컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 전체 셀 모드에서 최대 12개의 셀에 대한 패치 클램프 기록을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 관심 있는 각 셀의 위치를 표시하고 각 셀에 피펫을 할당하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 각 파이펫의 팁을 찾아 할당된 세포 옆으로 파이펫을 자동으로 이동하는 것입니다.

다음으로, 한 번에 하나의 피펫으로 각 세포에 접근합니다. 세포막과 단단히 밀봉하기 위한 마지막 단계는 세포막을 파열하고 전체 세포 기록을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 컴퓨터 지원 다중 전극 패치 클램프 기록은 고해상도로 작은 신경 회로의 네트워크 특성을 보여주는 데 사용됩니다.

수동 패치 클램프와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 네트워크에서 관찰할 수 있는 연결의 수가 기록되는 뉴런 수의 제곱에 따라 증가한다는 것입니다. 이 기술의 시각적 시연은 패치 클램프 단계가 복잡하고 수행해야 하는 속도로 인해 배우기 어려울 수 있기 때문에 중요합니다. 현미경의 변위 범위 중앙에 관심 영역이 있는 뇌 절편을 배치하여 이 절차를 시작합니다.

다음으로, 관심 있는 셀을 식별합니다. 그런 다음 현미경 좌표계를 기반으로 세포의 위치를 저장합니다. 그래픽 인터페이스는 전체 개요를 위해 선택한 셀과 마이크로 파이펫을 표시하며, 소프트웨어는 이미지에 오버레이될 셀 위치에 마커를 추가합니다.

또한 나중에 참조할 수 있도록 세포의 이미지가 캡처됩니다. 관심 있는 셀을 선택한 후 그래픽 인터페이스에서 할당 컨트롤을 설정하여 개별 셀을 기록하는 데 사용할 파이펫을 할당합니다. show final positions(최종 위치 표시) 확인란을 선택하여 최종 구성의 미리보기를 시각화합니다.

이제 세포 내 용액으로 피펫을 준비하고 홀더에 놓습니다. 헤드 스테이지를 고정 장치에 배치하되 앞으로 밀지 마십시오. 피펫 팁으로 수조를 만지지 않으려면 양압 제어를 활성화하고 모든 피펫을 선택하십시오.

팁이 깨끗하게 유지되도록 하려면 각 헤드 s를 부드럽게 밉니다.tage 제자리에 있습니다. 다음으로, 버튼 A를 누른 상태에서 R 두 버튼을 눌러 슬라이스 위 2mm의 초점으로 현미경을 중앙 위치에 배치합니다.이 시점에서 버튼을 누른 상태에서 L 두 버튼을 눌러 이전 실험에서 저장된 각 매니퓰레이터에 대한 해당 위치를 사용하면 A.At 피펫의 독특한 그림자가 보이거나 피펫 축을 따라 작은 움직임이 충분해야 합니다. 그것을 관찰하기 위해. 피펫 모양의 약간의 차이에 대한 보상은 수동으로 수행해야 합니다.

다음으로, 피펫 팁에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 팁을 비디오 디스플레이의 빨간색 중앙 점에 놓습니다. 현미경을 움직이지 않고 컨트롤러의 C 버튼을 누른 상태에서 Z 버튼을 눌러 피펫이 디스플레이 중앙에 있음을 소프트웨어에 알립니다.

개별 파이펫 팁을 찾은 후 해당 파이펫을 뒤로 보내면 버튼 a를 누른 상태에서 L 버튼 하나를 눌러 다음 파이펫을 찾을 수 있습니다. 모든 파이펫 팁이 정확하게 배치되고 각 파이펫이 셀에 속합니다. 그래픽 표현 창에서 세포 그룹의 중앙을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 팝업 메뉴에서 cluster 옵션을 선택하기만 하면 파이펫을 해당 세포 가까이에 자동으로 배치할 수 있습니다.

클러스터 옵션(cluster options) 창에서 현재 배치하고자 하는 모든 파이펫을 선택하고 선택된 파이펫과 함께 go(이동)를 클릭합니다. 관심 있는 셀의 각 클러스터에 대해 이 절차를 반복합니다. 최종 접근법을 수행하려면 세포를 기준으로 피펫의 위치를 피펫 축의 셀에서 200미크론 떨어진 곳으로, 수직 방향으로 200미크론 위로 지정하여 피펫 팁을 조직 외부에 유지하기에 충분합니다.

그런 다음 피펫의 위치 지정이 완료 될 때까지 기다립니다. 그런 다음 C. 버튼을 누른 상태에서 R 버튼을 눌러 현미경을 피펫 쪽으로 이동합니다. 비디오 디스플레이의 아무 곳에서나 현미경을 팁에 초점을 맞추고 C 버튼을 누른 상태에서 B 버튼을 눌러 각 피펫 위치를 재보정합니다. 피펫의 식별된 위치를 나타내는 사각형 그리드가 잠시 나타나야 합니다. 위치가 올바르지 않으면 팁을 비디오 디스플레이의 중앙 점에 놓고 컨트롤러의 C 버튼을 누른 상태에서 Z 버튼을 누릅니다.

