비디오 디스플레이의 중앙 점에 놓고 컨트롤러의 C 버튼을 누른 상태에서 Z 버튼을 누릅니다.이제 현재 피펫에 대한 관심 셀이 올바르게 표시되고 적극적으로 표시되어 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면, 초점 빨간 점과 관심사의 세포와 일치하기 위하여 현미경을 움직이십시오, 단추 C.를 누르고 있는 동안 Y 단추를 눌러서 세포를 표를 하십시오 C.Then C.To 단추를 누르고 있는 동안 L 2 단추를 누르십시오 그것의 할당된 세포에서 피펫 200 미크론 멀리 피펫을, 현미경 자동적으로 움직일 것입니다. 빨간색 점과 일치하도록 피펫 위치를 조정합니다.그런 다음 R one 버튼을 눌러 파이펫 오프셋을 조정합니다. 버튼 x를 누른 상태에서. 버튼 x를 누른 상태에서 L 버튼 하나를 눌러 테스트 펄스를 활성화합니다.그 후, 피펫을 기인하는 세포로 천천히 이동합니다. 세포막 표면에 딤플이 형성되는 것을 관찰하면 Z 버튼을 누른 상태에서 Y 버튼을 눌러 짧은 음압 펄스를 가하여 적용된 압력이 세포에 도달하도록 합니다. 이 시점에서 약 음의 65밀리볼트의 유지 전위는 버튼 x를 누른 상태에서 L 두 버튼을 눌러 설정해야 합니다.각 세포에 대해 기가 씰이 형성되면 음압을 가하여 멤브레인을 파열하기 시작합니다. 다음으로, 자극 획득 시스템을 사용하여 녹음을 수행합니다. 개별 세포에 펄스 또는 펄스 트레인을 한 번에 하나씩 적용하고 나머지 세포의 반응을 관찰하여 기록된 세포 간의 연결성을 매핑합니다.기록이 완료되면 테이블 라디오 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 조직에서 피펫을 천천히 빼냅니다. 500미크론 후퇴 피펫을 선택하여 피펫이 축을 따라 짧은 거리 후퇴하도록 합니다. 그런 다음 피펫을 완전히 뒤로 물러나게 하는 세포의 전위가 표류하는 것을 관찰합니다.포지셔닝 속도를 고속으로 설정하고 동일한 작업을 반복하되 모두 옵션을 선택합니다. 헤드 s를 부드럽게 밀어서 사용한 피펫을 제거합니다.tages를 열고 홀더에서 피펫의 나사를 풉니다. 다음은 개별 실험에서 매핑된 직접 시냅스 연결 네트워크의 예입니다.이 세 가지 연결 다이어그램은 각 inters 체세포 거리와 함께 레이어 5에 기록된 12개의 파라메탈 셀 세트입니다. 그리고 다음은 기록된 파라메탈 세포의 형태학적 염색에 겹쳐진 연결성 다이어그램입니다. 이 그림은 공통 이웃 효과를 보여줍니다.파란색 열은 샘플링된 네트워크에서 하나 이상의 다른 뉴런에 동시에 연결된 뉴런 쌍을 나타냅니다. 증거 A: 상호 연결될 확률이 크게 증가했습니다. 다음은 여러 공통 이웃을 공유하는 뉴런 쌍이 샘플링된 네트워크에서 우연히 예상보다 더 자주 발생하며, 뉴런 쌍 내의 연결 확률은 지불자가 공유하는 공통 이웃의 수에 따라 증가합니다.이러한 속성은 차례로 작은 세계 클러스터 네트워크를 발생시킵니다. 이 그림은 Martin nty 세포의 모집을 정량화한 것을 보여줍니다. 이것은 파란색의 Martin nty 세포에 시냅스를 형성하는 빨간색의 파라메탈 세포를 그래픽으로 표현한 것으로, 이 세포는 다시 두 번째 파라메탈 세포에 시냅스를 형성합니다.검은색 상부 세포에서 파라메탈 세포의 역치 자극은 Martin nty 세포의 동원으로 이어집니다. 촉진 흥분성 시냅스 후 전위의 통합을 통해, 모집된 Martin nty 세포는 두 번째 파라메탈 세포를 억제합니다. 이 다이어그램은 패치 클램프 파라메탈 셀의 수가 증가함에 따라 발생하는 자극과 다른 파라메탈 셀에 미치는 영향을 나타냅니다.다음은 자극된 근처의 다른 파라메탈 세포의 수에 대한 함수로 파라메탈 세포에서 기록된 평균 억제 시냅스 후 전위입니다. 국소 회로에서 DYS 시냅스 억제의 진폭은 9개 이상의 파라메탈 세포가 자극될 때 포화되는 경향이 있으며, 점점 더 많은 수의 파라메탈 세포가 자극됨에 따라 DYS 시냅스 억제를 받는 세포의 비율이 1로 빠르게 증가합니다. 이 절차를 시도하는 동안 피펫의 끝을 깨끗하게 유지하고 접근 단계에서 혈관 및 기타 세포를 피하여 조직 왜곡을 최소화하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 다른 세포 유형에 의한 패치된 클램프 셀의 혁신과 같은 추가 질문을 해결하기 위해 광 자극과 같은 추가 방법을 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 여러 뉴런에 대한 패치 클램핑 절차를 가속화하고 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이것은 Xenopus laevis oocytes에서 클​​램프의 녹음 패치에 대한 소개로서 것입니다. 그것은 vitelline 막 제거, gigaohm 인감 (gigaseal)의 형성, 그리고 외부 아웃 토폴로지에 패치의 선택 변환을 다룹니다.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로...

