Name: Saccharomyces cerevisiae 호흡과 발효 대사 분석을 배치 문화 지 수 성장 속도 론 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 학습하세요 Saccharomyces cerevisiae의 호흡 및 발효 대사를 배치 문화 지수 성장 속도론으로 분석하는 방법을. 고처리량 스크리닝을 통해 다양한 물질이 효모 대사에 미치는 영향을 효율적으로 평가할 수 있습니다.

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이 프로젝트를 지원 하 여 부여 Consejo 나시오날 드 많은 y 과학 (보조금 번호 293940)와 Fundación TELMEX TELCEL (보조금 번호 162005585)의 IKOM를 둘 다.

1. 문화 미디어와 Inoculum 준비
<ol><li>준비 2% 효 모 추출-펩-포도 당 (YPD) 액체 매체의 100 mL (1 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 2 세대 및 2 세대 포도의 100 ml의 증류수를 추가). 15 mL 원뿔 튜브를 sterilizable으로 미디어의 3 mL을 분배. 고압 121 ° C와 1.5 psi에서 15 분에 대 한 미디어. 참고: 미디어는 4-8 ° c.에 최대 한 달 동안 저장 될 수 있다</li>
	<li>가득-20 ° c.에 글리세롤에 보존 하는 S. cerevisiae 세포의 250 μ와 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 3 mL 원뿔 튜브를 예방 200 rpm 동요와 30 ° C에서 궤도 통에서 밤새 품 어.</li>
	<li>페 트리 접시 (60 x 15 m m2) 살 균 2% YPD agar 가득 행진 (10 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 20 g 포도 당의 20 g 그리고 증류수 1000 ml의 세균 agar의 20 g 추가) 메 마른 루프를 사용 하 여 원뿔 튜브에 성장 하는 세포. 고립 된 식민지 성장을 표시 될 때까지 30 ° C에서 배양 접시를 품 어.</li>
	<li>하나의 고립 된 식민지 가득한 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 10 mL 원뿔 튜브에 접종 하 여 사전 inoculum을 준비 하 고 200 rpm에서 지속적인 동요와 30 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol>2. 문화 미디어와 Microplate에 성장 곡선
<ol><li>1 %YPD 국물의 10 mL를 준비 (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g과 포도의 10 ml의 0.1 g에 증류수를 추가), 2 %YPD 국물의 10 mL (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g 그리고 증류수 10 mL에 포도의 0.2 g 추가) 그리고 10 %YPD 국물의 10 mL (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g을 증류수 10 mL에 포도의 1 g 추가). 압력솥이 성장 매체 1.5 psi 121 ° C에서 15 분. 참고: 문화 미디어 일 성장의 컨트롤 역할을 합니다.</li>
