Name: 뇌 조각에서 뉴런 연구를위한 자동 이미지 유도 패치 클램프의 적용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 학습하세요 급성 뇌 조각에서 형광 세포를 자동으로 검출하고 패치 클램프를 수행하는 방법을. 컴퓨터 비전 기술을 활용하여 전기생리학 실험의 효율성을 높이고 신경계 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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화이트 홀 재단 (Whitehall Foundation)의 재정 지원에 감사드립니다. 소중한 의견에 대해 사무엘 T 키신저 (Samuel T. Kissinger)에게 감사드립니다.

1. 시스템 설치 <ol><li> 압력 제어 장치를 구성하십시오. <ol><li> 회로도 ( 그림 1 )에 따라 압력 제어 장치를 조립하십시오. 전기 회로도 ( 그림 1b )에 따라 제조 된 인쇄 회로 기판 (PCB)에 필요한 부품을 납땜하십시오. 표준 저항기, LED, 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터 (MOSFET), 커패시터 및 커넥터를 사용하십시오 ( 재료 표 참조). 솔레노이드 밸브를 PCB에 납땜하십시오. 에어 펌프와 공기 압력 센서를 전선으로 PCB에 연결하십시오. 참고 : 필요한 모든 부품을 사용할 수 있도록 압력 제어 장치를 구성하는 데 약 2 시간이 걸립니다. </li></ol></li><li> 보조 데이터 수집 (DAQ) 보드를 연결하십시오. <ol><li> 표 1에 따라 인쇄 회로 기판의 데이터 출력을 DAQ 보드에 연결하십시오. 참고 : DAQ 보드는l &quot;단일 종단 모드&quot;에서 실행 중입니다. 포트 맵은 사용 설명서 ( Table of Materials 참조)에서 찾을 수 있습니다. </li><li> &quot;AIn Pr S&quot;를 아날로그 입력 (AI) 채널 중 하나에 연결하고 &quot;R-Gr&quot;을 보조 DAQ 보드의 아날로그 접지 중 하나에 연결하십시오. </li><li> 앰프의 1 차 출력을 AI 채널 중 하나에 연결하고 접지를 2 차 DAQ 보드의 아날로그 접지에 연결하십시오. 참고 : 표준 BNC 케이블을 사용하여 앰프의 기본 출력을 연결할 수 있습니다. </li><li> 다른 쪽 끝을 벗기고 양극 신호 ( 즉, 구리 코어)를 AI 채널과 접지 ( 즉 , 코어 주변의 얇은 와이어)와 아날로그 접지에 연결하십시오. 두 개 이상의 패치 채널이 사용되는 경우 두 번째 채널에 대해이 단계를 반복하십시오. 참고 : DAQ 보드의 아날로그 입력은 이후 단계에서 구성됩니다. </li><li> 보조 DAQ 보드의 전원 출력에 전원을 연결하십시오. 별도의 12 V 전원을 사용하십시오.펌프에 대한 욕구. </li></ol></li><li> 튜빙을 연결하십시오. <ol><li> 표 2 에 따라 공기 펌프와 두 개의 밸브를 연결하십시오. 마지막 단계에서 3 방향 커넥터를 사용하여 밸브 2 상단 포트, 압력 센서 및 피펫 홀더의 연성 튜빙을 연결하십시오. </li><li> 두 개의 피펫을 사용하는 경우 피펫 홀더에 연결된 튜빙에 다른 3 방향 커넥터를 추가하십시오. 패치 할 때 사용중인 밸브와 피펫을 수동으로 전환하십시오. </li></ol></li><li> Autopatcher IG를 설치하십시오. 참고 : 시스템 요구 사항 : Autopatcher IG는 Windows 7을 실행하는 PC에서만 테스트되었으며 다른 운영 체제에서는 유효성이 검증되지 않았습니다. 설명 된 절차는 Table of Materials에 나열된 하드웨어에만 적용됩니다. <ol><li> GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG)에서 Autopatcher-IG를 다운로드하십시오. </li><li> Python을 설치하십시오 (버전 및 다운로드 주소는 Table of Materials 를 참조하십시오). </li><li> PyQt4 제거명령 줄 터미널에 &quot;pip uninstall PyQt4&quot;를 입력하여 라이브러리를 엽니 다. 참고 : 시스템은 이전 버전의 PyQt4 라이브러리를 사용하여 Qwt 및 Opencv 라이브러리와의 호환성을 구현합니다. </li><li> 역사적인 바퀴 파일 (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/)에서 Python 라이브러리를 설치하십시오. Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none) -win32.whl) 및 Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl)입니다. <ol><li> 휠 파일을 설치하려면 파일이 저장된 디렉토리로 이동하여 &quot;pip install *** wheelfilename ***. whl.&quot;을 입력하십시오. &quot;*** wheelfilename ***&quot;을 실제 파일 이름으로 대체하십시오. 참고 : 휠 파일 이름의 &quot;cp27&quot;은 Python 2.7을 나타내며 &quot;win32&quot;는 Windows 32 비트를 나타냅니다. &quot;win32&quot;가 작동하지 않으면 &quot;win64&quot;를 시도하십시오. </li></ol></li><li> CCD 카메라를 제어하려면 설치 프로그램을 다운로드하여 설치하십시오.64 비트 용 (https://www.qimaging.com/support/software/). 그런 다음 MicroManager for 64-bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release)를 다운로드하여 Python으로 카메라를 제어하십시오. </li><li> 매니퓰레이터 및 현미경 스테이지를 제어하려면 제조업체가 제공하는 제어 소프트웨어를 설치하십시오. 참고 : 이렇게함으로써 조작기를 제어하는 ​​데 필요한 드라이버도 설치됩니다. 설치 패키지는 일반적으로 CD-ROM으로 제공됩니다. </li><li> 보조 DAQ 보드를 제어하려면 DAQ 보드를 구입 한 CD-ROM에서 Universal Library를 설치하십시오. </li></ol></li><li> Autopatcher IG의 하드웨어를 구성하십시오. <ol><li> 현미경 스테이지와 조작기 컨트롤러를 USB 포트를 통해 컴퓨터에 연결하십시오. </li><li> COM 포트 번호를 유닛 0에 지정합니다 : 현미경 스테이지, 유닛 1 : 왼쪽 조작기 및 유닛 2 : 오른쪽 조작기를이 순서대로 &quot;구성&quot;폴더의 &quot;ports.csv&quot;구성 파일에 지정하십시오. 엘ports.csv 파일의 다른 매개 변수 ( 예 : &quot;SCI&quot;및 &quot;1&quot;)는 변경되지 않습니다. 