주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

크라이오겔화를 사용하여 탄성 3D 거대다공성 마이크로크라이오겔을 제작하는 전반적인 목표는 주사 가능한 재생 요법 및 체외 고처리량 약물 스크리닝을 용이하게 하는 것입니다. 이 동영상은 다목적 3D 미세조직을 제작하고 이를 재생 요법 및 약물 스크리닝에 적용하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 재생 요법 기술은 상처 부위에 주입한 후 줄기 세포 보유, 생존 및 치료 기능을 향상시킵니다.

약물 스크리닝은 또한 사용 편의성과 고처리량 스크리닝의 잠재력으로 인해 개선되었습니다. 일반적으로 3D 문화에 익숙하지 않은 개인은 복잡한 프로토콜 때문에 어려움을 겪습니다. 이 기술은 3D 배양을 단순화하고 연구자가 생성된 3D 미세조직을 더 잘 제어할 수 있도록 합니다.

이러한 절차의 시연을 돕는 것은 우리 연구실의 대학원생 4명인 Zhou Lyu, Liu Wei, Li Yaquian 및 You Zhifeng입니다. PMMA 마이크로 스텐실 어레이 칩을 탈이온수로 세척하여 레이저 조각에 남아 있는 파편을 제거합니다. 그런 다음 마이크로 스텐실 어레이 칩을 섭씨 60도에서 건조시킵니다.

다음으로, 건조된 칩을 플라즈마 클리너에서 4개 그룹으로 처리합니다. 먼저 진공 펌프를 2분 동안 가동합니다. 그런 다음 18와트의 RF 전력을 3분 동안 사용하여 칩의 친수성을 높입니다.

이제 칩 5개당 1밀리리터의 젤라틴 전구체 용액을 만드십시오. 젤라틴을 섭씨 60도의 수조에 녹이고 얼음 위에서 5분 동안 용액을 배양합니다. 약간 냉각되었지만 여전히 액체인 경우 글루타르알데히드를 젤라틴 전구체 용액에 완전히 혼합하여 최종 농도 0.3%글루타르알데히드를 만듭니다.

이제 준비된 용액 200 마이크로 리터를 각 칩의 상부 표면에 피펫으로 넣습니다. 구부러진 유리 막대를 사용하여 칩 위에 용액을 고르게 분배합니다. 다음으로, 용액이 로드된 어레이 칩을 즉시 영하 20도의 냉동고에 16시간 동안 옮겨 동결 겔화합니다.

다음날 동결 건조기를 약 30분에 걸쳐 영하 40도까지 식힙니다. 그런 다음 어레이 칩을 로드하고 진공 상태에서 2시간 동안 동결 건조합니다. 이러한 조건에서 얼음은 승화되고 칩은 사용할 준비가 됩니다.

칩에서 개별 마이크로크라이오겔을 수확하는 것으로 시작합니다. 제작된 PDMS 이젝터 핀 어레이 위에 제작된 마이크로크라이오겔 어레이 칩을 오버레이하는 것으로 시작합니다. 각 마이크로크라이오겔을 이젝터 핀에 맞춥니다.

그런 다음 마이크로크라이오겔 어레이 칩을 어레이에 눌러 마이크로크라이오겔을 웰에서 대체합니다. 이제 분출된 마이크로크라이오겔을 수조에 수확하고 세포 여과기의 도움으로 수집합니다. 하나의 스트레이너를 사용하여 하나의 칩에서 모든 마이크로크라이오겔을 수집합니다.

다음으로, 얼음에서 수소화붕소나트륨이 함유된 마이크로크라이오겔을 세척합니다. 비가교결합 알데히드 잔류물을 약 20분 동안 담금질합니다. 그런 다음 수소화붕소나트륨을 버리고 마이크로크라이오겔을 5밀리리터의 탈이온수로 15분 동안 세척합니다.

계속하기 전에 총 3-5번의 물 세척을 수행하십시오. 마지막 물 세척에서 마이크로 cryogel을 제거한 후 핀셋을 사용하여 세포 여과기에서 35mm 페트리 접시로 옮깁니다. 각 마이크로크라이오겔 컬렉션은 하나의 클러스터를 구성합니다.

이제 각 마이크로크라이오겔 클러스터에 50-70마이크로리터의 탈이온수를 추가하고 접시를 덮습니다. 그런 다음 접시를 부드럽게 두드려 쌓인 마이크로크라이오글의 수평을 맞춥니다. 그런 다음 마이크로크라이오겔을 섭씨 영하 20도에서 4-16시간 동안 동결합니다.

나중에 이전과 같이 2 시간 동안 동결 건조하십시오. 다음 단계는 3D 미세조직을 만드는 것입니다. 먼저 마이크로크라이오겔을 살균합니다.