	<li>2% 효 모 추출 물 펩 에탄올 (형식) 국물의 10 mL와 10 mL 2% 효 모 추출 물 펩 글리세롤 (YPG) 국물을 준비 합니다. 2%에 대 한 형식: 0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g을 증류수 10 mL에 에탄올의 0.2 mL를 추가. 2 %YPG: 0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g 그리고 증류수 10 mL에 글리세롤의 0.2 mL를 추가. 압력솥이 성장 매체 1.5 psi 121 ° C에서 15 분. 참고: 글리세롤과 에탄올은 독점적으로 미토 콘 드리 아 호흡에 의해 물질 대사로 변화 비 fermentable 탄소 소스. 이러한 이유로, 호흡기 성장 컨트롤로 사용 됩니다. 이 단계에서 효 모 추출 물 펩 (YP) 국물 (10 g의 효 모 추출 물 및 증류수 1000 mL에 카 세 인 펩의 20 g)를 기본으로 하 여 성장 표현 형에 영향을 테스트 유형과 문화 미디어에서 탄소 소스의 농도 변경할 수 있습니다. 탄소 이외의 다른 영양소의 효과 테스트 하려면 합성 완료 (SC) 매체 실험의 목표에 따라 보충 된다. 사우스 캐롤라이나 매체에 대 한 자료는 아미노산, 황산 암모늄 5 g 없이 기본 효 질소의 1.8 g [(NH4)2등4], 1.4 g의 글루타민 인산 염 (NaH2포4), 드롭 아웃의 2 세대 1000 mL의 증류수에 혼합. 탄소 소스와 필요한 농도에서 추가 질소 소스 미디어를 보충.</li>
	<li>실험 설계에 대 한 적합 한 문화 미디어의 145 μ 뚜껑 살 균 미 판 (10 x 10-잘)의 각 음을 추가 하 고 사전 inoculum의 5 μ와 예방. 참고: 지금까지 목표는 화면에 누 룩의 에너지 대사 물질/화합물의 영향, 경우에 그 물질/화합물이이 단계 동안 추가 되어야 합니다. 또한, 모든 유형의 뚜껑 microplate 유용 해야 한다.</li>
	<li>다 잘 접시 200 rpm에서 48 h. 측정 600에서 광학 밀도 (OD)에 대 한 지속적인 동요와 30 ° C에서 microplate 리더에 품 어 nm 매 30 또는 60 분. 참고: microplate 리더에는 미 판 품 어 하는 옵션이 없는 경우 그것은 수 있습니다 알을 품는 OD의 모든 측정 사이 동일한 조건에서 궤도 통에.</li>
</ol>3. 성장 곡선 소동된 원뿔 플라스 크에
<ol><li>20 mL 원뿔 플라스 크 및 고압에 적합 한 문화 미디어의 4.8 mL를 추가 합니다. OD600nm ~ 2 쿨, 무 균 2 %YPD 국물에서에서 사전 inoculum 문화 200 μ와 각 플라스 크 예방 24 h에 대 한 250 rpm에서 일정 한 동요와 30 ° C에서 그들을 품 어. 참고: 잠복기 24 h 보다 높은 경우에, 50 mL 원뿔형 플라스 크 및 고압에 적합 한 문화 미디어의 12 mL를 추가 합니다. 그들의 사전 inoculum 500 μ와 예방. 그것은 또한 일 성장 컨트롤 (YP 미디어 1%, 2% 또는 10% 포도 당) 및 호흡기 성장 컨트롤 (YP 미디어 2% 글리세롤 또는 에탄올)을 고려 하는 것이 중요.</li>
	<li>흔들린된 원뿔 플라스 크 문화 100 μ 걸릴 하 고 900 μ 1 mL 분 광 광도 계 베트에 증류수에 희석 pipetting으로 부드럽게 혼합. 600에서 OD를 측정 nm 마다 2 h 분 광 광도 계를 사용 하 여. 진짜 세를, 10에 의해 결과 곱하면 됩니다.</li>
</ol>4. 데이터 처리 및 운동 매개 변수 계산
<ol><li>