참고 : COM 포트 번호 정보는 제조업체가 제공 한 매니퓰레이터 구성 소프트웨어를 실행하여 찾을 수 있습니다. &quot;설정&quot;탭으로 이동하여 &quot;설정&quot;및 &quot;동작&quot;페이지를 선택하고 맨 위에있는 각 탭의 레이블을 읽습니다. 또는이 정보는 PC 장치 관리자에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 압력 센서와 패치 채널 1과 2 (유닛 1과 2에 해당)에 대해 DAQ 보드에 아날로그 입력 채널 번호를 할당하십시오. &quot;configuration&quot;폴더의 &quot;DAQchannels.csv&quot;파일에 채널 번호를 입력하십시오. 참고 : 스프레드 시트 대신 메모장 응용 프로그램으로 .csv 파일을 열면 변경 내용을 저장할 때 정보가 변경 될 수 있으므로이 파일을 열 것을 권장합니다. </li></ol></li><li> 자동 실행기 IG를 실행하십시오. <ol><li> 앰프, 현미경 컨트롤러 및 조작기 컨트롤러를 켭니다. 엔스앰프 소프트웨어가 작동 중입니다. </li><li> 다음과 같이 명령 행 터미널에서 Python으로 Autopatcher IG를 실행하십시오. 먼저 Autopatcher IG가 설치된 디렉토리 (대부분의 공통 터미널에 대해 &quot;cd&quot;명령)를 변경하고 명령 행 터미널에 &quot;python Autopatcher_IG.pyw&quot;를 입력하고 &quot;Enter&quot;키. 참고 : 현미경 스테이지와 조작기를 차지할 것이므로 Autopatcher IG를 실행하기 전에 조작자 제어 소프트웨어를 실행하지 마십시오. 그러면 Autopatcher IG가 하드웨어를 찾을 수 없게됩니다. 제어 할 추가 모듈 ( 예 : 인라인 히터)이 있으면 Autopatcher IG이 완전히 시작된 후에 매니퓰레이터 제어 소프트웨어를 실행할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 기본 피펫을 보정하십시오. <ol><li> 앞에서 설명한대로 패치 피펫을 당깁니다 9 . 풀어 놓은 유리 피펫을 내부 용액으로 채우고 헤드 스테이지에 올려 놓습니다. 참고 : 빈 유리 피펫의 콘트라스트가 다릅니다.현미경 및 부정확 한 교정으로 이어질 수 있습니다. </li><li> 피펫 팁을 현미경 시각 필드로 이동하고 초점을 맞 춥니 다. 다이얼 패드를 사용하여 조작기 및 / 또는 현미경 스테이지를 이동하는 경우 키보드의 &quot;z&quot;를 눌러 좌표를 업데이트하십시오. 참고 : 키보드 (현미경 스테이지 : A / D-x 축, W / S-y 축, R / F-z 축, 조작기 : H / K- x 축, U / 좌표가 실시간으로 업데이트되기 때문에 J - Y 축, O / L - Z 축, 1/2 - 단위 번호)이 이동을 제어하는 ​​데 사용됩니다. </li><li> 피펫이 장착 된 해당 장치의 주 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)에서 &quot;보정 시작&quot;버튼을 클릭하십시오 ( 그림 2 ). 참고 : 보정이 끝나면 팝업 창이 나타납니다. 참고 : 보정은 자동으로 수행되며 약 3.5 분이 소요됩니다. 동일한 버튼을 클릭합니다 ( &quot;교정 취소&quot;로 전환됨).캘리브레이션 시작)은 캘리브레이션 시도를 중단합니다. </li><li> 메인 GUI의 하단에있는 &quot;Save Calibration&quot;을 클릭하여 교정을 저장하십시오 (두 매니퓰레이터의 현재 교정을 저장하고 나중에로드 할 수 있음). 참고 : 낮은 (4 배 또는 10 배) 배율 및 높은 배율 (40 배)에서 시야를 조정해야 보조 조정이 올바르게 작동합니다. 정렬 절차에 사용되는 광학 시스템의 사용자 매뉴얼을 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 자동 패치 클램프 절차 <ol><li> 앞에서 설명한대로 급성 뇌 조각을 준비하십시오 10 . </li><li> 패치 클램프 용 유리 피펫을 준비하십시오. </li><li> 레코딩 챔버의 중앙에 하나의 뇌 슬라이스를 배치하십시오. 슬라이스 홀드 - 다운 또는 &quot;하프&quot;로 슬라이스를 안정화하십시오. </li><li> 형광 세포를 감지합니다. <ol><li> 4X 렌즈 아래에서 관심 영역을 찾습니다. cli를 켜서 현미경 스테이지 이동ck-to-move ( &quot;CTM&quot;) 모드를 선택하고 관심 영역의 중심을 클릭하십시오. 또는 키패드를 사용하여 현미경 스테이지 (A / D - x 축, W / S - y 축, R / F - z 축)를 이동하십시오. </li><li> 고배율 렌즈로 전환하고 키패드의 R / F를 사용하여 현미경을 z 축으로 이동하여 초점을 조정합니다. 참고 : 저배율 및 고배율 렌즈 아래의 초점 평면이 z 축에서 동일하거나 유사하도록 수조 수준을 조정하는 것이 좋습니다. </li><li> 메인 GUI 열의 &quot;Unit 0&quot;에서 &quot;Detect Cell&quot;버튼을 클릭하십시오. 설정의 LED 또는 레이저 광원이 TTL 신호로 제어 할 수없는 경우 수동으로 LED / 레이저를 켭니다. 셀 감지가 끝나면 팝업 창이 나타납니다. <ol><li> 필요한 경우 LED / 레이저를 끕니다. 셀 좌표 목록이 &quot;메모리 위치&quot;GUI에 나타납니다. 좌표 옆에있는 &quot;X&quot;버튼을 클릭하여 목록에서 원하지 않는 셀을 제거하십시오. </li><li>또는 대상 세포가 형광 표식이되어 있지 않으면 기본 GUI에서 &quot;마우스 모드&quot;를 클릭하십시오. 관심 세포를 클릭하십시오; 숫자가있는 노란색 점이 셀에 나타나고 셀의 좌표가 &quot;메모리 위치&quot;GUI에 나타납니다. </li></ol></li></ol></li><li> 보조 피펫을 보정합니다. <ol><li> 내부 용액으로 유리 피펫의 1/3을 채 웁니다. 헤드 스테이지에 부착 된 피펫 홀더에 피펫을로드하십시오. </li><li> 저배율 렌즈를 사용하십시오. 피펫을 시야로 가져 와서 키패드 (H / K-x 축, U / J-y 축, O / L-z 축)를 사용하여 초점을 조정합니다. 장치 1과 장치 2 사이를 전환하려면 &quot;1&quot;과 &quot;2&quot;를 사용하십시오. </li><li> &quot;Load calibration&quot;을 클릭하여 1 차 교정을로드하십시오. 사용중인 장치 아래의 기본 GUI에서 &quot;Secondary calibration&quot;버튼을 클릭하십시오. 예를 들어, 유닛 2가 사용 중이면 &quot;유닛 2&quot;공동의 &quot;Secondary calibration&quot;버튼을 클릭하십시오열. 팝업 창 지침에 따라 고배율 렌즈로 전환하십시오. </li></ol></li><li> 대상 셀에 패치를 적용하십시오. <ol><li> &quot;MultiClamp&quot;( 즉, 앰프) 소프트웨어가 실행 중인지 확인하십시오. &quot;패치 컨트롤&quot;버튼을 클릭하여 &quot;패치 컨트롤&quot;GUI를 엽니 다. 