뇌 조각에서 뉴런 연구를위한 자동 이미지 유도 패치 클램프의 적용

이 기술의 전반적인 목표는 컴퓨터 비전을 사용하여 형광 세포를 자동으로 검출하고, 급성 뇌 절편 내의 해당 세포들에 대해 자동 패치 클램프를 수행하는 것입니다. 이 방법은 형광 표지된 세포의 식별, 타겟팅 및 패치 클램프와 같이 패치 클램프 전기생리학 분야의 주요 어려움을 극복하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주된 장점은 패치 피펫과 형광 세포를 자동으로 검출하고, 이를 자동 패치 클램프 단계와 통합할 수 있다는 점입니다.

이 혁신은 실험적 처리량을 상당히 증가시킵니다. 고처리량의 이미지 유도 자동 패치 클램프는 보다 생리적인 신경세포 표본의 약물 스크리닝에 사용될 수 있으므로, 이 기술의 영향은 신경계 질환의 치료나 진단으로까지 확장됩니다. 이 방법은 신경세포 소기관 전형이나 슬라이스 배양, 분리된 신경세포뿐만 아니라 모든 비신경세포와 같은 다른 인비트로(in vitro) 표본에도 적용될 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 증폭기, 현미경 컨트롤러 및 매니퓰레이터 컨트롤러의 전원을 켭니다. 그런 다음, 명령줄 터미널에서 Autopatcher IG가 설치된 디렉토리로 이동한 후 python으로 Autopatcher IG를 실행합니다. 이어서 Python Autopatcher_IG를 입력합니다.

명령줄 터미널에서 PYW를 입력하고 엔터 키를 누릅니다. 그 후, 유리 피펫을 내부 용액으로 완전히 채우고 헤드 스테이지에 장착합니다. 피펫 팁을 현미경 시야로 이동시켜 초점을 맞춥니다.

다이얼 패드를 사용하여 현미경 스테이지의 매니퓰레이터를 이동시킨 경우, 키보드의 Z를 눌러 좌표를 업데이트하십시오. 1차 보정은 매니퓰레이터의 이동 각도와 거리를 현미경 좌표계로 변환합니다. 매니퓰레이터가 설정된 거리만큼 세 방향으로 이동하면, 소프트웨어가 현미경 시야 내에서 피펫 팁의 좌표를 감지합니다.

피펫이 장착된 해당 유닛의 메인 GUI에서 보정 시작 버튼을 클릭하십시오. 그 후, 메인 GUI 하단의 보정 저장 버튼을 클릭하여 보정 내용을 저장하십시오. 이러한 기본 보정은 장비의 물리적 구성이 변경되지 않는 한 한 번만 수행하면 됩니다.

이 단계에서는 뇌 절편 하나를 기록 챔버의 중앙에 배치합니다. 슬라이스 고정 장치(slice hold down) 또는 하프(harp)를 사용하여 뇌 절편을 안정화합니다. 형광 세포를 검출하기 위해 4배 배율에서 관심 영역을 찾습니다.

그런 다음, 클릭 이동 모드를 켜고 관심 영역의 중심을 클릭하여 현미경 스테이지를 이동시킵니다. 또는 키패드를 사용하여 현미경 스테이지를 이동할 수도 있습니다. 다음으로, 고배율 렌즈로 교체하고 키패드의 RF를 사용하여 Z축 방향으로 현미경을 이동시켜 초점을 조절합니다.

소프트웨어가 현미경과 카메라를 제어하여 서로 다른 깊이에서 일련의 이미지를 촬영합니다. 그런 다음, 컴퓨터 비전 프로세싱을 통해 이 이미지들에서 형광 표지된 세포를 찾습니다. 최종 결과물은 검출된 세포 좌표의 목록입니다.

메인 GUI의 column unit zero에 있는 detect cell 버튼을 클릭하십시오. 셋업의 LED 또는 레이저 광원이 TTL 신호로 제어되지 않는 경우, LED 또는 레이저를 수동으로 켜십시오. 필요한 경우 LED 또는 레이저를 끄십시오.

메모리 포지션 GUI에 세포 좌표 목록이 표시됩니다. 좌표 옆의 X 버튼을 클릭하여 원하지 않는 세포를 목록에서 제거하십시오. 또는, 대상 세포에 형광 표지가 되어 있지 않은 경우, 메인 GUI에서 마우스 모드를 클릭하십시오.