통계 패키지 소프트웨어에서 새 프로젝트 파일을 만듭니다. "새 테이블및 그래프" 섹션에서 "XY" 옵션을 선택 합니다.
	<ol>
<li>옵션 선택: "예제 데이터" 섹션에서 "빈 데이터 테이블로 시작" .</li>
		<li>"포인트 및 연결선" 그래프 유형을 선택 합니다. "X" 섹션 "복제 또는 오류 값에 대 한 Subcolumns"의 세그먼트에서 선택 하지 않은 상태로 두고 "Y" 섹션 옵션을 선택: "나란히 subcolumns에서 (10) 복제 값을 입력 하 고 작의 의미 및 오류 SD". 만들기를 클릭 합니다. 참고: 테이블 형식 X 열 및 여러 Y 열, 각각 이전 선택 10 subcolumns 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>쓰기는 OD에 측정 X 열에서 찍은 시간 (예를 들어, 0, 30, 60, 90 분 또는 0, 1, 1.5, 2 h). Y 열에서 문화에서 가져온 OD 값을 작성 합니다.</li>
	<li>로그 Y 열 데이터를 변환 하는 지 수 성장 단계를 식별 합니다. "분석" 버튼을 클릭, 선택 "변환" 분석, Y를 사용 하 여 Y 값 선택 = Log(Y). "결과의 갤러리", 선택 "변환" 데이터 테이블 "분석" 버튼을 클릭 하 고 "선형 회귀" 분석을 선택 이동 합니다. 선형 동작을 따르지 않는 OD 값을 제외 합니다. 값을 제외 하려면 데이터 테이블에 그들을 선택 하 고 "Ctrl + E"를입력 합니다. 참고: 그것은 이후 지 수 성장 방정식 잘 지 수 단계에 맞는 지 수 단계를 수행 하지 값을 제외 하는 것이 중요.</li>
	<li>"데이터 테이블 갤러리"데이터 테이블 선택 "데이터 1". "분석" 버튼을 클릭 하 고 "XY 분석" 가운데 "비선형 회귀 (곡선 적합도)" 분석을 선택 합니다.</li>
	<li>분석 하 고 "확인" 버튼을 클릭 하 여 데이터 집합을 선택 합니다. "맞춤" 탭에서 "지 수 방정식" 섹션을 선택 하 고 선택 "지 수 성장 방정식" ( X 는 세포 농도, X0 는 0에, μ 셀 농도 특정 성장 속도 이며 t 는 시간). 피팅 방법으로 "최소 제곱 적합" 사용 하 고 보간 섹션 선택 되지 않은 둡니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다. 참고: 비선형 맞는 결과 탭 "결과의 갤러리"입니다. 소프트웨어 두 배로 시간 (Dt)와 특정 계산 성장 율 (μ). 소프트웨어는 결과 탭에 K 로 μ 를 표시합니다.</li>
	<li>새 프로젝트 파일을 열고 "새 테이블 및 그래프" 섹션에서 열 선택을 선택 합니다. "빈 데이터 테이블로 시작" 옵션을 선택 하 고 원하는 그래프를 선택 합니다. Sd. "만들기" 버튼을 선택와 의미를 선택 합니다.</li>
	<li>"결과의 갤러리" 에 있는 비선형 맞는 결과 탭에서 μ 또는 Dt 값을 복사 하는 열에 붙여 넣을. 마지막으로, "분석" 버튼을 선택 하 고 다른 nutrimental 조건의 운동 매개 변수를 비교 하는 "열 분석" 섹션에 원하는 분석을 선택 합니다. 참고: 운동 매개 변수 일 성장 컨트롤 (YP 미디어 1%, 2% 또는 10% 포도 당)에서 얻은 고 호흡기 성장 컨트롤 (YP 미디어 2% 글리세롤 또는 에탄올) 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡의 임계값을 설정 하는 데 도움이 각각. 비교는 운동 영양 상태와 물질/화합물 호흡과 발효 성장 분석에서 매개 변수는 호흡 또는 발효 대사에 가능한 영향을 식별할.</li>
</ol>