이 GUI를 열려면 몇 분이 걸릴 수 있습니다. </li><li> 기본 GUI &quot;Unit 0&quot;열에서 &quot;40X&quot;를 확인하여 40X 배율 렌즈를 사용하십시오. &quot;메모리 위치&quot;GUI의 좌표 목록에서 관심있는 셀 옆에있는 &quot;이동&quot;버튼을 클릭하십시오. 현미경이 셀로 이동합니다. </li><li> 메인 GUI에서 사용중인 유닛의 CTM 버튼을 클릭하면 마우스 클릭 후 움직임이 가능합니다. 관심 세포를 클릭하십시오; 피펫 팁이 셀로 이동합니다. </li><li> &quot;Patch control&quot;GUI에서 &quot;Patch&quot;버튼을 클릭하십시오. 참고 : 자동 패치가 시작되고 압력과 저항을 다음과 같이 모니터링 할 수 있습니다.&quot;Patch control&quot;GUI. <ol><li> &quot;Unit 1 selected&quot;버튼을 사용하여 두 장치 사이에서 입력 신호를 전환하십시오. 참고 : 시스템은 목표 세포에 접근하고, 부압을 가하고, 세포막 전위를 맞추고, 일련의 압력 및 저항 임계 값과 논리를 기반으로 기가 제형을 탐지합니다. </li><li> &quot;Patch control&quot;GUI에서 각각의 버튼을 클릭하여 언제든지 자동 프로세스를 조작 할 수 있습니다. 예를 들어 &quot;패치&quot;버튼을 다시 클릭하여 패치 평가판을 취소하고 &quot;다음 단계&quot;를 클릭하여 임계치에 관계없이 다음 단계로 패치 프로세스를 진행하십시오. 참고 : gigaseal이 형성되었을 때 사용자에게 팝업 창이 표시되고 커다란 부정적 압력과 함께 zap을 적용하는 옵션이 표시됩니다. </li></ol></li><li> &quot;예&quot;를 선택하면 zap과 suction을 결합하여 침입 할 수 있습니다. 또는 &quot;아니오&quot;를 선택하여 흡입만으로 침입하십시오. <br/&gt; 참고 : 성공적인 전체 셀 패치가 완료되면 사용자에게 실험 패치 로그를 저장하라는 팝업 창이 나타납니다. </li><li> 실험 패치 로그를 저장하십시오. 참고 : 패치 시험 사용이 실패하면 팝업 창이 사용자에게 알리고 패치 프로세스가 재설정됩니다. </li><li> 2.4 단계로 돌아가서 다른 셀을 사용하여 단계를 반복하십시오. </li></ol></li><li> 패치 임계 값을 조정하십시오 (선택 사항). 참고 : 초기 피펫 저항 범위, 양압 및 음압, 기가 레지 저항 등의 임계 값. 구성 파일에서 수정할 수 있습니다. <ol><li> 시스템이 설치된 대상의 &quot;구성&quot;폴더에서 &quot;PatchControlConfiguration.csv&quot;파일을 엽니 다. 각 임계 값에 해당하는 숫자를 변경하십시오. 값의 이름은 변경하지 마십시오. 이 경우 시스템에서 인식 할 수없는 항목이됩니다. </li><li> &quot;Ct&quot;를 눌러 새로운 임계 값을 즉시 구현하십시오.rl + L &quot;프로그램을 재시작하지 않고 프로그램을 다시 시작하면 파일에서 최신 임계 값을 구현합니다. </li></ol></li></ol> 3. 레코딩 수행하기 참고 : 컴퓨터 제어 마이크로 전극 증폭기의 모드는 성공적인 패치가 완료되면 자동 패치 소프트웨어에 의해 자동으로 현재 클램프 ( &quot;IC&quot;)로 설정됩니다. 전체 셀 패치 클램프 녹음은 선택한 녹음 소프트웨어를 사용하여 수행 할 수 있습니다 (이 시스템에는 녹음 기능이 포함되지 않음). 여러 대상 셀을 식별 한 경우 녹음을 마친 후에 2.4 단계로 돌아가서 다른 셀을 시도하십시오. <ol><li> picospritzer (선택 사양)를 사용하여 자동 국소 약물 적용 실험을 수행하십시오. 참고 : 여기에서는 로컬 마약 응용 프로그램 실험을 사용하여 추가 &quot;명령 순서&quot;기능을 사용하여 TTL 신호를 통해 외부 하드웨어를 제어하는 ​​방법을 설명합니다. <ol><li> 포트 A 차를 연결하십시오.단계 1.2.3에서 설명한대로 스트립 BNC 케이블을 사용하여 디지타이저의 시작 트리거 입력에 이차 DAQ 보드의 접지를 연결합니다. 디지타이저의 디지털 출력 채널 하나를 피코 스피처의 외부 트리거에 연결하십시오. </li><li> 사용자 설명서에 따라 피펫을 준비하십시오. picospritzer 공기 출력을 micromanipulator에 부착 된 약물 퍼프 피펫 홀더에 연결하십시오. </li><li> 선택 약물로 채워진 피펫을로드하십시오. 피펫 홀더에 부착하십시오. 단계 1.7에서 설명한대로 피펫을 보정하십시오. </li><li> 2.6 단계에서 설명한대로 세포를 패치 한 후 &quot;마우스 모드&quot;(메인 GUI에서 전환)에서 카메라보기 GUI를 마우스로 클릭하여 약물 전달을위한 원하는 위치를 선택하십시오. 또는 그리드의 각 픽셀을 대상 위치 중 하나로 그리드를 디자인하려면 &quot;그리드&quot;GUI를 사용하십시오. 참고 : 그리드는 마우스로 드래그하여 카메라보기 GUI에서 조작 할 수 있습니다. </li><li> &quot;Command SequenceGUI &quot;에서 약물 피펫이 장착 된 매니퓰레이터 유닛을 선택하십시오.&quot;마우스 포인트로드 &quot;또는&quot;그리드 포인트로드 &quot;를 클릭하여 약물 전달을위한 모든 좌표를 가져옵니다. <ol><li> 각 좌표 항목을 클릭하여 오른쪽 열에 특정 명령 TTL 신호를 편집하십시오. 첫 번째 명령 항목에서 가장 오른쪽 숫자를 클릭하여 &quot;0&quot;에서 &quot;1&quot;로 바꾸고 + 5V TTL 신호를 보냅니다. 시간 (T)을 원하는 TTL 신호 지속 시간 (ms)으로 설정하십시오. </li><li> 두 번째 명령 입력에서 모든 자릿수를 &quot;0&quot;으로 설정하고 T를 시험판 녹음 길이의 지속 시간으로 설정하십시오. 모든 좌표 항목에 대한 명령을 편집하십시오. 여러 개의 TTL 신호가 필요한 경우 &quot;+&quot;를 클릭하여 명령 항목을 추가하십시오. 참고 : 8 자리 비트는 필요한 경우 보조 DAQ (포트 1 - 3은 펌프와 2 개의 밸브가 차지함)의 포트 A 채널 0-7을 나타냅니다. </li></ol></li><li> 데이터 수집 모듈에 녹음 프로토콜을 만듭니다.스윕 시작은 외부 시작 트리거에 의해 트리거됨을 나타냅니다. 프로토콜을 편집하여 원하는 시간에 약물을 전달하십시오. </li><li> &quot;명령 시퀀스&quot;GUI에서 왼쪽의 &quot;실행&quot;을 클릭하여 모든 좌표를 실행합니다. 또는 오른쪽의 &quot;실행&quot;을 클릭하여 선택한 시퀀스 만 실행하십시오. 참고 : 피펫은 각 좌표로 이동하여 정의 된대로 TTL 신호를 실행하여 기록 스윕을 시작합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