그 다음, 관심 있는 세포를 클릭하면 세포 위에 숫자가 적힌 노란색 점이 나타나고, 메모리 위치 GUI에 해당 세포의 좌표가 표시됩니다. 피펫 오프셋 좌표를 검출하기 위해 2차 보정을 수행하려면, 유리 피펫의 1/3을 내부 용액으로 채웁니다. 그런 다음, 헤드 스테이지에 부착된 피펫 홀더에 피펫을 장착하십시오.

저배율에서 키패드의 1번과 2번을 사용하여 1번 장치와 2번 장치 사이를 전환합니다. 그 다음, 피펫을 시야 내로 가져온 후 키패드를 사용하여 초점을 조정하십시오. 이어서, 'load calibration'을 클릭하여 1차 교정을 로드합니다.

현미경 렌즈를 고배율로 전환하고 메인 GUI에서 40회를 클릭하십시오. 피펫 팁을 중앙으로 이동시킵니다. 그런 다음, 사용 중인 단위 아래의 메인 GUI에 있는 보조 교정 버튼을 클릭하십시오.

대상 세포를 패치하려면 패치 제어 버튼을 클릭하여 패치 제어 GUI를 엽니다. 메모리 위치 GUI의 좌표 목록에서 관심 세포 옆에 있는 이동 버튼을 클릭하십시오. 그 후, 메인 GUI의 유닛에 있는 CTM 버튼을 클릭하여 이동을 활성화합니다.

관심 있는 세포를 클릭하여 피펫 팁을 해당 세포로 이동시킵니다. 매니퓰레이터의 기계적 한계로 인해 500 micrometer 이상의 거리를 이동할 때 약간의 위치 오차가 발생할 수 있습니다. 큰 기계적 위치 오차를 방지하기 위해, 대상 세포 근처에서 2차 보정을 수행해야 합니다.

다음으로, 유닛 선택 버튼을 사용하여 두 유닛 간의 입력 신호를 전환합니다. 패치 컨트롤 GUI의 패치 버튼을 클릭하십시오. 자동 패칭이 시작되며, 패치 컨트롤 GUI에서 압력과 저항을 모니터링할 수 있습니다.

자동 패칭 알고리즘은 일련의 로직 루프를 통해 저항을 모니터링하고 압력을 제어하여 기가실(gigaseal)을 형성합니다. 팝업 창을 통해 기가실 형성이 알림으로 표시됩니다. 시스템은 저항 변화를 이용하여 세포 표면과의 접촉을 인식합니다.

세포 표면 접촉이 적시에 감지되지 않는 경우, 다음 버튼을 사용하여 동일한 자동 패칭 시도 내에서 패칭 단계를 진행하십시오. 패치 제어 GUI의 해당 버튼을 클릭하여 어느 시점에서나 자동 프로세스를 조작할 수 있습니다. 그런 다음, '예'를 선택하여 Zap과 흡입을 결합해 개입하십시오.

또는, 흡입으로만 진입(break-in)하려면 '아니오'를 선택하십시오. 그런 다음, 실험 패치 로그를 저장하십시오. 이 그림은 명령 시퀀스 GUI에 로드된 선택된 위치들을 보여줍니다.

왼쪽 열은 좌표 목록을 보여주며, 오른쪽 열은 각 위치에 대한 TTL 신호 형태의 명령 목록을 보여줍니다. 다음은 선택된 세 위치에 해당하는 약물 투여 실험 중의 스크린샷입니다. 시각화를 위해 KCL 용액을 적색 형광 염료와 혼합하였습니다.

단위 1은 KCl 함유 피펫이었으며 단위 2는 패칭 피펫이었습니다. 이 그림에서 단계적 전류 주입은 규칙적인 스파이킹 뉴런을 보여줍니다. 여기에는 세 곳에 500 mM 염화칼륨 용액을 국소적으로 처리했을 때의 전압 클램프 기록 트레이스가 나와 있습니다.

내향 전류가 나타난 빨간색 트레이스는 염화칼륨 적용 위치가 패치 세포와 가까웠을 때의 실험 결과입니다. 빨간색 화살표는 염화칼륨을 적용한 시점을 나타냅니다. 이 방법을 사용하면 수동 패칭에 비해 광범위한 훈련 없이도 4분 이내에 패치 클램프 실험을 수행할 수 있습니다.

이 절차를 수행한 후, 연구 프로젝트와 관련된 질문에 답하기 위해 광유전학, 화학유전학 및 약물학적 조작과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술이 개발됨에 따라, 신경과학 분야의 연구자들이 다양한 인비트로(in vitro) 표본에서 시냅스 수용체와 이온 채널에 대한 고효율 연구를 탐색할 수 있는 길이 열릴 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 이미지 유도 자동 패치 클램프 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.