<ol><li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li>
<li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li>
<li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect%3F+A+review+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li>
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<li>Keating, E., Martel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetabolic+Effects+of+Polyphenols+in+Breast+Cancer+Cells%3A+Focus+on+Glucose+Uptake+and+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 25(2018).</li>
<li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17(2014).</li>
<li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li>
<li>Monod, J. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.mi.03.100149.002103">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li>
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<li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800(2014).</li>
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<li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li>
<li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+growth+curves%3A+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

오랜 시간 이후 J. Monod10 표현 세균성 문화의 성장 연구 미생물학의 기본 메서드는 통과 했다. 분자의 출현 지연 사용 및 연구 기법으로 성장 합니다. 수많은 상호 프로세스를 포함 하는 성장의 복잡성에도 불구 하 고 그것의 근본적인 메커니즘 수학적 모델11을 사용 하 여 설명할 수 있습니다. 이것은 가장 복잡 한 분자 메커니즘12명료 하 상호 보완적인 도구로 사용할 수 있는 강력한 접근입니다.
이 방법에서 신뢰할 수 있는 결과 얻으려면, 그것은 다음 중요 한 단계를 고려 하는 것이 중요입니다. 250 rpm 동요 호흡기 성장, 교 반 속도 (150-180 rpm) 우리가 관찰 호흡기 조건에서 성장 감소 낮은 사용 하는 경우 때문에 발휘 하는 낮은 탄소 소스에서 좋은 성장을 달성 하는 데 매우 중요 하다. 신선한 소재를 사용 하는 프로토콜을 시작 ...

Saccharomyces cerevisiae 성장 수십 생리 및 분자 메커니즘을 식별 하는 유용한 도구를 역임 했다. 성장 주로 세 가지 방법에 의해 측정 된다: 자리 테스트, 콜로 니 형성 단위, 및 성장 곡선에 대 한 직렬 희석. 이러한 기술은 특정 응답 또는 고기를 조사 하거나 기질, 환경 조건, 돌연변이, 그리고 화학 물질의 다양 한와 함께 사용할 수 있습니다.
미토 콘 드리 아 호흡 있는 성장 속도 론 성공적으로 적용 된 알 수 없는 메커니즘을 발견에 대 한 생물 학적 과정 이다. 이 경우에, 비 fermentable 탄소와 성장 매체의 보충 소스 글리세롤, 젖 산, 에탄올 (미토 콘 드리 아 호흡에 의해 대사만), 등 평가 대 한 수 있습니다 유일한 탄소 및 에너지 소스는 호흡기 성장, 산화 인 산화 활동1에 물결을 감지 하는 것이 중요 하다는. 다른 한편으로, 그것은 발효 뒤에 메커니즘을 파악 하기 위한 방법으로 성장 운동 모델을 사용 하 여 복잡 하다입니다.
발효와 미토 콘 드리 아 호흡의 연구 크랩 트리 및 바르 부르 크 효과2,3같은 특정 고기 뒤에 분자 메커니즘을 명료 하 게 필수적 이다. 크랩 트리 효과 glycolytic 플럭스의 증가, 미토 콘 드리 아 호흡의 억압과 fermentable 탄수화물의 높은 농도의 ATP를 생성 하는 기본 통로로 발효의 설립에 의해 특징입니다 (> 0.8 m m)4,5. 바르 부르 크 효과 되는 포유류 세포에 발효의 주요 제품 젖6metabolically 크랩 트리 효과 차이와 아날로그. 실제로, 바르 부르 크 효과 다양 한 트리거링 포도 당 통풍 관 및 산소7존재도 소비 하는 암 세포에 의해 전시 된다. 따라서, 크랩 트리 효과에 발효 호흡에서 스위치의 분자 기초 공부에 (에탄올 생산)에 대 한 바이오 영향 및 잠재적인 영향 암 연구 합니다.
S. cerevisiae 성장 크랩 트리 및 바르 부르 크 효과 공부 하는 적합 한 도구 있을 수 있습니다. 이 아이디어는 효 모 지 수 단계에서 ATP를 생산 하는 데 사용 하는 중앙 통로 미토 콘 드리 아 호흡과 발효, 성장을 유지 하기 위해 필수적인 사실에 기반. 예를 들어, S. cerevisiae 의 성장 ATP 생성 통로의 기능을 밀접 하 게 관련 되어 있습니다. 포도 당 분자 당 S. cerevisiae, 미토 콘 드리 아 호흡 생산 약 18 ATP 분자, 발효만 2 ATP 분자를 생성 하는 반면 따라서 그것 전망 이다 성장 율 변화 통로와 꽉 링크는 ATP8생산. 이와 관련, 발효 ATP를 생성 하는 주요 경로 이면 누 룩 낮은 ATP 생산 함으로써 보완 포도 당 통풍 관의 속도 증가 합니다. 그와 반대로, 미토 콘 드리 아 호흡 주요 ATP 소스로 사용 하는 효 모 세포에 의해 포도 당 소비는 낮다. 이 ATP 생성 되는 방법을 결정 하기 전에 이해 탄수화물을 효 모에 대 한 중요 한는 것을 나타냅니다. 포도 당 가용성 발효와 미토 콘 드리 아 호흡에서의 전환에 중요 한 역할을 담당 하는 따라서, S. cerevisiae. 높은 양의 포도 당의 누 룩 발효를 ATP를 생성 하는 중앙 노선으로 좋아한다. 흥미롭게도, 누 룩을 발효 하면 특정 성장 율 최대 유지 됩니다. 다른 한편으로, 포도의 낮은 수준에서 S. cerevisiae 생성 ATP 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여 낮은 성장 율을 유지 합니다. 따라서, 포도 당 및 다른 탄소 원의 사용의 농도에 변화 일 및 호흡기 성장 사이 누 룩의 기본 설정에서 변경 유도. 이 사실을 지 수 성장 방정식을 고려 하 여 한 시간 (Dt)와 특정 성장 율 (μ)를 배로 운동 매개의 생물학적 의미를 얻을 수 있습니다. 예를 들어 μ 값 효 모 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여 기본 경로로 발견 되었다. 그와 반대로, 발효를 선호 하는 조건 하에서 높은 μ 값이 발견 되었다. 이 방법론 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡에 영향을 미치는 화학 물질의 가능한 메커니즘을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 S. cerevisiae.
이 문서의 목적은 심사 미토 콘 드리 아 호흡 또는 발효에 주어진된 물질/화합물의 효과 대 한 성장 속도에 따라 방법 제안.