비 임시 특허 출원 &quot;자동화 된 이미지 유도 패치 - 클램프 전기 생리학을위한 시스템 및 방법&quot;, 미국 일련 번호 : 15 / 353,719가 2016 년 11 월 16 일에 출원되었다. 번호 : PRF 67270-02.

여기서 우리는 체외에서 자동 이미지 유도 패치 클램프 녹음 을 위한 방법을 설명합니다. 이 프로세스의 핵심 단계는 다음과 같이 요약됩니다. 첫째, 컴퓨터 비전은 현미경을 통해 얻은 일련의 이미지를 사용하여 피펫 팁을 자동으로 인식하는 데 사용됩니다. 이 정보는 현미경과 조작자 좌표계 간의 좌표 변환 함수를 계산하는 데 사용됩니다. 컴퓨터 비전은 형광 표식 된 세포를 자동으로 탐지하고 그 좌표를 식별하는 데 사용됩니다. 이 단계는 피펫 타겟팅 및 오픈 소스 Python 프로그래밍 언어, PyQT 및 OpenCV 라이브러리를 사용하는 자동 패치 알고리즘과 통합됩니다. 기존 의 시험 관내 패치 클램프 방법 에 비해,이 시스템은 여러 영역에서 상당한 개선을 이루었습니다. 그것은 인간의 개입을 최소화합니다. 이 시스템은 패치 클램프 실험에서 대부분의 단계를 자동화하여 req를 최소화합니다.인간 개입을위한 의욕. 저배율 /...

