고해상도 무시 무시 현미경 (HREM) - 유기 재료의 시각화 및 처리를위한 간단하고 강력한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 유기 물질의 디지털 볼륨 데이터를 생성하는 것입니다. 예를 들어 생체 의학 모델 유기체의 배아 및 배아 조직, 피부 또는 근육 생검을 포함하여 성인 동물 및 인간에서 채취한 조직 블록, 코팅되지 않은 종이 및 피부 대체물과 같은 물질이 있습니다. HREM은 의학 및 생물 의학 연구 분야의 근본적인 질문에 답하는 데 도움이 됩니다.

이를 통해 예를 들어 유전자 변형 마우스 배아 또는 조작된 병아리 배아의 장기 및 조직에 대한 3차원 분석 및 시각화가 가능합니다. 또한 암 모델을 분석할 수 있을 뿐만 아니라 인간 또는 동물 조직에서 채취한 생검도 가능합니다. HREM의 주요 장점은 조직학적 품질에 가까운 이미지 스택을 생성하는 간단한 방법을 제공한다는 것입니다.

이 기술의 의미는 동물 모델을 사용하여 상처 치유를 연구하고 인간의 조직 병리를 방적하고 수선하는 것으로 확장됩니다. 이 절차를 시연하는 사람은 BMR Marlene Rodler와 Johannes Gunther입니다. 둘 다 비엔나 의과 대학 해부학 부서 출신입니다.

5 x 5 x 5 입방 밀리리터 이하의 고정 배아 또는 배아 조직으로 시작하십시오. 정착액을 제거하십시오. 그리고 PBS를 추가하십시오.

섭씨 4도에서 24시간 동안 계속 흔들면서 세탁하십시오. 조직이 들어있는 튜브에 70 % 에탄올을 첨가하고 샘플을 섭씨 4도의 회전기에 놓습니다. 2-3 시간 후에 농도가 증가하는 에탄올 용액에서 샘플을 매번 2-3 시간 동안 계속 탈수하십시오.

샘플이 탈수되는 동안 비커에 0.3125ml의 용액 A에 과산화벤조일 0.3125g과 0.1g의 ESN을 추가하여 침투 용액을 준비합니다. ESN과 촉매가 완전히 용해될 때까지 섭씨 4도의 자석 교반 플레이트에서 2-3시간 동안 저어줍니다. 샘플을 침투 용액에 넣습니다.

그리고 섭씨 4도에서 12-24시간 동안 샘플을 흔들거나 회전시킵니다. 임베딩 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 25ml의 새 침투 용액에 1 밀리리터 또는 용액 B를 첨가하십시오.

성형 컵 트레이를 준비한 후 금형의 깊은 구멍을 임베딩 솔루션으로 채웁니다. 숟가락을 사용하여 샘플을 금형으로 옮깁니다. 공기가 갇히지 않도록 샘플이 임베딩 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.

바늘이나 집게를 사용하여 금형 내부의 샘플을 향하게 합니다. 포매ing하는 동안 샘플의 방향을 최적화하고 블록 표면에 정확한 위치를 표시하는 것이 중요합니다. 이러한 방식으로 관심 영역을 작게 유지하고 가능한 가장 높은 배율을 가진 대물렌즈를 사용할 수 있습니다.

임베딩 솔루션이 점성이 되기 시작하자마자 금형 위에 블록 홀더를 놓고 매립 솔루션이 블록 홀더 바닥에서 1-2mm 위로 올라갈 때까지 블록 홀더의 중앙 구멍을 통해 매립 솔루션을 추가합니다. 액상 파라핀 왁스로 덮어 성형 컵 트레이를 밀봉하고 굳을 때까지 기다렸다가 이동합니다. 밀봉된 성형 컵 트레이를 실온에서 하루-이틀 동안 보관하여 블록이 중합을 완료할 수 있도록 합니다.