<table><tbody><tr><td>오비탈 쉐이커</td><td>Thermo Scientific</td><td>4353</td><td>접종 배양 또는 원뿔형 파스크 배양용</td></tr><tr><td>Bioscreen&nbsp;</td><td>성장 곡선</td><td>C MBR</td><td>마이크로플레이트의 배치 배양용</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마&nbsp;</td><td>G7021</td><td>YPD 육수 준비용</td></tr><tr><td>카제인에서 추출한 펩톤, 효소 분해</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>82303</td><td>YPD 육수 제제</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>09182-1KG-F</td><td>YPD 국물 준비</td></tr><tr><td>세균학 한천</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A5306</td><td>YPD 한천 준비용</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S8282</td><td>SC 육수 준비</td></tr><tr><td>용(NH4)2SO4</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A4418</td><td>SC 육수 준비용</td></tr><tr><td>아미노산과 황산암모늄이 없는 효모 질소 기반</td><td>시그마&nbsp;</td><td>Y1251</td><td>SC 육수 준비용</td></tr><tr><td>효모 합성 드롭아웃 매체 보충제</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Y1501</td><td>SC 육수 제제용</td></tr><tr><td>황산 암모늄 과립</td><td>J.T. Baker</td><td>0792-R</td><td>중간 보충제 예</td></tr><tr><td>Resveratrol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>R5010</td><td>중간 보충제 예:</td></tr><tr><td>갈락토오스</td><td>시그마&nbsp;</td><td>G8270</td><td>중간 영양 보충 예:</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마&nbsp;</td><td>S7903</td><td>배지 보충제의 경우</td></tr><tr><td>Absolut ethanol</td><td>Merck</td><td>107017</td><td>배지 보충제의 경우</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>J.T. Baker</td><td>2136-01</td><td>배지 보충제의 경우</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td></td><td>데이터 분석용</td></tr><tr><td>Honeycomb 마이크로플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502550</td><td>마이크로플레이트 배양용</td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae 호흡과 발효 대사 분석을 배치 문화 지 수 성장 속도 론