패치 클램프 기술은 제 1 막 흥분성의 이온 채널을 연구 1970 Neher 및 Sakmann에 의해 개발되었다. 그 이후 패치 클램핑은 뉴런, 심근 세포, Xenopus 난 모세포 및 인공 리포좀을 포함하여 다양한 세포 유형에서 세포, 시냅스 및 회로 수준 (인 비트로 및 체내 모두) 에서 다양한 대상에 대한 연구에 적용되었습니다 2 . 이 과정은 관심 세포의 정확한 식별 및 표적화, 세포에 근접하여 패치 피펫을 이동시키는 복잡한 마이크로 매니퓰레이터 제어, 적당한 시간에 피펫에 양성 및 음성 압박을 가하여 꽉 조이는 gigaseal 패치를 확립하고, 전체 셀 패치 구성을 설정하기위한 침입 등이 있습니다. 패치 클램핑은 일반적으로 수동으로 수행되며 마스터하기 위해 광범위한 교육이 필요합니다. 패치를 경험 한 연구원이라 할지라도클램프, 성공률은 상대적으로 낮습니다. 보다 최근에는 패치 클램프 실험을 자동화하기위한 몇 가지 시도가있었습니다. 자동화를 달성하기 위해 두 가지 주요 전략이 개발되었습니다. 표준 패치 클램프 장비를 강화하여 패치 프로세스를 자동 제어하고 새로운 장비 및 기술을 처음부터 설계합니다. 이전 전략은 기존 하드웨어에 적용 할 수 있으며 생체 내 blind patch clamp 3 , 4 , 5 , 급성 뇌 절편의 in vitro patch clamp, organotypic slice culture 및 cultured dissociated neurons 6을 포함하여 다양한 패치 클램프 응용 프로그램에서 사용할 수 있습니다. . 그것은 다수의 미세 조작기 동시에 7을 사용하여 복잡한 로컬 회로 심문을 가능하게한다. 평면 패치 방법은 새로운 개발 전략의 한 예이며 동시에 높은 처리량을 달성 할 수 있습니다약물 스크리닝 목적으로 현탁액에있는 세포의 아치 클램프 8 . 그러나, 평면 패치 방법은 모든 세포 유형, 특히 긴 과정을 갖는 뉴런 또는 광범위한 연결을 포함하는 손상되지 않은 회로에 적용 가능하지 않다. 이는 기존의 패치 클램프 기술의 핵심 이점 인 신경계의 복잡한 회로를 매핑하는 데 그 적용을 제한합니다. 우리는 표준 패치 클램프 하드웨어를 보강함으로써 체외에서 수동 패치 클램프 프로세스를 자동화하는 시스템을 개발했습니다. 당사의 시스템 인 Autopatcher IG는 자동 피펫 보정, 형광 셀 타겟 식별, 피펫 이동 자동 제어, 자동 전체 셀 패칭 및 데이터 기록을 제공합니다. 이 시스템은 여러 깊이의 뇌 조각 이미지를 자동으로 수집 할 수 있습니다. 컴퓨터 비전을 사용하여 분석. 형광으로 표지 된 세포의 좌표를 포함한 정보를 추출합니다. 이 정보는관심 대상 세포를 표적화하고 자동으로 패치하는 데 사용됩니다. 이 소프트웨어는 여러 오픈 소스 라이브러리를 사용하여 무료 오픈 소스 프로그래밍 언어 인 Python으로 작성되었습니다. 이것은 다른 연구자들에게 접근성을 보장하고 전기 생리학 실험의 재현성과 엄격 성을 향상시킵니다. 이 시스템은 추가 하드웨어가 여기에 설명 된 현재 시스템과 쉽게 인터페이스 될 수 있도록 모듈 식 설계를 갖추고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CCD 카메라</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>전기 생리학 장비</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>현미경 및 매니퓰레이터를 포함합니다. 이 원고에 설명된 제조업체가 제공한 매니퓰레이터 제어 소프트웨어는 " Linlab2"입니다.</td></tr><tr><td>증폭기</td><td>분자 장치</td><td>MultiClamp 700B</td><td>컴퓨터 제어 미세 전극 증폭기</td></tr><tr><td>디지타이저</td><td>분자 장치</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>LED 광원</td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td><td>488nm 파장</td></tr><tr><td>데이터 수집 보드</td><td>측정 컴퓨팅</td><td>USB1208-FS</td><td>보조 DAQ. 설명서 참조 : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>솔레노이드 밸브</td><td>The Lee Co.</td><td></td><td></td>LHDA0531115H</tr><tr><td>에어 펌프</td><td>가상 산업</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>기압 센서</td><td>프리스케일 반도체</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>슬라이스 홀드 다운</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>슬라이스 앵커 키트, RC-40 챔버용 플랫, 2.0 mm, 19.7 mm</td></tr><tr><td>파이썬</td><td>아나콘다</td><td>버전 2.7 (윈도우용 32비트)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>나사 단자</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>나사 단자 3.5mm 피치(2핀)(</td></tr><tr><td>2핀)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-채널 MOSFET 60V 30A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>DIP 소켓 솔더 테일 - 8핀</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - 기본 빨간색 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - 기본 녹색 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC 배럴 전원 잭/커넥터 (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>벽 어댑터 전원 공급 장치 - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>훅업 와이어 - 구색 (솔리드 코어, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>잠금 남성 x 여성 x 여성 스톱콕</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 유연한 튜빙</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>외경: 1/8 인치 내경: 1/16 인치.</td></tr><tr><td>BNC 수-BNC 수 동축 케이블</td><td>Belkin 구성 요소</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 옴 저항기 (5% 허용 오차)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>일반 밸브</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