중합 후 가공의 경우, 중합된 블록이 있는 성형 컵 트레이를 표준 실험실 오븐에 놓고 최소 1-2일 동안 섭씨 70-80도에서 굽습니다. 금형에서 블록을 제거합니다. 그런 다음 백색광을 블록 표면에 비스듬히 유도하여 시야를 식별합니다.

블록 표면의 검은색 마커로 샘플의 그림자를 추적합니다. 표시된 필드로 수지 블록을 장착합니다. view 마이크로톰에 그리고 블록 홀더를 정지 위치로 이동합니다. 디지털 카메라 및 데이터 생성 소프트웨어를 시작하고 라이브 이미지를 획득합니다.

관심 영역을 커버할 수 있는 적절한 배율의 대물렌즈를 선택합니다. 관심 영역이 컴퓨터 화면에 표시된 시야와 일치할 때까지 광학 장치를 위아래로 움직이고 마이크로톰을 측면으로 움직입니다. 샘플의 첫 번째 구조가 보일 때까지 블록을 절단합니다.

마이크로톰을 움직여 광학 장치의 초점면에 블록 표면을 정렬합니다. 0.5에서 5미크론 사이의 단면 두께를 선택합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 소프트웨어를 설정한 후 소프트웨어를 시작하고 데이터 캡처를 시작합니다.

이 HREM 절편 이미지는 배아 9.5일에 수확된 마우스 배아를 통한 시상 단면을 보여줍니다. 이 볼륨으로 렌더링 된 3D 모델은이 배아의 표면을 보여줍니다. 이 이미지는 배아 15.5일에 적출된 쥐 배아의 목의 볼륨 렌더링 모델을 통해 가상 시상 단면을 보여줍니다.

표면 모델은 병아리 배아의 모든 조직을 볼륨 렌더링하여 심혈관 시스템의 광도를 강조하며, 발달 중인 햄버거 해밀턴 스테이지 18(Hamburger Hamilton Stage 18)입니다. 이 이미지는 인간의 신경을 통한 HREM 단면을 보여줍니다. 인레이는 이 이미지의 섹션을 확대합니다.

이 이미지는 돼지 간을 통한 HREM 절편 이미지의 일부를 보여줍니다. 이 이미지는 사람의 엄지 손가락 패드에서 가져온 생검의 볼륨 렌더링 3D 모델을 보여줍니다. 이 이미지는 HREM 데이터를 통해 가상 절제 수술 앞에 있는 피부 동맥, 정맥 및 신경의 표면 렌더링 모델을 보여줍니다.

이 애니메이션은 사람 엄지 패드의 두꺼운 피부의 볼륨 렌더링 모델을 보여줍니다. 역치가 다르기 때문에 혈관, 신경 섬유, 땀샘 및 땀샘의 관과 같은 피부 구조가 다릅니다. HREM을 사용하면 섬유질 재료의 아키텍처를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

이 이미지는 기본 피부 대체 물질의 볼륨 렌더링 모델을 보여줍니다. 이 애니메이션은 피부 대체 재료의 볼륨 렌더링 모델을 보여줍니다. 섬유의 다른 모양과 구경에 주목하십시오.

샘플은 탈수, 침투 및 수지에 포함되어야 하므로 전체 절차는 최대 며칠이 소요될 수 있지만 용액 준비, 용액 교체 등을 위한 2-3시간의 운영 작업만 포함됩니다. 데이터 생성 자체는 HREM 장치에서 완전히 자동화되어 있으며 2-3시간 내에 1,000개의 이미지를 생성할 수 있습니다. 개발 후 HREM은 발달 생물학 분야의 연구자들이 돌연변이 마우스 배아의 표현형을 정확하게 평가할 수 있는 길을 열었습니다.

한 가지 예는 발달 장애의 해독 메커니즘 또는 DMDD 프로젝트로, HREM은 아직 알려지지 않은 세부 사항에서 배아적으로 치명적인 마우스 배아를 표현형으로 사용하는 것입니다. HREM은 인체 조직 샘플의 혈관, 신경 또는 섬유 구조를 검사하기 위한 위치 광학 현미경의 훌륭한 대안이기도 한 것으로 밝혀졌습니다.