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

지 수 단계에 saccharomyces cerevisiae 세포 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 ATP를 생산 하 여 그들의 성장 유지. Fermentable 탄소 농도 주로 효 모 세포에서 ATP;를 생성 하는 방법을 제어합니다 따라서, fermentable 탄수화물 수준에 변화 S. cerevisiae의 에너지 대사를 드라이브. 이 신문은 추정의 농도 변경 효과 호흡과 발효 대사에 탄소 소스의 자연 지 수 효 모 성장에 따라 높은 처리량 방법을 설명 합니다. S. cerevisiae 의 성장 한 microplate에 측정 또는 원뿔 동요 600에서 광학 밀도 (OD)를 결정 하 여 플라스 크 nm. 그런 다음, 성장 곡선 그리기 세 시간, 식별 및 지 수 위상의 선택을 허용 하 고 운동 매개 변수를 지 수 성장 방정식은 장착 대에 의해 만들어집니다. 높은 두 배로 시간 낮은 특정 성장 속도 일반적으로 호흡기 성장을 나타냅니다. 반대로, 낮은 배로 시간 높은 특정 성장 율 일 성장을 나타냅니다. 임계값의 시간과 특정 성장 율을 두 배로 잘 알려진 호흡 또는 발효 조건, 비-fermentable 탄소 소스 등 fermentable 설탕의 높은 농도 사용 하 여 견적 된다. 이 각 특정 스트레인에 대 한 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 계산 된 운동 매개 변수 효 모 발효 및/또는 호흡기 성장을 보여줍니다 여부 설정 임계값 값으로 비교 됩니다. 이 방법의 장점은 일 또는 호흡 대사에는 물질 또는 화합물의 효과 이해 하기 위한 상대적 단순입니다. 성장 한 복잡 하 고 복잡 한 생물 학적 과정; 강조 하는 것이 중요 하다 따라서,이 방법에서 예비 데이터 산소 소비량의 정량화와 발효 부산물의 축적에 의해 뒷받침 해야 합니다. 따라서,이 기술은 화합물/방해 하거나 발효 또는 호흡기 신진 대사를 향상 시킬 수 있는 물질의 예비 심사로 사용할 수 있습니다.

성장 곡선 예비 호흡과 발효 효 모 S. cerevisiae 에서 고기를 구분을 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리 일 성장을 유도에 보고 된 다른 포도 당 농도 배치 문화 S. cerevisiae (BY4742)의 수행: 1%, 2% 및 10% (w/v)9. 문화 일 형을 보여주는 작은 지연 위상 있고 높은 성장 율 (그림 1)와 지 수 단계. 에탄올, 글리세롤, 및 젖 산 염은 호흡; 통해서만 metabolized 수 탄소 소스 따라서, 우리는 그 탄소 소스를 사용 하 여 효 문화를 수행. 주로 산화 인 산화에 의해 에너지를 얻는 문화 더 긴 래그 단계 및 성장 단계에서 지 수 (그림 2)의 느린 속도 보였다.
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여기 선물이 지 수 성장 방정식에 Saccharomyces cerevisiae 의 지 수 성장 피팅 하 여 호흡과 발효 대사를 추정 하는 프로토콜. 운동 매개 변수 계산 발효 또는 미토 콘 드리 아 호흡 물질/화합물의 영향의 심사에 대 한 수 있습니다.