뇌 조각에서 뉴런 연구를위한 자동 이미지 유도 패치 클램프의 적용

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

전체 세포 패치 클램프는 단일 세포의 전기적 특성을 측정하는 금 표준 방법입니다. 그러나 체외 수정 패치 클램프는 복잡하고 사용자 조작 및 제어에 대한 높은 의존성으로 인해 도전적이고 낮은 처리량의 기술로 남아 있습니다. 이 원고는 급성 뇌 절편 에서 시험관 전체 세포 패치 클램프 실험을위한 이미지 가이드 자동 패치 클램프 시스템을 시연합니다. 우리 시스템은 형광 표식 된 세포를 검출하고 마이크로 조작기와 내부 피펫 압력 제어를 사용하여 완전 자동 패칭을 목표로 컴퓨터 시각 기반 알고리즘을 구현합니다. 전체 프로세스는 인간의 개입에 대한 최소한의 요구 사항만으로 고도로 자동화되어 있습니다. 전기 저항 및 내부 피펫 압력을 포함한 실시간 실험 정보는 향후 분석 및 다른 세포 유형의 최적화를 위해 전자적으로 문서화됩니다. 우리의 체계는 급성 brai의 문맥에서 기술 되더라도n 슬라이스 기록을 포함 해 분리 된 뉴런, organotypic slice culture 및 기타 비 연결 세포 유형의 자동화 된 이미지 유도 패치 클램프에도 적용 할 수 있습니다.

<html> 우리 시스템은 급성 뇌 조각, 뉴런으로 분화 된 마우스 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs) 및 관심의 대상 채널을 인위적으로 표현하는 HEK 293 세포에서 세포를 패치하는 능력에 대해 테스트되었습니다. 도 3 은 시각 피질에서 형광 표지 된 5 층 피라미드 뉴런을 표적으로하는 Thy1-ChR2-YFP 트랜스 제닉 마우스 (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J)를 사용한 실험을 나타낸다. 표적 세포는 자동으로 확인 된 녹색 형광성 양성 세포 중 하나였습니다 ( 그림 3b ). 그림 3a 는 패치 된 뉴런의 차동 간섭 대비 (DIC) 이미지입니다. 전체 셀 구성은 2.5 ~ 2.6 단계의 자동 패치 프로토콜을 통해 이루어졌으며 단계 전류 주입으로 유발 된 활동 전...

이 프로토콜은 표준 시험관 전기 생리학 장비를 위해 최근에 개발 된 시스템을 사용하여 자동 이미지 유도 패치 클램프 실험을 수행하는 방법을 설명합니다.