이제 현재 피펫에 대한 관심 셀이 올바르게 표시되고 적극적으로 표시되어 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면, 초점 빨간 점과 관심사의 세포와 일치하기 위하여 현미경을 움직이십시오, 단추 C.를 누르고 있는 동안 Y 단추를 눌러서 세포를 표를 하십시오 C.Then C.To 단추를 누르고 있는 동안 L 2 단추를 누르십시오 그것의 할당된 세포에서 피펫 200 미크론 멀리 피펫을, 현미경 자동적으로 움직일 것입니다. 빨간색 점과 일치하도록 피펫 위치를 조정합니다.

그런 다음 R one 버튼을 눌러 파이펫 오프셋을 조정합니다. 버튼 x를 누른 상태에서. 버튼 x를 누른 상태에서 L 버튼 하나를 눌러 테스트 펄스를 활성화합니다.

그 후, 피펫을 기인하는 세포로 천천히 이동합니다. 세포막 표면에 딤플이 형성되는 것을 관찰하면 Z 버튼을 누른 상태에서 Y 버튼을 눌러 짧은 음압 펄스를 가하여 적용된 압력이 세포에 도달하도록 합니다. 이 시점에서 약 음의 65밀리볼트의 유지 전위는 버튼 x를 누른 상태에서 L 두 버튼을 눌러 설정해야 합니다.

각 세포에 대해 기가 씰이 형성되면 음압을 가하여 멤브레인을 파열하기 시작합니다. 다음으로, 자극 획득 시스템을 사용하여 녹음을 수행합니다. 개별 세포에 펄스 또는 펄스 트레인을 한 번에 하나씩 적용하고 나머지 세포의 반응을 관찰하여 기록된 세포 간의 연결성을 매핑합니다.

기록이 완료되면 테이블 라디오 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 조직에서 피펫을 천천히 빼냅니다. 500미크론 후퇴 피펫을 선택하여 피펫이 축을 따라 짧은 거리 후퇴하도록 합니다. 그런 다음 피펫을 완전히 뒤로 물러나게 하는 세포의 전위가 표류하는 것을 관찰합니다.

포지셔닝 속도를 고속으로 설정하고 동일한 작업을 반복하되 모두 옵션을 선택합니다. 헤드 s를 부드럽게 밀어서 사용한 피펫을 제거합니다.tages를 열고 홀더에서 피펫의 나사를 풉니다. 다음은 개별 실험에서 매핑된 직접 시냅스 연결 네트워크의 예입니다.

이 세 가지 연결 다이어그램은 각 inters 체세포 거리와 함께 레이어 5에 기록된 12개의 파라메탈 셀 세트입니다. 그리고 다음은 기록된 파라메탈 세포의 형태학적 염색에 겹쳐진 연결성 다이어그램입니다. 이 그림은 공통 이웃 효과를 보여줍니다.

파란색 열은 샘플링된 네트워크에서 하나 이상의 다른 뉴런에 동시에 연결된 뉴런 쌍을 나타냅니다. 증거 A: 상호 연결될 확률이 크게 증가했습니다. 다음은 여러 공통 이웃을 공유하는 뉴런 쌍이 샘플링된 네트워크에서 우연히 예상보다 더 자주 발생하며, 뉴런 쌍 내의 연결 확률은 지불자가 공유하는 공통 이웃의 수에 따라 증가합니다.

이러한 속성은 차례로 작은 세계 클러스터 네트워크를 발생시킵니다. 이 그림은 Martin nty 세포의 모집을 정량화한 것을 보여줍니다. 이것은 파란색의 Martin nty 세포에 시냅스를 형성하는 빨간색의 파라메탈 세포를 그래픽으로 표현한 것으로, 이 세포는 다시 두 번째 파라메탈 세포에 시냅스를 형성합니다.

검은색 상부 세포에서 파라메탈 세포의 역치 자극은 Martin nty 세포의 동원으로 이어집니다. 촉진 흥분성 시냅스 후 전위의 통합을 통해, 모집된 Martin nty 세포는 두 번째 파라메탈 세포를 억제합니다. 이 다이어그램은 패치 클램프 파라메탈 셀의 수가 증가함에 따라 발생하는 자극과 다른 파라메탈 셀에 미치는 영향을 나타냅니다.

다음은 자극된 근처의 다른 파라메탈 세포의 수에 대한 함수로 파라메탈 세포에서 기록된 평균 억제 시냅스 후 전위입니다. 국소 회로에서 DYS 시냅스 억제의 진폭은 9개 이상의 파라메탈 세포가 자극될 때 포화되는 경향이 있으며, 점점 더 많은 수의 파라메탈 세포가 자극됨에 따라 DYS 시냅스 억제를 받는 세포의 비율이 1로 빠르게 증가합니다. 이 절차를 시도하는 동안 피펫의 끝을 깨끗하게 유지하고 접근 단계에서 혈관 및 기타 세포를 피하여 조직 왜곡을 최소화하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 다른 세포 유형에 의한 패치된 클램프 셀의 혁신과 같은 추가 질문을 해결하기 위해 광 자극과 같은 추가 방법을 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 여러 뉴런에 대한 패치 클램핑 절차를 가속화하고 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.