Saccharomyces cerevisiae 호흡과 발효 대사 분석을 배치 문화 지 수 성장 속도 론

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

이 방법은 워버그와 크랩트리 효과의 분자 기초가 무엇인지와 같은 생명 공학 및 생물 의학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 호흡기 및 발효 대사에서 특정 물질의 효과에 대한 높은 처리량 연구를 허용한다는 것입니다. 먼저 시원하고 멸균 된 2 % 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 또는 YPD 국물의 3 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원뿔 관을 접종하여 시작하며, S.cerevisiae 효모 세포의 250 마이크로 리터가 음의 섭씨 20도에서 글리세롤에 보존됩니다.섭씨 30도, 200rpm의 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 효모를 배양합니다. 다음날 아침, 60밀리리터, 2%YPD 의 한마가 가득한 페트리 요리에 줄지어 서 있습니다. 고립된 식민지가 관찰될 때까지 요리는 섭씨 30도에서 문화합니다.그런 다음 10 밀리리터의 시원한 멸균 2 %YPD 국물을 포함하는 새로운 원추형 튜브에서 하나의 고립 된 식민지를 접종하여 섭씨 30도에서 흔들림으로 밤새 문화를 제공합니다. 마이크로 플레이트 성장 곡선 설정의 경우, 145 마이크로리터의 적절한 실험 문화 매체를 각 웰에 뚜껑이 있는 멸균 10-10 웰 마이크로 플레이트에 추가하고 하룻밤 문화의 5 마이크로리터로 각각 잘 접종합니다. 그런 다음 마이크로 플레이트 판독기에서 섭씨 30도에서 48시간 동안 200rpm에서 일정한 교반을 하여 30 또는 60분마다 600 나노미터의 광학 밀도를 측정합니다.흔들리는 원추형 플라스크 성장 곡선 설정의 경우, 30섭씨와 250rpm에서 배양을 위한 600나노미터 광학 밀도에서 200나노미터의 사전 접종 배양 배지가 있는 적절한 멸균 배양 배지의 4.8 밀리리터를 함유한 20밀리리터 원추형 플라스크를 접종한다. 분당 250개의 회전에서 의 동요는 우리가 낮은 동요 속도로 호흡 조건에서 감소효모 성장을 관찰했기 때문에 호흡 성장을 발휘하는 탄소 원의 저농도에 있는 적당한 성장을 달성하는 것이 중요합니다. 24시간 동안 2시간마다 600 나노미터의 광학 밀도를 측정할 수 있도록 1밀리리터 분광광미터 큐벳에 증류수 900 마이크로리터로 흔들리는 원뿔 플라스크 배양의 100마이크로리터를 희석하고 파이펫으로 부드럽게 혼합합니다.데이터 처리의 경우 적절한 통계 패키지 소프트웨어에서 새 프로젝트 파일을 만들고 새 테이블 및 그래프 메뉴를 열고 XY를 선택합니다. 샘플 데이터 메뉴에서 빈 데이터 테이블과 점 및 연결 선 그래프로 시작합니다. 복제 또는 오류 값에 대해 하위 열에 X 섹션을 선택 해제하지 않은 상태로 둡니다. Y 섹션에서는 나란히 서브열에 복제 값 10을 입력하고 평균 및 오류 SD를 플롯합니다. 그런 다음 만들기를 클릭합니다.X 컬럼에서 OD 측정값을 얻은 시간과 Y 열의 배양에서 얻은 OD 값을 입력합니다. Y 열 데이터를 로지반스MS로 변환하는 기하급수적 성장 단계를 식별하려면 변환 분석을 클릭하고 선택합니다. Y를 사용하여 로그 Y를 사용하여 Y 값을 선택하고 결과 갤러리를 엽니다.변환 데이터 테이블을 선택하고, 분석하고, 선형 회귀 분석을 선택하고, 테이블의 값을 선택하고 컨트롤을 누르고 데이터 테이블 갤러리를 E.In 선형 추세를 따르지 않는 광학 밀도 값을 제외하고, 데이터 테이블 한 테이블을 선택하고 분석을 클릭합니다. 비선형 회귀 곡선 적합 분석 및 데이터 세트를 선택하여 분석하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 데이터에 맞는 사각형을 최소한 으로 적용하여 보간 섹션을 선택해제한 다음 확인을 클릭합니다. 다음으로 새 프로젝트 파일을 열고 새 테이블 및 그래프 메뉴에서 열 선택을 선택하고 빈 데이터 테이블및 원하는 그래프로 시작합니다. 표준 편차로 평균을 플롯하도록 그래프를 설정하고 만들기를 클릭합니다.결과의 갤러리에 비선형 적합 결과 테이블에서 평균 또는 델타 시간 값을 복사하고 데이터를 열에 붙여 넣습니다. 마지막으로 열 분석 메뉴에 대한 관심 분석을 분석하고 선택하여 다양한 영양 조건의 운동 매개 변수를 비교합니다. 성장 운동 임계값은 강점마다 다르며 분석에 사용하는 조건에 따라 평가되어야 합니다.발효 표현형을 보여주는 배양은 작은 지연 단계와 높은 성장률을 갖는 기하급수적 단계를 가지고 있습니다. 산화 인산화에 의해 주로 에너지를 얻는 배양은 지수 단계 동안 성장속도가 느린 더긴 지연 단계를 나타낸다. 기하급수적 성장 방정식을 사용하여 성장 곡선의 특정 성장 속도 및 두 배의 시간을 계산하면 호흡기 및 발효 성장 값에 대한 임계값을 설정할 수 있습니다.예를 들어, 이러한 대표적인 실험에서, S.cerevisiae BY4742 세포에 대한 상이한 레스베라트롤 농도의 효과는 다양한 포도당 농도에 반응하여 세포 정력 상태의 변형을 드러낸다. 여기서, 10%의 포도당을 함유한 보충제는 이러한 배양에서 기하급수적인 성장 단계에 의해 입증된 바와 같이 암모늄의 낮은 농도가 발효 대사를 선호하는 반면, 높은 농도는 증가지연 단계와 기하수단계 동안 느린 성장속도에 의해 입증된 바와 같이 호흡발효대사를 유도한다. 마지막으로, 발효 이중 시간 값의 강력한 차이는 동일한 조건에서 자라는 이 두 가지 다른 효모 균주 사이에서 관찰될 수 있으며, 분석된 각 균주에 대해 두 배시간 임계값을 검증할 필요성을 강조한다.이 절차를 시도하는 동안이 프로토콜은 표현형을 선별하는 데만 사용된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 호흡 및 발효에 대한 구체적인 영향은 산소 소비 측정또는 발효 부산물의 축적에 의해 각각 확인되어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