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

이 기술의 전반적인 목표는 컴퓨터 비전을 사용하여 형광 세포를 자동으로 검출하고, 급성 뇌 절편 내의 해당 세포들에 대해 자동 패치 클램프를 수행하는 것입니다. 이 방법은 형광 표지된 세포의 식별, 타겟팅 및 패치 클램프와 같이 패치 클램프 전기생리학 분야의 주요 어려움을 극복하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주된 장점은 패치 피펫과 형광 세포를 자동으로 검출하고, 이를 자동 패치 클램프 단계와 통합할 수 있다는 점입니다.이 혁신은 실험적 처리량을 상당히 증가시킵니다. 고처리량의 이미지 유도 자동 패치 클램프는 보다 생리적인 신경세포 표본의 약물 스크리닝에 사용될 수 있으므로, 이 기술의 영향은 신경계 질환의 치료나 진단으로까지 확장됩니다. 이 방법은 신경세포 소기관 전형이나 슬라이스 배양, 분리된 신경세포뿐만 아니라 모든 비신경세포와 같은 다른 인비트로(in vitro) 표본에도 적용될 수 있습니다.이 절차를 시작하려면 증폭기, 현미경 컨트롤러 및 매니퓰레이터 컨트롤러의 전원을 켭니다. 그런 다음, 명령줄 터미널에서 Autopatcher IG가 설치된 디렉토리로 이동한 후 python으로 Autopatcher IG를 실행합니다. 이어서 Python Autopatcher_IG를 입력합니다.명령줄 터미널에서 PYW를 입력하고 엔터 키를 누릅니다. 그 후, 유리 피펫을 내부 용액으로 완전히 채우고 헤드 스테이지에 장착합니다. 피펫 팁을 현미경 시야로 이동시켜 초점을 맞춥니다.다이얼 패드를 사용하여 현미경 스테이지의 매니퓰레이터를 이동시킨 경우, 키보드의 Z를 눌러 좌표를 업데이트하십시오. 1차 보정은 매니퓰레이터의 이동 각도와 거리를 현미경 좌표계로 변환합니다. 매니퓰레이터가 설정된 거리만큼 세 방향으로 이동하면, 소프트웨어가 현미경 시야 내에서 피펫 팁의 좌표를 감지합니다.피펫이 장착된 해당 유닛의 메인 GUI에서 보정 시작 버튼을 클릭하십시오. 그 후, 메인 GUI 하단의 보정 저장 버튼을 클릭하여 보정 내용을 저장하십시오. 이러한 기본 보정은 장비의 물리적 구성이 변경되지 않는 한 한 번만 수행하면 됩니다.이 단계에서는 뇌 절편 하나를 기록 챔버의 중앙에 배치합니다. 슬라이스 고정 장치(slice hold down) 또는 하프(harp)를 사용하여 뇌 절편을 안정화합니다. 형광 세포를 검출하기 위해 4배 배율에서 관심 영역을 찾습니다.그런 다음, 클릭 이동 모드를 켜고 관심 영역의 중심을 클릭하여 현미경 스테이지를 이동시킵니다. 또는 키패드를 사용하여 현미경 스테이지를 이동할 수도 있습니다. 다음으로, 고배율 렌즈로 교체하고 키패드의 RF를 사용하여 Z축 방향으로 현미경을 이동시켜 초점을 조절합니다.소프트웨어가 현미경과 카메라를 제어하여 서로 다른 깊이에서 일련의 이미지를 촬영합니다. 그런 다음, 컴퓨터 비전 프로세싱을 통해 이 이미지들에서 형광 표지된 세포를 찾습니다. 최종 결과물은 검출된 세포 좌표의 목록입니다.메인 GUI의 column unit zero에 있는 detect cell 버튼을 클릭하십시오. 셋업의 LED 또는 레이저 광원이 TTL 신호로 제어되지 않는 경우, LED 또는 레이저를 수동으로 켜십시오. 필요한 경우 LED 또는 레이저를 끄십시오.메모리 포지션 GUI에 세포 좌표 목록이 표시됩니다. 좌표 옆의 X 버튼을 클릭하여 원하지 않는 세포를 목록에서 제거하십시오. 또는, 대상 세포에 형광 표지가 되어 있지 않은 경우, 메인 GUI에서 마우스 모드를 클릭하십시오.그 다음, 관심 있는 세포를 클릭하면 세포 위에 숫자가 적힌 노란색 점이 나타나고, 메모리 위치 GUI에 해당 세포의 좌표가 표시됩니다. 피펫 오프셋 좌표를 검출하기 위해 2차 보정을 수행하려면, 유리 피펫의 1/3을 내부 용액으로 채웁니다. 그런 다음, 헤드 스테이지에 부착된 피펫 홀더에 피펫을 장착하십시오.저배율에서 키패드의 1번과 2번을 사용하여 1번 장치와 2번 장치 사이를 전환합니다. 그 다음, 피펫을 시야 내로 가져온 후 키패드를 사용하여 초점을 조정하십시오. 이어서, 'load calibration'을 클릭하여 1차 교정을 로드합니다.현미경 렌즈를 고배율로 전환하고 메인 GUI에서 40회를 클릭하십시오. 피펫 팁을 중앙으로 이동시킵니다. 그런 다음, 사용 중인 단위 아래의 메인 GUI에 있는 보조 교정 버튼을 클릭하십시오.대상 세포를 패치하려면 패치 제어 버튼을 클릭하여 패치 제어 GUI를 엽니다. 메모리 위치 GUI의 좌표 목록에서 관심 세포 옆에 있는 이동 버튼을 클릭하십시오. 그 후, 메인 GUI의 유닛에 있는 CTM 버튼을 클릭하여 이동을 활성화합니다.관심 있는 세포를 클릭하여 피펫 팁을 해당 세포로 이동시킵니다. 매니퓰레이터의 기계적 한계로 인해 500 micrometer 이상의 거리를 이동할 때 약간의 위치 오차가 발생할 수 있습니다. 큰 기계적 위치 오차를 방지하기 위해, 대상 세포 근처에서 2차 보정을 수행해야 합니다.다음으로, 유닛 선택 버튼을 사용하여 두 유닛 간의 입력 신호를 전환합니다. 패치 컨트롤 GUI의 패치 버튼을 클릭하십시오. 자동 패칭이 시작되며, 패치 컨트롤 GUI에서 압력과 저항을 모니터링할 수 있습니다.자동 패칭 알고리즘은 일련의 로직 루프를 통해 저항을 모니터링하고 압력을 제어하여 기가실(gigaseal)을 형성합니다. 팝업 창을 통해 기가실 형성이 알림으로 표시됩니다. 시스템은 저항 변화를 이용하여 세포 표면과의 접촉을 인식합니다.세포 표면 접촉이 적시에 감지되지 않는 경우, 다음 버튼을 사용하여 동일한 자동 패칭 시도 내에서 패칭 단계를 진행하십시오. 패치 제어 GUI의 해당 버튼을 클릭하여 어느 시점에서나 자동 프로세스를 조작할 수 있습니다. 그런 다음, '예'를 선택하여 Zap과 흡입을 결합해 개입하십시오.또는, 흡입으로만 진입(break-in)하려면 '아니오'를 선택하십시오. 그런 다음, 실험 패치 로그를 저장하십시오. 이 그림은 명령 시퀀스 GUI에 로드된 선택된 위치들을 보여줍니다.왼쪽 열은 좌표 목록을 보여주며, 오른쪽 열은 각 위치에 대한 TTL 신호 형태의 명령 목록을 보여줍니다. 다음은 선택된 세 위치에 해당하는 약물 투여 실험 중의 스크린샷입니다. 시각화를 위해 KCL 용액을 적색 형광 염료와 혼합하였습니다.단위 1은 KCl 함유 피펫이었으며 단위 2는 패칭 피펫이었습니다. 이 그림에서 단계적 전류 주입은 규칙적인 스파이킹 뉴런을 보여줍니다. 여기에는 세 곳에 500 mM 염화칼륨 용액을 국소적으로 처리했을 때의 전압 클램프 기록 트레이스가 나와 있습니다.내향 전류가 나타난 빨간색 트레이스는 염화칼륨 적용 위치가 패치 세포와 가까웠을 때의 실험 결과입니다. 빨간색 화살표는 염화칼륨을 적용한 시점을 나타냅니다. 이 방법을 사용하면 수동 패칭에 비해 광범위한 훈련 없이도 4분 이내에 패치 클램프 실험을 수행할 수 있습니다.이 절차를 수행한 후, 연구 프로젝트와 관련된 질문에 답하기 위해 광유전학, 화학유전학 및 약물학적 조작과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술이 개발됨에 따라, 신경과학 분야의 연구자들이 다양한 인비트로(in vitro) 표본에서 시냅스 수용체와 이온 채널에 대한 고효율 연구를 탐색할 수 있는 길이 열릴 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 이미지 유도 자동 패치 클램프 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 수지상 멤브레인 표면에서 패치 클램프 기록 기술을 보여줍니다. 이는 도파민 뉴런에서 수상돌기와 그 아래에 있는 전위의존성 이온 채널의 전기적 특성을 직접 조사하는 데 도움이 됩니다.