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

이 비디오는 암포테리신-B 매개 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 배뇨근 평활근 세포의 일시적인 수용체 전위 멜라스타틴 유형 4(TRPM4) 이온 채널의 양이온 전류의 특성화를 보여줍니다. 이 기술은 이온 채널의 생물물리학적 및 약리학적 특성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

Amphotericin-B 매개 천공 패치 클램프 분석: 방광 세포의 이온 전류를 연구하기 위한 전기생리학적 기법

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

인간의 다 능성 줄기 세포 (hPSC-CM)에서 유래 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성은 심장병 모델링 및 약물 반응 결정에 중요합니다. 이 프로토콜은 다중 전극 배열에서 hPSC-CM을 해리 및 플레이트하고 필드 전위를 측정하며 QT 및 RR 간격을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

이 프로토콜은 표준 시험관 전기 생리학 장비를 위해 최근에 개발 된 시스템을 사용하여 자동 이미지 유도 패치 클램프 실험을 수행하는 방법을 설명합니다.

뇌 조각에서 뉴런 연구를위한 자동 이미지 유도 패치 클램프의 적용

이 원고는 양성자 교통 시스템의 활동을 측정 하 양성자-선택적 전극 및 패치 방법 클램핑의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 메서드는 일반적으로 양성자 수송 활동, 적당 한 감도, 시간 해상도 및 부족 한 세포내 환경 제어 등을 연구 하는 데 사용 하는 기술의 몇 가지 제한 사항이 극복.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

단일 섬유 기록은 중추 및 말초 신경계에 적용할 수 있는 효과적인 전기 생리학적 기술입니다. 부착 된 동골 신경과 함께 손상되지 않은 DRG의 준비와 함께 전도 실패의 메커니즘을 검사합니다. 두 프로토콜 모두 말초 신경계의 통증과의 관계에 대한 이해를 향상시킵니다.

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

배우세요 컴퓨터 자동화 다중 전극 패치 클램프 기술로 최대 12개 신경세포를 동시에 기록하는 방법을. 이 기술은 신경 회로의 네트워크 특성을 고해상도로 분석하여 신경과학 연구의 효율성을 크게 향상시킵니다.

컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

더 많은 동영상 탐색