효모의 연대순의 노화는 고정 단계에서 시간과 관련된 세포 생존 능력의 상실을 말합니다. 여기 양적 효모 연대기 수명을 결정하는 높은 처리량 방법을 설명합니다.

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

여기 노화 동안 규제 또는 게놈 DNA의 불안정성에 기여하는 유전자 / 경로를 연구하기 위해 효모 연대기 수명 모델과 결합 수의 DNA 돌연변이의 assays 집합을 설명합니다.

를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

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형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

특정의 mRNA의 정상 수준은 mRNA의 합성과 부패의 속도에 의해 결정된다. 전체 게놈 mRNA의 분해율 또는 특정의 mRNA 붕괴 속도는 mRNA의 반감기를 측정함으로써 측정 할 수있다. 이 프로토콜은 사카로 미세스 세 레비 시아에서 mRNA의 붕괴 속도의 측정에 초점을 맞추고있다.

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

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이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 Saccharomyces eubayanus 의 전사 활성을 측정하여 포도당에서 맥아당으로의 전이를 모니터링함으로써 대사 적응의 실시간 분석을 가능하게 하고 다양한 조건에서 산업 발효를 위한 균주 최적화를 지원합니다.

생체 내 Monitoring of transcriptional activity during metabolic transition using a bioluminescent reporter in yeast(효모의 생물발광 리포터를 사용한 대사 전이 중 전사 활동 모니터링)

학습하세요 Saccharomyces cerevisiae의 호흡 및 발효 대사를 배치 문화 지수 성장 속도론으로 분석하는 방법을. 고처리량 스크리닝을 통해 다양한 물질이 효모 대사에 미치는 영향을 효율적으로 평가할 수 있습니다.

Saccharomyces cerevisiae 호흡과 발효 대사 분석을 배치 문화 지 수 성장 속도 론

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