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

이 비디오는 뇌 절편 근처에 가는 뾰족한 피펫을 배치하여 신경 세포와 밀봉을 형성하는 방법을 보여줍니다. 흡입은 세포막을 파괴하여 전기생리학 실험을 위한 전류 측정을 가능하게 하는 전체 세포 패치 클램프를 생성합니다.

Brain Slices의 전기생리학적 기록을 위한 전체 셀 전압 클램프 구성 설정

이 비디오는 뉴런 특이적 형광 단백질을 포함하는 형질전환 뇌 절편에서 전기 활동을 동시에 이미징하고 기록하는 방법을 설명합니다. 이 절차에는 폭기된 인공 뇌척수액이 있는 관류 챔버에서 뇌 절편을 유지하고, 광원을 사용하여 형광 표지된 세포를 여기시키고, 다중 채널 프로브 및 패치 클램프로 전기 신호를 기록하는 것이 포함됩니다.

뇌 절편에 있는 신경 세포의 동시 광학 및 전기 생리학적 모니터링

이 비디오에서는 뇌 절편을 기록실에 고정시키고 관심 세포를 찾아 컴퓨터 제어 현미경을 사용하여 집중시킵니다. 그런 다음 자동 이미지 처리 시스템은 패치 피펫을 정밀하게 배치하여 세포막을 밀봉하고 전기 신호를 모니터링합니다.

뇌 절편의 뉴런 연구를 위한 자동화된 이미지 유도 패치 클램프 기법

이 비디오는 뇌 절편을 고정하고, 전체 세포 구성을 달성하기 위해 피펫을 배치하고, 시냅스후 반응을 기록하도록 시냅스전 뉴런을 자극하여 뉴런 연결을 매핑하는 절차를 보여줍니다.

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices(급성 뇌 절편에서 뉴런 연결의 쌍을 이룬 패치 클램프 기록)

이 논문에서, 우리는 심하게 절연 뇌 조각의 뉴런에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 연구 할 수있는 유용한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 패치 클램프 기술을 사용하여 기록 뉴런에 약물의 로컬 응용 프로그램에 대한 약물 채워진 micropipette의 사용을 포함한다.

마우스 뇌 슬라이스의 Nicotinic 아 세티 콜린 수용체 기능을 공부하는 약물의 로컬 응용 프로그램

급성 뇌 절편에서 시냅스로 결합된 뉴런의 패치 클램프 기록 및 동시 세포 내 바이오사이틴 충전을 통해 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 뉴런 미세 회로에서 전기생리학적 기록의 필수 기술 단계와 후속 형태학적 분석을 설명하는 것입니다.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

조각 패치 클램프 기술 기본 속성 및 흥분 성의 또는 억제 시 냅 스의가 소성 학습 유도 된 변화를 분석 하기 위한 효과적인 방법입니다.

조각 패치 클램프 기술 학습 유도 소성을 분석 하기 위한

생체 외 뇌 조각은 구 심성 입력에 대한 유발 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 광유전학은 시상피질 및 피질 피질 구심성을 비원발성 신피질에 독립적으로 활성화하는 데 사용되며 시냅스 및 네트워크 반응은 이소플루란으로 조절됩니다.

뇌 조각에서 구 심성 경로의 광유전 적 활성화 및 휘발성 마취제에 의한 반응의 조절

학습하세요 급성 뇌 조각에서 형광 세포를 자동으로 검출하고 패치 클램프를 수행하는 방법을. 컴퓨터 비전 기술을 활용하여 전기생리학 실험의 효율성을 높이고 신경계 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

뇌 조각에서 뉴런 연구를위한 자동 이미지 유도 패치 클램프의 적용

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