그런 다음 트립신으로 세포를 수확하고 밀도를 정량화한 다음 성장 배지에서 밀리리터당 800만 개의 세포로 재현탁합니다. 다음으로, 60마이크로리터의 세포 현탁액을 마이크로크라이오겔의 각 클러스터에 피펫팅합니다. 접시를 가습실에 보관하고 세포가 젤에 흡수될 수 있도록 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.

배양 후, 각 접시에 2 밀리리터의 배양 배지를 첨가하고 격일로 배지를 변경하여 배양을 계속합니다. 이틀 후면 3D 미세조직이 형성될 것입니다. 3D 미세조직을 마우스에 주입하려면 먼저 5ml 피펫에 옮긴 다음 세포 스트레이너에 로드하여 배양 배지를 여과합니다.

그런 다음 3D 미세 조직을 15% 젤라틴 용액에 재현탁합니다. 이식을 위해 동물을 준비한 후, 그라실리스 근육의 세 위치에 미세 조직을 근육 주사합니다. 각 주입에는 150마이크로리터의 용액에 150마이크로크라이오겔이 포함되어야 합니다.

23게이지 바늘이 있는 1밀리리터 주사기를 사용하십시오. 온칩 세포 배양을 위해 마이크로크라이오겔 어레이를 조립한 후, 물에 젖지 않도록 예열된 습도 챔버에 조심스럽게 넣습니다. 그런 다음 3마이크로리터의 완전히 혼합된 세포 현탁액을 각 마이크로크라이오겔 웰에 직접 조심스럽게 분취합니다.

용액을 배출하기 전에 피펫 팁이 마이크로 크라이오겔의 표면에 가볍게 닿도록 합니다. 주변 우물에 씨를 뿌리지 마십시오. 웰을 로드한 후 각 웰에 10마이크로리터의 선택적 매체를 추가하고 96채널 액체 디스펜서를 사용하여 증발을 늦추기 위해 주변 웰에 매체를 추가합니다.

그런 다음 습도 챔버에서 칩을 24시간 동안 배양하여 3D 미세 조직을 형성합니다. 다음 날, 96채널 액체 디스펜서를 사용하여 10마이크로리터의 약물을 농도 구배로 각 웰에 4번 첨가하여 DMSO 대조군을 포함한 384웰 모두를 완전히 추가합니다. 그런 다음 24시간 동안 배양을 계속합니다.

약물 처리 24시간 후, 각 웰에 4마이크로리터의 레사주린 스톡 용액을 첨가하고 플레이트를 2시간 동안 배양하여 세포가 레사주린을 대사할 수 있도록 합니다. resazurin의 세포 대사를 분석하려면 플레이트 리더를 사용하십시오. 수확된 젤라틴 마이크로크라이오겔은 사전 정의된 모양과 크기를 가지고 있습니다.

SEM에 의한 분석은 마이크로크라이오겔이 30 내지 80 미크론 범위의 기공 크기를 가진 상호 연결된 거대다공성 구조를 포함하고 있음을 보여주었습니다. 젤라틴 마이크로크라이오겔의 주입 가능성은 주입 후 배양하여 정량적으로 평가되었습니다. 밀리리터당 1, 000을 임상적으로 허용되는 10뉴턴보다 적은 6뉴턴으로 주입했습니다.

마이크로크라이오겔의 줄기세포는 5일간의 배양 기간 동안 주입 후 높은 생존력과 뛰어난 증식 능력을 유지했습니다. 이러한 세포를 이용하여 마우스 사지 허혈 모델을 치료하고, 수술 후 28일 후에 허혈성 사지의 생리학적 상태를 검사하였다. 100, 000 줄기 세포를 사용한 미세 조직 처리로 사지 회수가 개선되었습니다.

28일 후 자발적인 발가락 절단을 보인 쥐는 25%에 불과했습니다. 다른 응용 분야에서는 3D 마이크로조직 어레이가 고처리량 약물 테스트에 사용되었습니다. 간세포암종세포는 독소루비신(doxorubicin)으로, 비소세포폐암세포는 IMMLG-8439로 치료하였다.

두 경우 모두 3D 배양에 의해 약물 내성이 증가했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 체외 고처리량 약물 스크리닝을 위한 주사 재생 요법 또는 온칩 3D 세포 배양 어레이를 사용하여 오프칩 3D 배양을 위한 탄성 3D 미세다공성 마이크로크라이오겔을 제작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 세포 기반 재생 요법 및 약물 스크리닝 분야의 연구자들이 3D 세포 배양을 활용할 수 있는 길을 열어 두 연구 분야를 모두 발전시켰습니다.

글루타르알데히드 및 수소화붕소나트륨으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 보호복을 착용하고 실험실 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.